檢測轉(zhuǎn)基因蛋白g10-epsps的膠體金速測試紙及其使用法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測轉(zhuǎn)基因蛋白R(shí)1?EPSPS的膠體金速測試紙，包括設(shè)置在底板上的樣品墊、金標(biāo)墊、包被質(zhì)控線和檢測線的硝酸纖維素膜、吸樣墊；所述金標(biāo)墊上涂覆有膠體金標(biāo)記的鼠抗g10?epsps單克隆抗體，所述檢測線為包被有鼠抗g10?epsps單克隆抗體，所述質(zhì)控線為包被有抗鼠IgG二抗。本發(fā)明還公開了上述膠體金速測試紙的使用方法：將速測試紙垂直插入待測樣品中；8～10min后，進(jìn)行觀測；只出現(xiàn)C線，判斷樣品為陰性；同時(shí)出現(xiàn)T線和C線，判定樣品為陽性。采用本發(fā)明的手持式膠體金速測試紙，能夠快速、現(xiàn)場、靈敏地檢測樣品中的轉(zhuǎn)基因蛋白g10?epsps。
【專利說明】
檢測轉(zhuǎn)基因蛋白g1〇-epsps的膠體金速測試紙及其使用法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因蛋白檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測轉(zhuǎn)基因蛋白glO-epsps 的手持式膠體金速測試紙。
【背景技術(shù)】
[0002] 發(fā)明人所在的研究組前期研究了從假單胞桿菌中克隆到抗除草劑的EPSPS基因 物體內(nèi)芳香族氨基酸--色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成過程中的關(guān)鍵性酶;草甘磷是 通過抑制EPSP合成酶的活性而阻斷芳香族氨基酸的合成最終導(dǎo)致受試植物死亡。但是某些 細(xì)菌的EPSP合成酶的活性不被草甘膦所抑制，所以細(xì)菌EPSPS基因的表達(dá)可以使植物免受 除草劑的傷害。將除草劑抗性基因EPSPS轉(zhuǎn)入大豆，旨在培育具抗草甘膦優(yōu)良特性的轉(zhuǎn)基因 大豆，提高大豆生產(chǎn)中的田間除草效果，降低生產(chǎn)成本。
[0003] 該研究組利用從假單胞桿菌中克隆的抗除草劑的EPSPS基因，構(gòu)建了植物組成型 表達(dá)載體PS0Y19,由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，可以為轉(zhuǎn)基因植物提供草甘膦抗性。PS0Y19質(zhì)粒中只 含有1種能在植物細(xì)胞中表達(dá)的基因：細(xì)菌EPSPS，位于CaMV 35S啟動(dòng)子的控制下?？钩輨?基因表達(dá)質(zhì)粒為9557bp。插入序列EPSPS基因全長1321bp，編碼一個(gè)含有440個(gè)氨基酸的多 肽。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，已將EPSPS外源基因轉(zhuǎn)化大豆華春3號(hào)和Jack品種并獲得轉(zhuǎn)EPSPS基 因的抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆材料。
[0004] 目前轉(zhuǎn)基因蛋白的常規(guī)檢測方法是PCR，但是PCR方法對(duì)場地、儀器、技術(shù)人員的要 求比較高，樣本處理復(fù)雜，不適合大量的篩選檢測。有部分轉(zhuǎn)基因蛋白已經(jīng)可以通過速測試 紙和ELISA試劑盒的方法進(jìn)行檢測，但是glO-epsps為一個(gè)新引進(jìn)的轉(zhuǎn)基因蛋白，目前尚無 該方面的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測轉(zhuǎn)基因蛋白glO-epsps的手持式膠體金 速測試紙及其使用法，利用本發(fā)明能夠快速、現(xiàn)場、靈敏地檢測樣品中的轉(zhuǎn)基因蛋白gio-epsps〇
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供以下一種檢測轉(zhuǎn)基因蛋白R(shí)1-EPSPS的膠體金 速測試紙（為手持式膠體金速測試紙），包括設(shè)置在底板上的樣品墊、金標(biāo)墊（即，標(biāo)記墊）、 包被質(zhì)控線和檢測線的硝酸纖維素膜、吸樣墊；所述金標(biāo)墊上涂覆有膠體金標(biāo)記的鼠抗 gl〇-epsps單克隆抗體，所述檢測線為包被有鼠抗gl〇-epsps單克隆抗體，所述質(zhì)控線為包 被有抗鼠IgG二抗(羊抗鼠IgG的二抗）。
[0007] 作為本發(fā)明的膠體金速測試紙的改進(jìn)：
[0008] 鼠抗(特異性鼠抗)gl〇-epsps單克隆抗體為通過用gio-epsps重組蛋白免疫BALB/ c小鼠，然后通過細(xì)胞融合、克隆化篩選制備得到單克隆抗體細(xì)胞株，接著制備小鼠腹水，經(jīng) 過純化得到。
[0009]作為本發(fā)明的膠體金速測試紙的改進(jìn):gio-epsps為將G1中的gio-epsps基因經(jīng)過 優(yōu)化后構(gòu)建入大腸桿菌表達(dá)體系，重組表達(dá)純化得到。
[00?0]作為本發(fā)明的膠體金速測試紙的進(jìn)一步改進(jìn):膠體金標(biāo)記的鼠抗gio-epsps單克 隆抗體的制備法包括以下步驟：
[0011] 1)、制備2〇~3〇nm(較佳為25nm)的膠體金；
[0012] 2)、抗體標(biāo)記：
[0013] 取lml的膠體金，調(diào)節(jié)pH到8 · 0，加入80yg的gio-epsps鼠單克隆抗體（鼠抗gio- epsps 單克隆抗體 ） ， 混合均勾 ，室溫反應(yīng) 30 ~ 50min; 加入 BSA 至終濃度為0 · 1 % (即， 100ml 中 含有〇.lg的BSA)，靜置20~40min;
[0014]然后進(jìn)行標(biāo)記抗體純化，得膠體金標(biāo)記的鼠抗gl〇-epsps單克隆抗體。
[0015]本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因蛋白glO-epsps的手持式膠體金速測試紙的制備方法包括以下步 驟：
[0016] 1)在底板板上從加樣區(qū)開始依次為并排粘貼的玻璃纖維膜（即樣品墊)和固定有 膠體金標(biāo)記抗體的金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊。
[0017] 2)金標(biāo)墊上鼠抗gio-epsps單克隆抗體的涂覆量為5ng-50ng，硝酸纖維素膜上鼠 抗gl〇-epsps單克隆抗體的量為0 · 4yg-l · 2yg。
[0018] 3)試紙條干燥溫度為37°C，時(shí)間為30min。
[0019] 本發(fā)明還同時(shí)提供了上述膠體金速測試紙的使用方法:將速測試紙垂直插入待測 樣品中；
[0020] 8~10min后，進(jìn)行觀測；只出現(xiàn)C線，判斷樣品為陰性；同時(shí)出現(xiàn)T線和C線，判定樣 品為陽性。
[0021] 備注說明:檢測線(T線），質(zhì)控線(C線）。
[0022]本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因蛋白glO-epsps的手持式膠體金速測試紙的具體檢測步驟及原理 如下：
[0023]首先將速測試紙垂直插入檢測樣品中，不超過圖5中的箭頭位置;樣品溶液沿樣品 墊滲透至涂覆有膠體金標(biāo)記的鼠抗gl〇-epsps單克隆抗體的標(biāo)記墊（金標(biāo)墊），如果樣品溶 液中含轉(zhuǎn)基因蛋白gl〇-epsps，那么gl〇-epsps蛋白將與標(biāo)記墊上的鼠抗gl〇-epsps單克隆 抗體結(jié)合，繼續(xù)上行，并與NC膜上的鼠抗gl〇-epsps單克隆抗體結(jié)合，其余未結(jié)合的膠體金 標(biāo)記抗體與NC膜上的羊抗鼠IgG二抗結(jié)合，8-10min后，可于觀察區(qū)中觀察到檢測區(qū)（即，檢 測線）的顏色變化，即出現(xiàn)陽性條帶；如果樣品溶液中不含轉(zhuǎn)基因蛋白glO-epsps，那么檢測 區(qū)則觀察不到陽性條帶。而無論樣品溶液中是否含轉(zhuǎn)基因蛋白glO-epsps，當(dāng)樣品溶液到達(dá) 硝酸纖維素膜時(shí)，金標(biāo)試紙條上的鼠抗gl〇-epsps單克隆抗體均可與控制區(qū)包被的抗鼠IgG 二抗結(jié)合，從而使硝酸纖維素膜上的C線顯色。否則的話，需要重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(此屬于公知常 識(shí))。
[0024]因此，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因蛋白glO-epsps的手持式膠體金速測試紙的結(jié)果判斷規(guī)則為： [0025]陰性結(jié)果(_)，只出現(xiàn)1條C線；
[0026]陽性結(jié)果( + ):同時(shí)出現(xiàn)T線和C線。
[0027]本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因蛋白glO-epsps的手持式膠體金速測試紙的對(duì)葉片、種子和散糧 等復(fù)雜基質(zhì)具有較好的抗干擾效果，可廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因蛋白glO-epsps的快速檢測，具有 以下特有優(yōu)勢(shì)。
[0028] (1)操作簡單，不需要專門的儀器設(shè)備，可方便的于田間等現(xiàn)場直接進(jìn)行檢測。
[0029] (2)檢測時(shí)間短(5-8min);結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，即陰性結(jié)果(-)，只出現(xiàn)1條C線；陽 性( + ):同時(shí)出現(xiàn)T線和C線。
[0030] 本發(fā)明的檢測轉(zhuǎn)基因蛋白gio-epsps的手持式膠體金速測試紙可針對(duì)葉片、種子 和散糧等樣品中轉(zhuǎn)基因蛋白glO-epsps進(jìn)行快速、現(xiàn)場和靈敏的檢測。
【附圖說明】
[0031] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0032] 圖1是SDS-PAGE檢測gl〇-epsps蛋白的表達(dá)；
[0033] 1:誘導(dǎo)前；2:誘導(dǎo)后（約45KD)。
[0034] 圖2是SDS-PAGE檢測gl〇-epsps蛋白的表達(dá)形式；
[0035] 1:上清;2:包涵體;3、全菌。
[0036] 圖3是SDS-PAGE檢測gl〇-epsps蛋白的純化效果；
[0037] 1:250mM咪唑洗脫液;2:150mM咪唑洗脫液；
[0038] 3: lOOmM咪唑洗脫液;4:50mM咪唑洗脫液。
[0039]圖4是SDS-PAGE檢測glO-epsps蛋白的透析效果；
[0040] 1:50mM咪唑洗脫液。
[0041]圖5是本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因蛋白glO-epsps手持式膠體金速測試紙的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0042]其中：
[0043]圖A為測試紙的主視示意圖；
[0044] 圖B為圖A的俯視不意圖；
[0045] 圖C為產(chǎn)品化的測試紙的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0046] 圖D為圖C的側(cè)視不意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0047] 下面結(jié)合附圖并通過【具體實(shí)施方式】來進(jìn)一步說明本發(fā)明專利的技術(shù)方案。
[0048] 實(shí)施例1、EPSPS蛋白的表達(dá)純化
[0049] (1)蛋白的小試表達(dá)
[0050] 1、載體構(gòu)建
[00511根據(jù)蛋白序列（glO-epsps)，合成基因序列，并構(gòu)建入載體pET30a，得到pET30a-EPSPS陽性質(zhì)粒。
[0052] 2、菌種活化：利用EMD Biosciences公司出售的商用的ET表達(dá)載體骨架，構(gòu)建了 glO-epsps-E陽性質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，涂布LB固體培養(yǎng)基(卡那濃度50yg/mL)。次日，挑取 單克隆菌落接入5mL LB液體培養(yǎng)基(卡那濃度50yg/mL)，37°C培養(yǎng)12h-14h。
[0053] 3、小試表達(dá):次日，菌種以l:50(v:v)接入5mL LB液體培養(yǎng)基（卡那濃度50yg/mL)， 37°C培養(yǎng)至0D = 0.4-0.6，吸取lmL菌液離心處理后作為誘導(dǎo)前對(duì)照。4mL菌液加入濃度為 0.8mM的IPTG，25°C誘導(dǎo)表達(dá)6h后菌液8000rpm、4°C離心lmin，收集菌體。SDS-PAGE鑒定蛋白 的形式，結(jié)果顯示（圖1)有明顯目的蛋白的表達(dá)。
[0054] 4、蛋白表達(dá)形式的鑒定:上述表達(dá)的菌體（即，上述步驟所收集的菌體)加入lmL破 碎液進(jìn)行超聲波裂解。裂解條件:溫度冰浴、功率240W、超聲2s、間隔2s、時(shí)間30min。將得到 的全菌離心，12000rpm、4°C離心lmin，收集上清和包涵體。SDS-PAGE鑒定蛋白表達(dá)形式，結(jié) 果顯示（圖2)目的蛋白主要以可溶形式表達(dá)。
[0055] 圖2中的"2:包涵體"即指上文中的沉淀；"3:全菌"即指上文中的離心前的破碎產(chǎn) 物。
[0056] (2)蛋白的大量表達(dá)和純化
[0057] 1、菌種活化：固體平板上挑取pET30a-EPSPS單克隆菌落接入5mL LB液體培養(yǎng)基 (卡那濃度50yg/mL)，37°C培養(yǎng) 12h-14h。
[0058] 2、小試表達(dá)：次日，菌種以1: 50(v: v)接入800mLLB液體培養(yǎng)基（卡那濃度50yg/ mL)，37°C培養(yǎng)至0D = 0.4-0.6，加入濃度為0.8mM的IPTG，25°C誘導(dǎo)表達(dá)6h后菌液8000rpm、4 °C離心15min，收集菌體。
[0059] 3、菌種裂解:加100mL破碎液進(jìn)行超聲波裂解。裂解條件:溫度冰浴、功率240W、超 聲2s、間隔2s、時(shí)間lSmirul^OOOrpnKfC離心15min，收集上清。
[0060] 4、上清純化:收集的上清利用高親和性NI樹脂（即，Ni-NTA親和層析樹脂(鎳柱）） 進(jìn)行純化，分別以50mM、100mM、150mM、200mM咪唑進(jìn)行洗脫；
[00611 收集流穿液、洗脫液。SDS-PAGE檢測純化效果，結(jié)果顯示（圖3) 50mM咪唑洗脫時(shí)蛋 白純度最佳。用50mM，pH = 8.0的Tris-HCl緩沖液將洗脫液中的咪唑透析去除，SDS-PAGE檢 測透析效果，結(jié)果顯示（圖4)蛋白透析后純度和濃度均可行。經(jīng)檢測，最終目的蛋白純度大 于90%，濃度2mg/mL，蛋白量10mg。
[0062] ⑶結(jié)果
[0063] pET30a-EPSPS蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件為：IPTG濃度0.8mM，誘導(dǎo)溫度25°C，誘導(dǎo)時(shí)間6h。 蛋白主要在上清表達(dá)，上清經(jīng)NI柱純化、透析去除咪唑，最終所得gl〇-epsps蛋白：濃度2mg/ mL、純度大于90%、蛋白10mg。
[0064]實(shí)施例2、抗體制備 [0065] (D單抗制備：
[0066] 1、免疫原制備:將表達(dá)純化的蛋白與等體積的弗氏佐劑、Y0UL0NG佐劑混合乳化均 勻，成油包水狀態(tài)，以備免疫小鼠。
[0067] 2、免疫策略:將蛋白免疫4只Balb/c小鼠，皮下免疫3次，間隔4周，最后經(jīng)ELISA檢 測，抗血清效價(jià)如下：
[0069] 3、細(xì)胞融合:最后一次免疫后兩周，腹腔注射抗原（具體為gl〇-epsps蛋白表達(dá)純 化的蛋白）進(jìn)行加強(qiáng)免疫，三天后進(jìn)行細(xì)胞融合。將小鼠斷頸處死，70%乙醇浸泡30min消 毒，在超凈臺(tái)剪開腹腔，取出脾臟，磨碎，過80目篩網(wǎng)，得到脾細(xì)胞，加入SP2/0骨髓瘤細(xì)胞， 在PEG4000的作用下進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0070] 4、融合篩選:將融合好的細(xì)胞鋪進(jìn)96孔板，用HAT培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，三天后換液，改 用HT培養(yǎng)液培養(yǎng)。10天后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測。使用間接ELISA方法進(jìn)行篩選，0D值〉 陰性對(duì)照孔2.1倍的孔判斷為陽性孔。
[0071] 間接ELISA方法主要包括以下步驟：
[0072] 1)、用0.1Μ，ρΗ = 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋表達(dá)純化的蛋白至lug/ml，加入96孔酶 標(biāo)板，每孔l〇〇ul，37°C反應(yīng)3h或者4°C靜置過夜；
[0073] 2)、甩去板孔中液體，加入250ul洗滌緩沖液，靜置30s，甩去板中液體，重復(fù)3次；
[0074] 3)、加入檢測樣本，每孔lOOul，同時(shí)加入陽性對(duì)照（2中所取陽性小鼠血清）、陰性 對(duì)照(免疫前小鼠血清)和空白對(duì)照(不加小鼠血清)37°C反應(yīng)45min;
[0075] 4)、重復(fù)步驟2);
[0076] 5)、加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠酶標(biāo)二抗，每孔100ul，37°C反應(yīng)45min。
[0077] 5、克隆化與建株:使用有限稀釋法對(duì)陽性孔進(jìn)行克隆化，10天后檢測，將陽性克隆 繼續(xù)有限稀釋法進(jìn)行克隆化，直到得到的克隆都為陽性，可建立陽性細(xì)胞株。最終獲得陽性 細(xì)胞株5株。
[0078] 6、擴(kuò)大培養(yǎng):將建株的單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存于液氮中。
[0079] (2)腹水制備與純化
[0080] 1、腹水制備:提前一周在小鼠腹腔注射礦物油，將一定數(shù)量(約106)的細(xì)胞注射入 小鼠腹腔，1 〇天左右收集腹水，4000rpm離心，得上清即為單克隆抗體腹水。
[0081 ] 2、單克隆抗體純化:腹水離心15min(4000rpm，室溫），取上清10ml，在4°C攪拌下逐 滴緩慢加入飽和硫酸銨至半飽和，繼續(xù)攪拌30min，離心30min( 13000rpm，4°C )，棄上清;沉 淀溶于約1 OmlPBS (0.01M，pH7.4);在4 °C攪拌下逐滴緩慢加入飽和硫酸銨至33 %，繼續(xù)攪拌 30min，離心30min( 13000rpm，4°C)，棄上清;沉淀溶于適量10mlPBS(0 · 01M，pH7.4)，4°C透析 過夜，測定抗體含量，_20°C凍存?zhèn)溆?。硫酸銨沉淀后繼續(xù)采用Protein G小柱進(jìn)行純化，新 柱子先用5ml超純水過柱，再用5ml 0.4M PB緩沖液(pH 7.0)平衡純化小柱;抗體過柱，過程 中要求緩慢過柱，以求抗體蛋白更好的結(jié)合在結(jié)合位點(diǎn)上;繼續(xù)l〇ml 0.4M PB緩沖液(pH 7.0)平衡純化小柱;5ml 0.1M甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH 2.7)洗脫結(jié)合位點(diǎn)上的抗體，并在洗 脫液中加入lMTris-HCl(pH 8.0)0.5ml中和甘氨酸，使pH保持為適合抗體保存的中性。 [0082]從而得鼠抗gio-epsps單克隆抗體。
[0083]實(shí)施例3、膠體金標(biāo)記的鼠抗gl〇-epsps單克隆抗體的制備法，具體包括以下步驟： [0084] 1. 25nm膠體金的制備：
[0085] 1.1準(zhǔn)備：將500ml燒杯、20ml小燒杯、轉(zhuǎn)子、棕色瓶、玻璃棒等洗凈后放入酸缸中 (重鉻酸鉀:濃硫酸:超純水= 120g: 200ml :1000ml)浸泡24小時(shí)。取出先用自來水沖洗3-4 次，再用超純水沖洗3-4次，置于37 °C烘箱中烘干備用。
[0086] 1.2 1%HAuC14水溶液的配置:用塑料稱量匙稱取lg氯金酸粉末于棕色瓶中，加入 99ml超純水充分溶解，4 °C避光保存。
[0087]注：氯金酸粉末極易潮解，稱取的時(shí)候要快速，剩余氯金酸粉末用鋁箱袋密封保 存。
[0088] 1.3 1%檸檬酸三鈉水溶液的配置：稱取lg檸檬酸三鈉溶解于99ml超純水中，混 勻。
[0089] 1.4 25nm膠體金的制備:量取99ml超純水于燒杯中，加入lml 1%HAuC14水溶液， 置于恒溫磁力攪拌器上攪拌混勻，開啟加熱至溶液沸騰，迅速加入2.5ml新制備的1%檸檬 酸三鈉水溶液，繼續(xù)攪拌加熱，溶液逐漸變?yōu)樗{(lán)黑色，然后紫黑，再加熱出現(xiàn)紅色，繼續(xù)沸煮 出現(xiàn)透明的橙紅色，繼續(xù)沸煮7-10min，自然冷卻至室溫，加超純水使溶液至100ml。加入一 定的PEG20000至其終濃度為0.02 % -0.05 %。倒入棕色瓶，4°C避光保存。
[0090] 2.抗體標(biāo)記：
[0091] 2.1抗體的標(biāo)記:取lml制取好的膠體金，用1 %的K2C03調(diào)節(jié)PH到8.0，加入80yg上 述純化得到的gl〇-epsps鼠單克隆抗體，混合均勾，室溫反應(yīng)40min。加入BSA至終濃度為 0.1%，靜置30min。
[0092] 2.2標(biāo)記抗體純化:先用低速（1500r/min)離心15分鐘，棄去由凝聚的金膠粒形成 的沉淀。然后用l〇〇〇〇r/min離心30分鐘。仔細(xì)吸出上清，沉淀物用0.1ml含1%BSA的0.1M roS(PH7.4)復(fù)溶，加入5%疊氮鈉至終濃度為0.05%，4°C保存。得膠體金標(biāo)記的鼠抗gl0-epsps單克隆抗體。
[0093]實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因蛋白glO-epsps免疫檢測卡的制作
[0094]在底板7上按照常規(guī)方式并排粘貼樣品墊1和固定有膠體金標(biāo)記的特異性單克隆 抗體的金標(biāo)墊2、醋酸纖維素膜3以及吸樣墊4。在金標(biāo)墊2上固定40ng鼠抗gl〇-epsps單克隆 抗體，在醋酸纖維素膜3上的檢測區(qū)固定0.8yg鼠抗gl〇-epsps單克隆抗體以及在控制區(qū)固 定抗鼠IgG二抗0.4yg(分別作為檢測線5和質(zhì)控線6)。然后置于37°C真空干燥30min。
[0095] 實(shí)施例5、轉(zhuǎn)基因蛋白glO-epsps免疫檢測卡檢測實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)品的效果評(píng)價(jià) [0096] ①樣品杯中加入200yL空白樣品液(pH 7.4,0.2mol/L PBS:8g氯化鈉、3.35g十二 水合磷酸氫二鈉，〇. 2g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，雙蒸水溶解定容至1L)，將速測試紙插入樣 品杯，在室溫條件下反應(yīng)8分鐘后在結(jié)果觀察區(qū)中觀察顯色結(jié)果。結(jié)果表明，觀察區(qū)中T線不 顯色，C線顯色。
[0097] ②樣品杯中加入100yL 0· lμg/ml的gio-epsps標(biāo)準(zhǔn)品（采用同上的PBS溶液稀釋配 成），按照與空白樣品同樣的操作步驟。結(jié)果表明，觀察區(qū)中C線、T線同時(shí)顯色。
[0098] gio-epsps標(biāo)準(zhǔn)品的獲取方法為：
[0099] 大腸桿菌E.coli中原核表達(dá)并通過親和純化的His-EPSPS(實(shí)施例2所得），N端帶 有6個(gè)His標(biāo)簽，其母液濃度為3mg/ml，用稀釋液稀釋到900ng/ml，3mL棕色玻璃瓶加入100yL 900ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品，冷凍干燥機(jī)過夜抽干得到標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉，即為gl〇-epsps標(biāo)準(zhǔn)品。
[0?00]實(shí)施例6、轉(zhuǎn)基因蛋白gl〇-epsps免疫檢測卡檢測實(shí)際葉片樣本的效果評(píng)價(jià)
[0101] ①樣品杯中加入200yL陰性葉片樣本提取液，按照與標(biāo)準(zhǔn)品同樣的操作步驟。結(jié)果 表明，觀察區(qū)中只有控制線C線顯色，檢測線T線不顯色。
[0102] ②樣品杯中加入200yL陽性葉片樣本提取液，按照與陰性樣品同樣的操作步驟。結(jié) 果表明，觀察區(qū)中控制線C線和檢測線T線均顯色。
[0103] 備注說明：
[0104] 1、葉片樣本提取液為0.1M PBS緩沖液，葉片依據(jù)本行業(yè)常規(guī)的方法進(jìn)行提取。
[0105] 2、上述陰性葉片樣本經(jīng)RT-PCR方法確認(rèn)，gio-epsps含量無法檢測到;而陽性葉片 樣本中g(shù)l〇-epsps經(jīng)RT-PCR檢測為陽性。
[0106]實(shí)施例7、轉(zhuǎn)基因蛋白gio-epsps免疫檢測卡檢測實(shí)際種子樣本的效果評(píng)價(jià)
[0107] ①樣品杯中加入200yL陰性種子樣本提取液，按照與標(biāo)品同樣的操作步驟。結(jié)果表 明，觀察區(qū)中只有控制線C線顯色，檢測線T線不顯色。
[0108] ②樣品杯中加入200yL陽性種子樣本提取液，按照與陰性樣品同樣的操作步驟。結(jié) 果表明，觀察區(qū)中控制線C線和檢測線T線均顯色。
[0109] 備注說明：
[0110] 1、種子樣本提取液為0.1M PBS緩沖液。種子依據(jù)本行業(yè)常規(guī)的方法進(jìn)行提取。
[0111] 2、上述陰性種子樣本經(jīng)RT-PCR法和ELISA方法法確認(rèn)，gio-epsps含量無法檢測 到;而陽性種子樣本中g(shù)l〇-epsps經(jīng)RT-PCR檢測為陽性，經(jīng)ELISA方法檢測含量在100-500μ g/ml〇
[0112]實(shí)施例8、轉(zhuǎn)基因蛋白gl〇-epsps免疫檢測卡檢測實(shí)際散糧樣本的效果評(píng)價(jià)
[0113] ①樣品杯中加入200yL陰性散糧樣本提取液，按照與標(biāo)品同樣的操作步驟。結(jié)果表 明，觀察區(qū)中只有控制線C線顯色，檢測線T線不顯色。
[0114] ②陰性散糧樣本中加入0.2%陽性種子樣本，得到陽性散糧樣本，將該樣本進(jìn)行提 取，樣品杯中加入200yL陽性散糧樣本提取液，按照與陰性樣品同樣的操作步驟。結(jié)果表明， 觀察區(qū)中控制線C線和檢測線T線均顯色。
[0115] 備注說明：
[0116] 1、種子樣本提取液為0.1M PBS緩沖液。種子依據(jù)本行業(yè)常規(guī)的方法進(jìn)行提取。
[0117] 2、上述陰性散糧樣本經(jīng)RT-PCR方法（目前已有的檢測法)確認(rèn)，glO-epsps表達(dá)量 無法檢測到;而陽性散糧樣本中g(shù)l〇-epsps含量為經(jīng)RT-PCR檢測為陽性。
[0118] 最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容 直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測轉(zhuǎn)基因蛋白R(shí)1-EPSPS的膠體金速測試紙，包括設(shè)置在底板上的樣品墊、金標(biāo)墊、 包被質(zhì)控線和檢測線的硝酸纖維素膜、吸樣墊;其特征在于:所述金標(biāo)墊上涂覆有膠體金標(biāo) 記的鼠抗gl〇-epsps單克隆抗體，所述檢測線為包被有鼠抗gl〇-epsps單克隆抗體，所述質(zhì) 控線為包被有抗鼠 IgG二抗。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金速測試紙，其特征在于： 鼠抗gl〇-epsps單克隆抗體為通過用gl〇-epsps重組蛋白免疫BALB/c小鼠，然后通過細(xì) 胞融合、克隆化篩選制備得到單克隆抗體細(xì)胞株，接著制備小鼠腹水，經(jīng)過純化得到。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的膠體金速測試紙，其特征在于：gl〇-epsps為將G1中的gl〇-印sps基因經(jīng)過優(yōu)化后構(gòu)建入大腸桿菌表達(dá)體系，重組表達(dá)純化得到。4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的膠體金速測試紙，其特征在于:膠體金標(biāo)記的鼠抗gl〇-epsps單克隆抗體的制備法包括以下步驟： 1) 、制備20~30nm的膠體金； 2) 、抗體標(biāo)記： 取lml的膠體金，調(diào)節(jié)pH到8.0,加入80yg的gl〇-epsps鼠單克隆抗體，混合均勾，室溫反 應(yīng)30~50min;加入BSA至終濃度為0 · 1 %，靜置20~40min; 然后進(jìn)行標(biāo)記抗體純化，得膠體金標(biāo)記的鼠抗gl〇-epsps單克隆抗體。5. 如權(quán)利要求1~4任一所述的膠體金速測試紙的使用方法，其特征在于： 將速測試紙垂直插入待測樣品中； 8~lOmin后，進(jìn)行觀測；只出現(xiàn)C線，判斷樣品為陰性；同時(shí)出現(xiàn)T線和C線，判定樣品為 陽性。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK105866413SQ201610109563
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年2月28日
【發(fā)明人】壽惠霞, 杜娟, 李林, 陸玲鴻, 武愛波, 徐偉
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué), 無錫福陽生物科技有限公司