一種猴早期妊娠檢測的孕酮膠體金免疫層析試紙條的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于動物免疫化學檢測技術領域，具體涉及一種猴早期妊娠檢測的孕酮膠 體金免疫層析試紙條。
【背景技術】
[0002] 猴是一個總稱，靈長目中很多動物被我們稱之為猴，其大腦發(fā)達，是非人靈長類中 最高等的類群，猴一般為單胎動物，極少數(shù)會達到兩個或者三個。獼猴是猴類中最常見的一 種，其代謝特點，生理機能及免疫代謝方面與人類極為相似，其繁殖季節(jié)一般為9月份至次 年的4月份；金絲猴也屬于季節(jié)性繁殖動物，有很明顯的交配高峰，一般在9-12月份，生產 一般在3-5月份。獼猴、金絲猴等猴類均為國家重點保護的野生動物，野外救治和人工繁育 種群數(shù)量較大，對其開展保護和利用，意義重大。繁殖問題是獼猴、金絲猴等等野生動物迀 地保護成敗的關鍵問題之一。在繁殖監(jiān)測技術方面，如今用于猴類妊娠檢測的方法一般為 子宮觸摸、B超檢測和試劑盒檢測等，但是由于子宮觸摸法和B超檢測會對猴類造成較大的 應激，容易造成流產和死亡；利用試劑盒檢測，成本較高，耗時較長，并不是檢測猴繁殖狀態(tài) 的最佳方法。
[0003] 膠體金技術是在70年代初期由Faulk和Taylor創(chuàng)造的，該法經濟節(jié)約，快速簡 便，無需任何儀器，對動物無毒害作用，目前已經廣泛的用于人、牛、豬等的早期妊娠檢測。 尿液中的性激素及性激素代謝物的含量很好的反映了血液中性激素的變化，利用尿液中性 激素及代謝產物的含量也能檢測動物的生理狀態(tài)。孕酮是由卵巢黃體分泌的一種天然孕激 素，是維持妊娠所必需。在懷孕期間，胎盤會大量分泌孕酮，經代謝從尿中排出。研究表明， 金絲猴和獼猴在妊娠一個月時孕酮水平便大幅度增加，故而可以利用尿液中孕酮的含量變 化來檢測猴的早期妊娠。而且本發(fā)明在實施以前，曾試驗用人醫(yī)的現(xiàn)有的早期妊娠檢測試 紙對金絲猴和獼猴的早期妊娠進行檢測，也曾試驗過用現(xiàn)有的牛孕酮檢測試紙條對金絲猴 和獼猴的尿液進行了檢測，但是并不能檢測出金絲猴和獼猴是否早期妊娠的生理狀態(tài)。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于研制一種能快速且無害的檢測猴早期妊娠的孕酮膠體金免疫 層析試紙條，使工作人員能夠快速準確地監(jiān)測掌握猴的繁殖生理狀態(tài)，加強對繁殖期猴的 管理，從而提高猴的繁殖率。
[0005] 本發(fā)明是基于制備得到一種能夠檢測孕酮的單克隆抗體（該單克隆抗體是由雜 交瘤細胞LX20150930分泌的，申請人將該雜交瘤細胞株命名為雜交瘤細胞株LX20150930， 于2015年9月30日送交中國.武漢.武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號 為CCTCCC2015170,通過制備膠體金，標記純化后的抗體，優(yōu)化各項層析條件等完成了本發(fā) 明。
[0006] 本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)：
[0007]-種檢測猴早期妊娠的孕酮膠體金免疫層析試紙條，包含PCV底板，吸收墊、硝 酸纖維素膜、吸水濾紙、金標墊和樣品墊；所述的硝酸纖維素膜上設有檢測線和質控線，所 述吸收墊、硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊依次粘貼在PCV底板上，本發(fā)明的特征在于：所述 的金標墊上含有孕酮單克隆抗體，硝酸纖維素膜的兩端分別是孕酮單克隆抗體金標墊和吸 水濾紙，二者相互交疊組成，同時孕酮單克隆抗體金標墊又與樣品墊交疊組成；
[0008] 能檢測猴早期妊娠的單克隆抗體是由保藏編號為CCTCCNO:C2015170的雜交瘤 細胞株LX20150930分泌的。
[0009] 本發(fā)明猴早期妊娠的孕酮膠體金免疫層析試紙條研制過程包括孕酮試紙條最佳 條件的確定、試紙條的組裝以及試紙條特異性、靈敏度、陽性率的鑒定。
[0010] 本發(fā)明所用的制備猴早期妊娠檢測試紙條的檢測方法屬于競爭法，結果判定當試 紙條出現(xiàn)一條杠判定為妊娠，出現(xiàn)兩條杠判定為未妊娠。
[0011] 本發(fā)明方法簡便，易操作，經濟且省時。
[0012] 進一步，檢測猴早期妊娠的孕酮膠體金免疫層析試紙條包括PCV底板、樣品墊、孕 酮單克隆抗體金標墊，硝酸纖維素膜（NC膜）以及吸水濾紙，其中NC膜上設有一條檢測線 (即T線）和一條質控線（即C線），在所述的NC膜的兩端分別是孕酮單克隆抗體金標墊 和吸水濾紙相互交疊組成，同時孕酮單克隆抗體金標墊又與樣品墊交疊組成。
[0013] 將膠體金顆粒標記到孕酮單克隆抗體上成為本發(fā)明的金標抗體，使其能夠捕獲猴 尿液中的孕酮激素；孕酮與0VA的偶聯(lián)物包被與檢測線（即T線）；羊抗小鼠IGg二抗包 被與對照線。將孕酮膠體金試紙條的樣品墊一端放入猴尿液中，尿液樣品將沿著試紙條移 動，當樣品移動至孕酮單克隆抗體金標墊時，金標抗體會與樣品中的孕酮優(yōu)先結合成復合 物。如果樣品中的孕酮有足夠的量，那么當樣品移動至檢測線時，金標抗體將不會再與檢測 線上的孕酮-0VA偶聯(lián)物結合，故而金標抗體復合物不會在檢測線上滯留，檢測線不呈顯紅 色，只有一條對照線顯色；若樣品中無孕酮或者孕酮含量不足以使金標抗體完全結合，則金 標抗體便會與檢測線上的孕酮-0VA偶聯(lián)物結合使檢測線成紅色，試紙條便會有兩條線顯 色。
[0014] 本發(fā)明的的能檢測孕酮的單克隆抗體是由雜交瘤細胞株LX20150930所分泌的， 該雜交瘤細胞株LX20150930于2015年9月30日送交中國.武漢.武漢大學中國典型培 養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCNO:C2015170。
[0015] 所述的孕酮包被原是購自上海藥巢生物工程有限公司。
[0016] 本發(fā)明的雜交瘤細胞株LX20150930可在制備檢測孕酮的單克隆抗體中應用。
[0017] 本發(fā)明的單克隆抗體可在制備檢測猴早期妊娠的膠體金免疫層析試紙條中應用。
[0018] 本發(fā)明的膠體金免疫層析試紙條可在猴早期妊娠檢測中的應用。
[0019] 申請人提供了一種檢測猴早期妊娠的膠體金免疫層析試紙條的制備方法，包括膠 體金試紙條對尿液進行檢測的步驟。
[0020] 具體操作步驟如下：
[0021] 1、利用上海藥巢生物工程有限公司提供的孕酮免疫原免疫小鼠，經過細胞融合后 獲得保藏編號為CCTCCNO:C2015170的雜交瘤細胞株LX20150930 ;
[0022] 2、復蘇保藏編號為CCTCCNO:C2015170的雜交瘤細胞株LX20150930免疫小鼠得 到腹水，并用辛酸硫酸銨法提純的孕酮單克隆抗體；
[0023] 3、利用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金；同時優(yōu)化標記條件；得到孕酮膠體金免疫 層析試紙條；
[0024] 4、對孕酮膠體金免疫層析試紙條的各項性能進行測定。
[0025] 本發(fā)明的突出效果建立了一種能夠檢測猴早期妊娠的膠體金免疫層析試紙條，并 對其進行的測定，結果表明該試紙條靈敏度高、特異性強，可直接檢測尿液，對猴無傷害。而 早期嘗試使用人的早期妊娠檢測試紙及牛的孕酮檢測試紙條對金絲猴和獼猴的尿液進行 了檢測，并不能檢測出其生理狀態(tài)。
[0026] 更詳細的技術方案如《【具體實施方式】》所述。
【附圖說明】
[0027] 圖1:本發(fā)明的孕酮膠體金免疫層析試紙條的結構及組裝示意圖。
[0028] 圖2:膠體金最佳pH值確定。
[0029] 圖3:本發(fā)明的孕酮膠體金免疫層析試紙條的成品及結果判定圖。
[0030] 圖4:本發(fā)明的猴孕酮膠體金免疫層析試紙條對金絲猴樣本初步檢測結果圖。
[0031] 圖5:本發(fā)明的孕酮膠體金免疫層析試紙條獼對猴重復樣本初步檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0032] 實施例1單克隆抗體的制備與純化
[0033] 1.雜交瘤細胞的制備：取免疫效果較好的小鼠的脾細胞進行細胞融合，融合前三 天對小鼠進行加強免疫，用骨髓瘤細胞與脾細胞混合，經PEG-2000處理后置37°C、5%C02 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。之后根據細胞的生長情況，取細胞培養(yǎng)上清，利用ELISA方法篩選出分 泌孕酮抗體的陽性細胞孔。對篩選出來的陽性細胞孔利用有限稀