用于孔雀石綠spr檢測(cè)的膠體金放大分子印跡膜的制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于膠體金信號(hào)放大的分子印跡膜的制備，并以此作為表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)傳感器的識(shí)別元件,用于檢測(cè)孔雀石綠,特別涉及于SPR芯片表面原位合成膠體金-分子印跡膜的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]孔雀石綠(C23H25ClN2)屬于三苯甲烷類(lèi)染料，為具有金屬光澤的結(jié)晶體，極易溶于水，在細(xì)胞分裂時(shí)阻礙蛋白肽的形成，從而產(chǎn)生抗菌殺蟲(chóng)作用，被作為殺菌劑、驅(qū)蟲(chóng)劑，是藥用染料中抗菌效力較強(qiáng)的一類(lèi)。在魚(yú)類(lèi)飼養(yǎng)中一般用于防治水霉病、爛鰓病以及寄生蟲(chóng)病等。研究表明孔雀石綠具有潛在的致癌、致畸和致突變作用，1993年美國(guó)FDA已經(jīng)將其列為優(yōu)先研究的致癌性化學(xué)物質(zhì)。由于孔雀石綠在體內(nèi)代謝緩慢，代謝產(chǎn)物中的無(wú)色孔雀石綠在動(dòng)物體內(nèi)至少一周穩(wěn)定不變，因此美國(guó)、日本以及英國(guó)等許多國(guó)家已禁止將其用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)無(wú)公害食品漁用藥物使用準(zhǔn)則(NY5071-2002)》中也將孔雀石綠列為禁用藥物。但是孔雀石綠在水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗菌效果較好、價(jià)格低廉，仍被部分商販違法使用。近幾年我國(guó)因藥物殘留問(wèn)題導(dǎo)致出口的動(dòng)物性食品屢遭禁運(yùn)，2006年初我國(guó)出口韓國(guó)的鰻魚(yú)由于孔雀石綠檢測(cè)超標(biāo)，使我國(guó)漁業(yè)遭受巨大經(jīng)濟(jì)損失，歐盟等國(guó)家和地區(qū)多次強(qiáng)烈要求我國(guó)政府對(duì)孔雀石綠殘留進(jìn)行監(jiān)控。因此，建立孔雀石綠殘留的檢測(cè)方法十分迫切并具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003]目前孔雀石綠的檢測(cè)方法主要是高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、光譜分析、酶聯(lián)免疫法和電化學(xué)分析等。在這些方法中，液質(zhì)聯(lián)用與酶聯(lián)免疫法較為常用，其中液質(zhì)聯(lián)用靈敏度高效果好，但設(shè)備昂貴，檢測(cè)成本高；而盡管酶聯(lián)免疫法快速、靈敏、特異高，但是所用的抗體制備困難且只在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定。SPR傳感檢測(cè)方法是基于表面等離子體共振原理的光學(xué)方法，通過(guò)其芯片表面敏感識(shí)別元件對(duì)目標(biāo)物的識(shí)別和吸附，產(chǎn)生傳感信號(hào)，達(dá)到實(shí)時(shí)檢測(cè)的目的，具有無(wú)需標(biāo)記、快速、靈敏、對(duì)樣品無(wú)損的優(yōu)勢(shì)，具備開(kāi)發(fā)成一類(lèi)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)的潛在條件。但目前常用的敏感識(shí)別元件為抗體和酶等生物材料，檢測(cè)成本較高且貯存時(shí)間短。分子印跡材料作為一種可以根據(jù)目標(biāo)物分子定制的聚合物材料，可對(duì)目標(biāo)物特異性吸附和分離，被稱(chēng)為“人工抗體”，并且易于制備、成本低、環(huán)境耐受性好。通過(guò)在SPR傳感器芯片表面原位聚合制備分子印跡膜，建立分子印跡-SPR傳感檢測(cè)方法，并通過(guò)加入膠體金實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，其關(guān)鍵步驟是膠體金的制備、分子印跡膜的制備及其在SPR傳感器芯片表面的固定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種在SPR傳感器芯片表面原位聚合含有膠體金的分子印跡薄膜的方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0006]一種在SPR芯片表面熱引發(fā)原位聚合含有膠體金的孔雀石綠分子印跡薄膜的方法，具體步驟如下:
[0007](I)采用硼氫化鈉還原氯金酸的方法，制備表面修飾有MUA的膠體金。(2)將引發(fā)劑和粘附劑溶解于適當(dāng)有機(jī)溶劑中，經(jīng)勻膠儀旋涂至SPR芯片(石英基質(zhì)表面鍍有50nm金膜)表面，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液濃度控制膜厚度；
[0008](3)將經(jīng)步驟(2)修飾的SPR芯片浸入含有模板分子、功能單體和交聯(lián)劑的預(yù)聚合液中，預(yù)聚合液溶劑中混有MUA修飾的膠體金，除氧后60°C引發(fā)聚合16小時(shí)，經(jīng)過(guò)洗脫模板分子，得到原位聚合在SPR芯片表面的分子印跡膜，可選擇性的吸附模板分子，原子力顯微鏡和掃描電鏡表征其形貌。
[0009]所述引發(fā)劑優(yōu)選為偶氮二異丁腈、過(guò)氧化二碳酸二(2-乙基己基)酯、2，2’-偶氮二(2-咪基丙烷)二鹽酸鹽和偶氮二異丁基脒鹽酸鹽。
[0010]所述粘附劑優(yōu)選為聚氯乙烯、氯化聚氯乙烯、聚乙烯。
[0011]所述功能單體優(yōu)選為N-異丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、2-乙烯基吡啶。
[0012]所述交聯(lián)劑優(yōu)選為N，N’ -亞甲基二丙烯酰胺、二乙烯基苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、3，5-二(丙烯酰胺)苯甲酸。
【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1SPR傳感芯片表面原位聚合制備孔雀石綠分子印跡膜示意圖。
[0014]圖2含有膠體金的分子印跡膜吸附孔雀石綠前后信號(hào)放大原理圖，分子印跡顆粒復(fù)合物修飾的SPR傳感器芯片檢測(cè)孔雀石綠圖解(schematic representat1nof AU-MIP / AIBN-coated SPR senor chip for detect1n of analyze, malachitegreen(MG))。
[0015]圖3含有膠體金的孔雀石綠分子印跡膜原子力顯微鏡圖。
[0016]圖4以甲基丙烯酸為功能單體的孔雀石綠分子印跡膜掃描電鏡圖。
[0017]圖5以N-異丙基丙烯酰胺為功能單體，含有膠體金的孔雀石綠分子印跡膜掃描電鏡圖。
[0018]圖6幾種孔雀石綠分子印跡膜吸附孔雀石綠的SPR響應(yīng)曲線(xiàn)。
[0019]圖7含有膠體金的以N-異丙基丙烯酰胺為功能單體的孔雀石綠分子印跡膜對(duì)孔雀石綠的吸附響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)施方式一:SPR傳感器芯片表面原位合成含有膠體金的孔雀石綠分子印跡薄膜各種印跡膜的制備:
[0021](I)向含有3.3g TOAB的400ml甲苯溶液及200ml 15mM的HAuCl4.4H20水溶液的混合溶液中，緩慢滴入10ml含有655mg MUA的甲苯溶液，劇烈攪拌。再向該混合液中逐滴加入新配制的NaBH4水溶液(0.3M，100ml)，繼續(xù)攪拌lh。用去離子水沖洗并分離有機(jī)相，旋蒸去除有機(jī)相溶劑，所得殘留物真空干燥I天，得到的黑色固體以2V / min的速度熱處理30min至155°C。所得產(chǎn)物溶于50ml的甲苯中，再將其逐滴加入800ml氯仿中，過(guò)濾去除過(guò)量的MUA和Τ0ΑΒ，得到膠體金，在室溫干燥后溶于200ml 二甲基亞砜中。
[0022](2)稱(chēng)取20mg引發(fā)劑和2mg粘附劑溶于ImL四氫呋喃中，混和均勻。取100 μ L混合液滴于SPR傳感器芯片表面，在勻膠臺(tái)上旋涂均勻；
[0023](3)稱(chēng)取27mg孔雀石綠與一定比例的功能單體、交聯(lián)劑溶于3.5mL含有膠體金的二甲基亞砜中，制得預(yù)聚合液；(備注:功能單體包括甲基丙烯酸、N-異丙基丙烯酰胺、雙功能單體甲基丙烯酸與N-異丙基丙烯酰胺的摩爾比為(1:2)、雙功能單體甲基丙烯酸與N-異丙基丙烯酰胺的摩爾比為(2:1))
[0024](4)將步驟(3)配置的預(yù)聚合液超聲除氣5min后，通氮?dú)獬?min。將旋涂了引發(fā)劑的SPR芯片浸入預(yù)聚合液中，繼續(xù)通氮5min，密封反應(yīng)容器，于真空干燥箱中60°C聚合16h。聚合完畢后將SPR芯片浸入甲醇:冰乙酸=9:1的混合溶液中洗脫模板分子6h。
[0025]實(shí)施方式二:以含有膠體金的分子印跡膜作為SPR傳感器識(shí)別元件，檢測(cè)水中孔雀石綠
[0026](I)將表面聚合有分子印跡膜的芯片安裝至SPR傳感器(Autolab ESPRIT，荷蘭)，用去離子水穩(wěn)定芯片表面，直至基線(xiàn)穩(wěn)定；
[0027](2)以去離子水作為溶劑和載液，取50 μ L孔雀石綠溶液在芯片表面進(jìn)行吸附反應(yīng)600s，解吸附300s，測(cè)得該濃度孔雀石綠SPR響應(yīng)值。用含ImM HC1、20%乙腈(V / V)的水溶液再生120s，洗脫吸附的孔雀石綠，以此循環(huán)對(duì)0.005-5yg / mL濃度范圍內(nèi)的孔雀石綠溶液進(jìn)行檢測(cè)；
[0028](3)根據(jù)測(cè)得的SPR信號(hào)及相應(yīng)的孔雀石綠濃度，繪制含有膠體金的、以N-異丙基丙烯酰胺為功能單體的分子印跡膜對(duì)孔雀石綠的吸附響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):在0.005-0.25μ g /mL 濃度范圍內(nèi)，y = 0.05053x+2.90427, R2=0.99871 A0.5_5yg / mL 的濃度范圍內(nèi)，y=0.02985x+25.96318，R2=0.99817。最低檢測(cè)限:0.005 μ g / mL，檢測(cè)時(shí)間小于 20min。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種在SPR傳感器芯片表面原位合成分子印跡薄膜的方法，其特征由以下步驟組成: (1)向含有3.3g TOAB的400ml甲苯溶液及200ml 15mM的HAuCl4.4H20水溶液的混合溶液中，緩慢滴入10ml含有655mg MUA的甲苯溶液，劇烈攪拌。再向該混合液中逐滴加入新配制的NaBH4水溶液(0.3M，100ml)，繼續(xù)攪拌lh。用去離子水沖洗并分離有機(jī)相，旋蒸去除有機(jī)相溶劑，所得殘留物真空干燥I天，得到的黑色固體以2V / min的速度熱處理30min至155°C。所得產(chǎn)物溶于50ml的甲苯中，再將其逐滴加入800ml氯仿中，過(guò)濾去除過(guò)量的MUA和Τ0ΑΒ，得到膠體金，在室溫干燥后溶于200ml 二甲基亞砜中。 (2)稱(chēng)取20mg引發(fā)劑和2mg粘附劑溶于ImL四氫呋喃中，混和均勻。取100μ L混合液滴于SPR傳感器芯片表面，在勻膠臺(tái)上旋涂均勻； (3)稱(chēng)取27mg孔雀石綠與一定比例的功能單體、交聯(lián)劑溶于3.5mL含有膠體金的二甲基亞砜中，制得預(yù)聚合液；(備注:功能單體包括甲基丙烯酸、N-異丙基丙烯酰胺、雙功能單體甲基丙烯酸與N-異丙基丙烯酰胺的摩爾比為(1:2)、雙功能單體甲基丙烯酸與N-異丙基丙烯酰胺的摩爾比為(2:1)) (4)將步驟(3)配置的預(yù)聚合液超聲除氣5min后，通氮?dú)獬?min。將旋涂了引發(fā)劑的SPR芯片浸入預(yù)聚合液中，繼續(xù)通氮5min,密封反應(yīng)容器,于真空干燥箱中60 V聚合16h。聚合完畢后將SPR芯片浸入甲醇:冰乙酸=9:1的混合溶液中洗脫模板分子6h。
2.一種基于分子印跡膜作為SPR傳感器識(shí)別元件的檢測(cè)孔雀石綠的方法，其特征由以下步驟組成: (1)將表面聚合有分子印跡膜的芯片安裝至SPR傳感器(AutolabESPRIT，荷蘭)，用去離子水穩(wěn)定芯片表面，直至基線(xiàn)穩(wěn)定； (2)以去離子水作為溶劑和載液，取50μ L孔雀石綠溶液在芯片表面進(jìn)行吸附反應(yīng)600s，解吸附300s，測(cè)得該濃度孔雀石綠SPR響應(yīng)值。用含ImM HC1、20%乙腈(V / V)的水溶液再生120s，洗脫吸附的孔雀石綠，以此循環(huán)對(duì)0.005-5yg / mL濃度范圍內(nèi)的孔雀石綠溶液進(jìn)行檢測(cè)； (3)根據(jù)測(cè)得的SPR信號(hào)及相應(yīng)的孔雀石綠濃度，繪制含有膠體金的、以N-異丙基丙烯酰胺為功能單體的分子印跡膜對(duì)孔雀石綠的吸附響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):在0.005-0.25 μ g /mL 濃度范圍內(nèi)，y=0.05053x+2.90427，R20.99871 ;在 0.5-5 μ g / mL 的濃度范圍內(nèi)，y=0.02985x+25.96318，R2=0.99817。最低檢測(cè)限:0.005 μ g / mL，檢測(cè)時(shí)間小于 20min。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種以含有膠體金的分子印跡膜為SPR識(shí)別元件，快速檢測(cè)孔雀石綠的方法，屬于檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明基于分子印跡與表面等離子體共振傳感聯(lián)用技術(shù)，首先利用粘附劑將引發(fā)劑固定在SPR芯片表面，再浸入預(yù)聚合液中熱引發(fā)聚合，為了放大檢測(cè)信號(hào)，在預(yù)聚合液中加入MUA修飾的膠體金，在SPR芯片表面原位合成分子印跡膜，并以此作為識(shí)別元件，通過(guò)膠體金將信號(hào)放大，建立一種新型的孔雀石綠SPR檢測(cè)方法，該方法具有良好的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。用分子印跡膜替代抗體或酶等生物材料作為傳感器的識(shí)別元件，顯著降低了檢測(cè)成本，提高了傳感器的貯存期和穩(wěn)定性，在農(nóng)藥、獸藥殘留的檢測(cè)應(yīng)用中具有很大的潛力。
【IPC分類(lèi)】G01N21-552
【公開(kāi)號(hào)】CN104634762
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310580918
【發(fā)明人】高志賢, 彭媛, 白家磊, 柳明, 劉原瑗, 孫思明
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所
【公開(kāi)日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2013年11月14日