一種四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及免疫層析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒及其制備方法。該試劑盒包括第一試紙條和第二試紙條，第一試紙條和第二試紙條均包括塑料板、玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜，硝酸纖維纖維素膜上設(shè)置有檢測線1、檢測線2和控制線，第一試紙條玻璃纖維素膜上包被量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體；第一試紙條的檢測線1上包被腺病毒抗原，檢測線2上包被輪狀病毒抗原；第二試紙條玻璃纖維素膜上包被量子點(diǎn)標(biāo)記的星狀病毒抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記的諾如病毒抗體；第一試紙條的檢測線1上包被星狀病毒抗原，檢測線2上包被諾如病毒抗原。該試劑盒實(shí)現(xiàn)了對腸道病毒進(jìn)行快速、靈敏的聯(lián)合檢測。
【專利說明】
一種四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及免疫層析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]輪狀病毒(rotavimS，RV)是全世界范圍內(nèi)人和動(dòng)物急性腹瀉的主要病原之一，輪狀病毒的生物學(xué)性狀為大小不等的球形，直徑60?80nm，雙層衣殼，無包膜，負(fù)染后在電鏡下觀察，病毒外形呈車輪狀，故名。在糞便中存活數(shù)天到數(shù)周。耐乙醚、酸、堿和反復(fù)凍融，PH適應(yīng)范圍廣(pH3.5?10)。在室溫下相對穩(wěn)定，55°C30分鐘可被滅活。基因組及其編碼的蛋白質(zhì)為雙鏈RNA病毒，約18550bp，由11個(gè)基因片段組成。每個(gè)片段含一個(gè)開放讀碼框架，分別編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(￥?1、￥?2、￥?3、￥?4、￥?6、￥?7)和5個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(略？1?略?5)，非結(jié)構(gòu)蛋白為病毒酶或調(diào)節(jié)蛋白，在病毒復(fù)制中起主要作用。VP6位于內(nèi)衣殼，為組和亞組特異性抗原;VP4和VP7位于外衣殼，VP7為糖蛋白，是中和抗原，決定病毒血清型，VP4為病毒的血凝素，亦為重要的中和抗原，VPl?VP3位于核心。根據(jù)VP6的抗原性，目前將其分為A?G 7個(gè)組，A組輪狀病毒根據(jù)VP6又分為4個(gè)亞組(1、I1、I+I1、非I非II)。另外A組根據(jù)表面中和抗原VP7和VP4分14個(gè)G血清型(VP7為糖蛋白)和19個(gè)P血清型(VP4為蛋白)。其中，A?C組輪狀病毒能引起人類和動(dòng)物腹瀉，D?G組只引起動(dòng)物腹瀉。
[0003]A組RV最為常見，是秋冬季嬰幼兒腹瀉的最重要病原，在發(fā)展中國家，每年約有87萬兒童死于輪狀病毒感染。主要流行的血清型為G1P8、G2P4、G3P8和G4P8，是引起6個(gè)月?2歲嬰幼兒嚴(yán)重胃腸炎的主要病原體占病毒性胃腸炎的80%以上，是導(dǎo)致嬰幼兒死亡的主要原因之一。年長兒童和成人常呈無癥狀感染。傳染源是病人和無癥狀帶毒者，病人每克糞便中排出的病毒體可達(dá)1010個(gè)，糞-口是主要的傳播途徑。病毒還可能通過呼吸道傳播，從有呼吸道癥狀兒童的呼吸道分泌物中曾檢出輪狀病毒的存在，在動(dòng)物中已證明氣溶膠可傳播病毒。溫帶地區(qū)晚秋和冬季是疾病發(fā)生的主要季節(jié)。
[0004]病毒侵入人體后在小腸粘膜絨毛細(xì)胞內(nèi)增殖，病毒基因產(chǎn)物VP4為主要致病因子，造成細(xì)胞溶解死亡，微絨毛萎縮、變短、脫落;腺窩細(xì)胞增生、分泌增多，導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉，水和電解質(zhì)的喪失。潛伏期為24?48小時(shí)，突然發(fā)病，發(fā)熱、水樣腹瀉、嘔吐和脫水，一般為自限性，可完全恢復(fù)。但當(dāng)嬰兒營養(yǎng)不良或已有脫水，若不及時(shí)治療，是導(dǎo)致嬰兒死亡的主要原因。
[0005]B組RV由我國洪濤等發(fā)現(xiàn)，主要感染青壯年，B組病毒可在年長兒童和成人中產(chǎn)生暴發(fā)流行，但至今僅在我國有過報(bào)道。1982?1983年，該組病毒在我國東北，西北礦區(qū)青壯年工人中引發(fā)了大規(guī)?；魜y樣腹瀉流行，患者達(dá)數(shù)十萬人;C組RV主要感染青少年，主要引起散發(fā)流行，對人的致病性類似A組，但發(fā)病率很低。
[0006]輪狀病毒感染后機(jī)體可產(chǎn)生型特異性抗體IgM和IgG，對同型病毒有保護(hù)作用，特別是腸道slgA。對異型只有部分保護(hù)作用，細(xì)胞免疫亦有交叉保護(hù)作用。A組RV血清型眾多，VP6蛋白是其主要的組特異性抗原，有較強(qiáng)的抗原性和免疫原性，可誘導(dǎo)保護(hù)性免疫.有研究表明，VP6蛋白的IgA mAb對RV感染具有免疫保護(hù)作用，肌注免疫VP6DNA疫苗可產(chǎn)生較好的異源保護(hù)作用。輪狀病毒(rotavirus’RV)是引起全世界嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉的重要病原，RV危害嚴(yán)重且無有效的治療手段，根除RV感染的惟一途徑是發(fā)展安全、有效的疫苗，這已成為一個(gè)全球性的公共醫(yī)療目標(biāo)，是一項(xiàng)十分迫切而必要的工作
[0007]目前國內(nèi)雖然已經(jīng)研發(fā)了RV疫苗，但其效果還需要觀察，因此RV的預(yù)防控制還將是公共衛(wèi)生工作的長期任務(wù)，這一工作的開展離不開快速、準(zhǔn)確的RV實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)。
[0008]腺病毒(adenovirus)是一種沒有包膜的直徑為70?90nm的顆粒，由252個(gè)殼粒呈廿面體排列構(gòu)成。衣殼里是線狀雙鏈DNA分子，腺病毒分兩個(gè)屬，共約100余血清型。一般會(huì)造成呼吸系統(tǒng)的不適，對嚙齒類動(dòng)物有致癌能力，或能轉(zhuǎn)化體外培養(yǎng)的嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞，但對人體不出現(xiàn)致癌性。人體腺病毒已知有52種，分別命名為adl?ad52，研究得最詳細(xì)是ad2。腺病毒基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA，已知的轉(zhuǎn)錄單位至少有5個(gè):EI區(qū)位于病毒基因組左側(cè)，可再分成EIA和EIB，與細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān);ΕΠ區(qū)編碼DNA結(jié)合蛋白，參與病毒的復(fù)制;ΕΙΠ區(qū)編碼出現(xiàn)在宿主細(xì)胞表面的一種糖蛋白；EIV區(qū)位于ad2基因組右端，受ΕΠ區(qū)編碼的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)調(diào)控;第5個(gè)轉(zhuǎn)錄單位在病毒感染中期合成ad2蛋白質(zhì)IV。
[0009]腺病毒對嚙齒類動(dòng)物有致癌能力，或能轉(zhuǎn)化體外培養(yǎng)的嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞。使細(xì)胞轉(zhuǎn)化只需要腺病毒基因組的一部分，這些基因位于基因組的左端，約占整個(gè)基因組的7%?10%。盡管腺病毒分布很廣，但對人體不出現(xiàn)致癌性。人體細(xì)胞是一類允許細(xì)胞(permissive cell)，即這類細(xì)胞允許感染入侵的病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，最后細(xì)胞裂解死亡而釋放出大量子代病毒。在體外培養(yǎng)的多種人體腫瘤細(xì)胞中均未查出腺病毒顆粒，但在人的I號(hào)染色體上有adl2的整合位點(diǎn)，這意味著人體細(xì)胞對于腺病毒也可能是非允許細(xì)胞，即這類細(xì)胞在病毒感染后，病毒不能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，但可整合在受感染細(xì)胞的基因組內(nèi)。這些細(xì)胞被病毒轉(zhuǎn)化，表型發(fā)生改變，且可在體外無限期地培養(yǎng)傳代。
[0010]腺病毒是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，基因組長約25-45kb，理論上可編碼22-40個(gè)基因。衣殼(capsid)呈規(guī)則的20面體結(jié)構(gòu)，直徑約80-110nm。衣殼含有240個(gè)六聯(lián)體(1^1011)、12個(gè)五聯(lián)體(卩6111:011)及12根纖毛(;1^;^61.)，除此之外還有其他一些小蛋白，如V1、VII1、IX、IIIa和IVa2等。六聯(lián)體是形成病毒衣殼20個(gè)三角形面的主要蛋白，12個(gè)頂端是5個(gè)五聯(lián)體亞單位和3個(gè)纖毛蛋白構(gòu)成的復(fù)合物，12根纖毛以五聯(lián)體蛋白為基底由衣殼表面伸出，纖毛頂端形成頭節(jié)區(qū)(knob)。五聯(lián)體和纖毛的頭節(jié)區(qū)可與細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合，在病毒感染細(xì)胞過程中起著非常重要的作用。
[00?1 ] 腺病毒含13%DNA和87%的蛋白質(zhì)，病毒體分子量約為175 X 106。病毒基因組為線狀雙鏈DNA，大約含35kb?36kb，腺病毒12、18和31型的0嫩組成中，6+0 mol%最低(48%?49%)，屬于對動(dòng)物具有高致癌性基因型。腺病毒1、2、4、5、8等型的G+C mol%較高(61%)，致癌性反而低或無。這是一種用于人腺病毒分離株的分組的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)其基因同源性將人腺病毒分為A?F等6組。
[0012]腺病毒的基因組以線性的雙鏈DNA形式存在，由蛋白VII和一種稱為mu的小蛋白緊密地環(huán)繞在其周圍，起到類組蛋白樣的作用。另一種蛋白V將這種DNA-蛋白復(fù)合物連接起來，并通過蛋白VI與病毒衣殼連接在一起。在兩條鏈的5'端各以共價(jià)鍵結(jié)合著一個(gè)被稱為DNA末端蛋白(pTP)復(fù)合物(DNA-TPC)的特化的結(jié)構(gòu)，與腺病毒復(fù)制密切相關(guān)。腺病毒基因組的兩端各有一段10bp的反向末端重復(fù)序列(ITR)，是復(fù)制的起始位點(diǎn)。在左端ITR的3'側(cè)有一段長約300bp的包裝信號(hào)(Φ)介導(dǎo)腺病毒基因組包裝入病毒衣殼。對腺病毒而言，只有包括兩端的ITR和包裝信號(hào)(Φ)的約0.5kb的序列是順式作用元件，也就是說必須由腺病毒載體自身攜帶，而其他的30余種蛋白都可以通過輔助病毒(或細(xì)胞)反式補(bǔ)足。病毒蛋白約11種(TP和PI?PX)，其中有4種蛋白(病毒多肽PV、PVD，末端蛋白TP、酶蛋白PX)與病毒基因構(gòu)成病毒核心，多肽PVD是主要的核心蛋白，如同組蛋白一樣包裹病毒基因DNA。構(gòu)成病毒衣殼的蛋白質(zhì)約7種。多肽ΡΠ是病毒衣殼中最豐富和最主要成分，六鄰體是由3個(gè)ΡΠ分子緊密相連組成。多肽ΡΥΚΡΥΠΙ在六鄰體與病毒核心之間形成連接橋，并與多肽PK—起穩(wěn)定著六鄰體分子的晶格排列。5個(gè)分子多肽Pm相連構(gòu)成五鄰體的基座蛋白，Pma為五鄰體的周圍蛋白，也參與衣殼的組成，五鄰體通過PV與病毒核心相連。多肽PIV主要構(gòu)成病毒三聚體纖突，纖突與病毒血凝活性相關(guān)，因血凝素(纖突)具有型特異性，常用血凝抑制試驗(yàn)(HI)對臨床分離株進(jìn)行分型。
[0013]腺病毒對呼吸道、胃腸道、尿道和膀胱、眼、肝臟等均可感染，人腺病毒約1/3的已知血清型通常與人類疾病相關(guān)，但一種血清型可引起不同的臨床疾患；相反，不同血清型也可引起同一種疾患。許多腺病毒在腸道細(xì)胞中復(fù)制，隨糞便排出，但大多血清型與胃腸道疾病無關(guān)。而40型和41型腺病毒可引起嬰幼兒與年少(4歲以下)兒童的胃腸炎，致腹痛、腹瀉。C組腺病毒能引起某些嬰幼J L腸套疊。
[0014]腺病毒11、12型能引起兒童急性出血性膀胱炎，尿中出現(xiàn)病毒。37型可引起女性宮頸炎和男性尿道炎，常由性傳播感染。在免疫功能低下者可引起偶發(fā)或嚴(yán)重的病毒感染，尤其在器官移植病人中發(fā)生嚴(yán)重呼吸道感染和病毒性肝炎，多由1、5和7型腺病毒引起。艾滋病患者可感染多種血清型腺病毒，并能出現(xiàn)抗原性介于中間的雜合型毒株，而且常為致死性腺病毒感染。主要原因是腺病毒的ElA蛋白可反式激活HIV的轉(zhuǎn)錄，加速HIV的復(fù)制。臨床發(fā)現(xiàn)37%的艾滋病患者病毒性腹瀉是由腺病毒所致。
[0015]與絕大多數(shù)呼吸道感染的病原相比，機(jī)體對腺病毒的再感染能產(chǎn)生有效的免疫。起保護(hù)作用的是體內(nèi)產(chǎn)生的循環(huán)中和抗體。正常的健康成人一般也具有多型的抗體。約40 %?60 %的6?15歲的人具有1、2和5型中和抗體，但3、4和7型抗體很少。母親的抗體能保護(hù)嬰兒免除嚴(yán)重的腺病毒呼吸道感染。腺病毒的生活周期可以分為兩個(gè)截然不同卻又不能割裂開來的兩個(gè)階段。第一階段包括腺病毒顆粒粘附和進(jìn)入宿主細(xì)胞，將基因組釋放到宿主細(xì)胞核中，以及有選擇性地轉(zhuǎn)錄和翻譯早期基因。在這個(gè)階段，細(xì)胞為病毒基因組復(fù)制和腺病毒晚期基因表達(dá)并最終釋放成熟的感染顆粒，即第二階段，作好了準(zhǔn)備。第一階段將在6?8個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，第二階段則更快，只需4?6個(gè)小時(shí)。
[0016]星狀病毒，是一種感染哺乳動(dòng)物及鳥類的病毒。人星狀病毒于1975年從腹瀉嬰兒糞便中分離得到，球形，直徑28-35nm，無包膜，電鏡下表面結(jié)構(gòu)呈星形，有5?6個(gè)角。核酸為單正鏈RNA,7.0kb,兩端為非編碼區(qū)，中間有三個(gè)重疊的開放讀碼框架。該病毒呈世界性分布，糞-口傳播，是引起嬰幼兒、老年人及免疫功能低下者急性病毒性腸炎的重要病原之一，其致病性已日益受到重視，人類感染腺病毒主要癥狀是嚴(yán)重腹瀉，伴隨發(fā)熱、惡心、嘔吐。本病為自愈性疾病，大部分患者在出現(xiàn)癥狀2-3天時(shí)，癥狀會(huì)逐漸減輕，但也有極少數(shù)癥狀加重，造成脫水。
[0017]諾如病毒(Norovirus，NV)，又稱為諾羅病毒、諾沃克病毒或膿融病毒，是一種引起非細(xì)菌性急性胃腸炎的病毒。直徑約為26?35nm，無包膜，表面粗糙，球形，呈二十面體對稱;從急性胃腸炎病人的糞便中分離，不能在細(xì)胞或組織中培養(yǎng)，也沒有合適的動(dòng)物模型；基因組為單股正鏈RNA;在氯化銫密度梯度中的浮力密度為1.36?1.41g/cm3;電鏡下缺乏顯著的形態(tài)學(xué)特征，負(fù)染色電鏡照片顯示，NV是具有典型的羽狀外緣，表面有凹痕的小圓狀結(jié)構(gòu)病毒。諾如病毒基因組全長約7.7kb，包含3個(gè)開放閱讀框(Open readding frames ,ORFs) C3ORFl編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包括RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)；0RF2和0RF3分別編碼主要(VPl)和次要(VP2)衣殼蛋白。VPl蛋白結(jié)構(gòu)上可分為S和P區(qū)兩個(gè)相鄰的區(qū)域，其中S區(qū)形成內(nèi)殼，構(gòu)成VPl的底座;P區(qū)形成拱樣結(jié)構(gòu)突出于內(nèi)殼外。P區(qū)可進(jìn)一步分為Pl和P2兩個(gè)亞區(qū)，后者位于VPl的最外層，高度變異，目前認(rèn)為是免疫識(shí)別和受體結(jié)合的關(guān)鍵部位。0RF1/0RF2的重組及P2區(qū)的變異大大豐富了NV的遺傳多樣性。根據(jù)VPl序列的同源性，諾如病毒可分為GI?GV五個(gè)基因群(Genogroup)，其中引起人類感染的主要是GI和GII群，基因群可進(jìn)一步分為不同的基因型(Genotype)。自1995?1996年諾如病毒首次導(dǎo)致世界性大流行以來，GII群中的第4基因型GI1.4，一直在世界范圍內(nèi)的流行中占據(jù)主導(dǎo)地位，且?guī)缀趺扛魞伞⑷?，GI1.4便會(huì)引發(fā)一次大范圍流行，同時(shí)出現(xiàn)一種新的變異株。
[0018]諾如病毒的特征是感染人口密度較高和衛(wèi)生環(huán)境差的地方，如郵輪。諾如病毒是由糞便、口水傳染，人若吃了被感染的蚌類也會(huì)感染。諾如病毒感染性腹瀉是由諾如病毒屬病毒引起的腹瀉，具有發(fā)病急、傳播速度快、涉及范圍廣等特點(diǎn)，是引起非細(xì)菌性腹瀉暴發(fā)的主要病因。諾如病毒感染性強(qiáng)，以腸道傳播為主，可通過污染的水源、食物、物品、空氣等傳播，常在社區(qū)、學(xué)校、餐館、醫(yī)院、托兒所、孤老院及軍隊(duì)等處引起集體暴發(fā)。諾如病毒遺傳高度變異，在同一時(shí)期和同一社區(qū)內(nèi)可能存在遺傳特性不同的毒株流行。諾如病毒抗體沒有顯著的保護(hù)作用，尤其是沒有長期免疫保護(hù)作用，極易造成反復(fù)感染。諾如病毒遺傳高度變異，在同一時(shí)期和同一社區(qū)內(nèi)可能存在遺傳特性不同的毒株流行。諾如病毒抗體沒有顯著的保護(hù)作用，尤其是沒有長期免疫保護(hù)作用，極易造成反復(fù)感染。
[0019]因此，實(shí)現(xiàn)對腺病毒、輪狀病毒、星狀病毒、諾如病毒的同時(shí)聯(lián)合檢測，對于臨床腸道腹瀉疾病的診斷和治療具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡便、成本低的四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒，實(shí)現(xiàn)對腺病毒、輪狀病毒、星狀病毒、諾如病毒的同時(shí)聯(lián)合檢測。
[0021]本發(fā)明的目的還在于提供一種四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒的制備方法。
[0022]為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0023]—種四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒，包括具有兩個(gè)檢視窗口的殼體，所述殼體內(nèi)放置有第一試紙條和第二試紙條，所述第一試紙條和第二試紙條均包括塑料板、設(shè)置在塑料板上的玻璃纖維素膜、設(shè)置在玻璃纖維素膜上的硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上一端設(shè)有樣本墊，對應(yīng)的另一端設(shè)有吸水墊，所述硝酸纖維纖維素膜上設(shè)置有檢測線1、檢測線2和控制線，所述第一試紙條的玻璃纖維素膜上包被有量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體的混合物;所述第一試紙條的檢測線I上包被有腺病毒抗原，檢測線2上包被有輪狀病毒抗原;所述第二試紙條的玻璃纖維素膜上包被有量子點(diǎn)標(biāo)記的星狀病毒抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記的諾如病毒抗體混合物;所述第一試紙條的檢測線I上包被有星狀病毒抗原，檢測線2上包被有諾如病毒抗原;所述第一試紙條和第二試紙條控制線上均包被有羊抗鼠IgG。
[0024]所述第一試紙條玻璃纖維素膜上包被的量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體混合物中量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體質(zhì)量比為1:1;所述第二試紙條玻璃纖維膜上包被的量子點(diǎn)標(biāo)記的星狀病毒抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記的諾如病毒抗體混合物中量子點(diǎn)標(biāo)記的星狀病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的諾如病毒抗體的質(zhì)量比為1:1o
[0025]所述量子點(diǎn)為砸化鎘或硫化鎘量子點(diǎn)。
[0026]所述硝酸纖維素膜上設(shè)置的檢測線I與檢測線2之間、檢測線2與檢測線3之間、檢測線I與控制線之間的間隔均不小于5mm。
[0027]上述四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒的制備方法，包括以下操作步驟:
[0028]第一、制備第一試紙條:
[0029]I)原材料的制備:
[0030]A:制備玻璃纖維素膜:將量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體混合包被在玻璃纖維素膜上，干燥，備用；
[0031]B:制備硝酸纖維素膜:取硝酸纖維素膜，間隔劃分出檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線，然后將腺病毒抗原、輪狀病毒抗原、羊抗鼠IgG分別包被在硝酸纖維素膜的檢測線
1、檢測線2和控制線上，之后將包被后的硝酸纖維素膜放入封閉液中封閉，干燥，備用；
[0032]2)組裝:在塑料板上放置步驟I)制備的玻璃纖維素模，然后在步驟I)制備的玻璃纖維素膜上放置步驟I)制備的硝酸纖維素膜，然后在硝酸纖維素的一端放置樣品墊，對應(yīng)的另一端放置吸水墊，干燥，即的第一試紙條；
[0033]第二、按照上述第一試紙條同樣的制備方法制備第二試紙條；
[0034]第三、將制備的第一試紙條和第二試紙條對應(yīng)放置在具有兩個(gè)檢視窗口的殼體內(nèi)，即完成。
[0035]步驟A中還包括首先制備量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體的混合物，具體方法包括以下操作步驟:
[0036]a:在膠乳顆粒懸濁液中加入改性環(huán)糊精，混勻24小時(shí)，純化，得改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液；
[0037]b:在步驟a制備的改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入量子點(diǎn)，混勻24小時(shí)，純化，得量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸池液；
[0038]c:在步驟b制備的量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入活化劑，活化15分鐘，純化，之后加入腺病毒抗體，混勻2?4小時(shí)后，離心得沉淀物顆粒，將沉淀物顆粒用封閉液重懸，室溫混勻I小時(shí)，之后再進(jìn)行純化，即得量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體；
[0039]d:按照上述步驟a?c同樣的方法制備量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體，然后將量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體混合，備用；
[0040]所述改性環(huán)糊精為羧甲基化改性環(huán)糊精或氨基化改性環(huán)糊精。
[0041]所述活化劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽。
[0042 ]步驟B中所用的封閉液為牛血清白蛋白溶液。
[0043]步驟c中所述量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液與活化劑的質(zhì)量比為I: 10。
[0044]步驟c中所用的封閉液為牛血清白蛋白溶液。
[0045]步驟a中所述改性環(huán)糊精與膠乳顆粒的質(zhì)量比為20:1;步驟b中所述量子點(diǎn)與環(huán)糊精-乳膠復(fù)合物的質(zhì)量比為10:1;步驟c中所述腺病毒抗體與量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物的質(zhì)量比為1:20。
[0046]步驟a中膠乳顆粒使用前進(jìn)行純化處理，所述純化處理的具體方法為:取膠乳顆粒加入第一緩沖液中，離心分離，棄去上清，再用第一緩沖液重懸沉淀物顆粒，然后再離心分離，棄去上清，再用第一緩沖液重懸沉淀物顆粒，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0047]上述純化后的膠乳顆粒在使用時(shí)取膠乳顆粒，采用第二緩沖液將膠乳顆粒稀釋成濃度為10mg/ml。
[0048]上述步驟b中還包括首先將步驟a中制備的改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液，采用第二緩沖液稀釋成濃度為10mg/ml的懸濁液，然后再加入量子點(diǎn)。
[0049]上述步驟c中還包括首先將步驟b中制備的量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液，采用第二緩沖液稀釋成濃度為10mg/ml的懸濁液，然后再加入活化劑活化。
[°°50] 步驟c中所述封閉后進(jìn)行純化的具體方法為:8000rpm條件下離心15min，棄去上清，沉淀復(fù)溶于分散液中。
[0051]步驟A中將量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體混合包被在玻璃纖維素膜上的具體方法為:將將量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體混合物均勻噴涂于玻璃纖維素膜上。
[0052]步驟a和步驟b中所述純化的具體方法為:8000rpm條件下離心，棄去上清，沉淀用第一緩沖液進(jìn)行重懸，之后在SOOOrpm條件下離心，棄去上清，沉淀復(fù)溶于第一緩沖液中。
[0053]步驟c中活化后純化的具體方法為:8000rpm條件下離心棄去上清，沉淀用第一緩沖液進(jìn)行重懸。
[0054]步驟B中將腺病毒抗原、輪狀病毒抗原、羊抗鼠IgG分別包被在硝酸纖維素膜的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上的具體方法為:分別取濃度均為lmg/ml的腺病毒抗原、輪狀病毒抗原和羊抗鼠IgG，以lul/cm，1cm/秒的速度分別噴涂到硝酸纖維的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上。
[0055]步驟I)和步驟2)中所述的干燥為37°C干燥3?5小時(shí)。
[0056]上述第一緩沖液為0.02M，pH7.4的I3B緩沖液。上述第二緩沖液為0.02M，pH6.1的
MES緩沖液。
[0057]上述四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒在使用時(shí)，將待測樣品加入試紙條的樣品墊上，玻璃纖維素膜上的量子化標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的星狀病毒、量子點(diǎn)標(biāo)記的諾如病毒抗體首先特異性的捕捉到待測樣品中的腺病毒、輪狀病毒、星狀病毒和諾如病毒，然后在達(dá)到第一試紙條檢測線2時(shí)，量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體-輪狀病毒結(jié)合物與檢測線2上的輪狀病毒抗原特異性結(jié)合;在第一試紙條檢測線I時(shí)，量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體-腺病毒結(jié)合物與檢測線I上的腺病毒抗原特異性結(jié)合;在第一試紙條檢測線2時(shí)，量子點(diǎn)標(biāo)記的諾如病毒抗體-諾如病毒結(jié)合物與檢測線2上的諾如病毒抗原特異性結(jié)合，在第一試紙條檢測線I時(shí)，量子點(diǎn)標(biāo)記的星狀病毒抗體-星狀病毒結(jié)合物與檢測線I上的星狀病毒抗原特異性結(jié)合。之后通過檢測第一試紙條和第二試紙條檢測線1、檢測線2上結(jié)合的量子點(diǎn)的熒光效應(yīng)，定性的測得腺病毒、輪狀病毒、星狀病毒和諾如病毒的陽性率，為腸道疾病的診斷提供依據(jù)。
[0058]本發(fā)明四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒，以量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的星狀病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的諾如病毒抗體包被在玻璃纖維素膜上，作為檢測探針，利用間接法原理結(jié)合量子點(diǎn)的熒光特性實(shí)現(xiàn)了采用熒光免疫層析的方法對腺病毒、輪狀病毒、星狀病毒、諾如病毒進(jìn)行快速、特異、簡便、靈敏的聯(lián)合檢測。本發(fā)明四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒檢測線低，檢測靈敏度高。
[0059]本發(fā)明四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒的制備方法，操作簡便，易于控制，適于工業(yè)化推廣應(yīng)用。
[0060]進(jìn)一步優(yōu)選的，本發(fā)明制備方法中，創(chuàng)新量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)，采用羧甲基化或氨基化改性的環(huán)糊精修飾量子點(diǎn)，然后將腺病毒抗體、輪狀病毒抗體、星狀病毒抗體、諾如病毒抗體分別結(jié)合在改性環(huán)糊精的羧基基團(tuán)或氨基基團(tuán)上，實(shí)現(xiàn)制備獲得量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的星狀病毒、量子點(diǎn)標(biāo)記的諾如病毒。
【具體實(shí)施方式】
[0061 ]下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0062]實(shí)施例1
[0063]—種四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒，包括具有兩個(gè)檢視窗口的殼體，所述殼體內(nèi)放置有第一試紙條和第二試紙條，所述第一試紙條和第二試紙條均包括塑料板、設(shè)置在塑料板上的玻璃纖維素膜、設(shè)置在玻璃纖維素膜上的硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上一端設(shè)有樣本墊，對應(yīng)的另一端設(shè)有吸水墊，所述硝酸纖維纖維素膜上設(shè)置有檢測線1、檢測線2和控制線，所述第一試紙條的玻璃纖維素膜上包被有質(zhì)量比為1:1的量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體的混合物;所述第一試紙條的檢測線I上包被有腺病毒抗原，檢測線2上包被有輪狀病毒抗原;所述第二試紙條的玻璃纖維素膜上包被有質(zhì)量比為1:1的量子點(diǎn)標(biāo)記的星狀病毒抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記的諾如病毒抗體混合物;所述第一試紙條的檢測線I上包被有星狀病毒抗原，檢測線2上包被有諾如病毒抗原;所述第一試紙條和第二試紙條控制線上均包被有羊抗鼠IgG。所述量子點(diǎn)為砸化鎘量子點(diǎn)。
[0064]本實(shí)施例四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒的制備方法，具體操作步驟為:
[0065]第一、制備第一試紙條:
[0066]I)制備玻璃纖維素膜:
[0067]a:取Iml未標(biāo)記膠乳顆粒加入1ml，0.02M，pH7.4PB緩沖液中；離心機(jī)1000rpm離心20min;去掉上清液，再用1ml，0.02M，pH7.4PB緩沖液重懸沉淀顆粒物；之后再離心機(jī)1000rpm離心20min，去掉上清并用5ml0.02M，pH7.4，ro緩沖液重懸沉淀顆粒物，4°C保存待用；
[0068]b:取步驟a制備的膠乳顆粒用0.02M，pH6.1的MES緩沖液將膠乳顆粒稀釋至1mg/ml，取0.05ml稀釋后的膠乳顆粒懸池液加入1mg羧基化改性環(huán)糊精，混勾24小時(shí)后，離心機(jī)8000rpm離心，棄去上清，并用0.02M，pH7.4的I3B緩沖液重懸沉淀顆粒物，之后再次離心機(jī)8000rpm離心，棄去上清，沉淀顆粒物復(fù)溶于0.02M，pH7.4的PB緩沖液中，得羧基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液；
[0069]c:取步驟b制備的羧基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液，用0.02M，pH6.1的MES緩沖液將其稀釋至10mg/ml，取20ml稀釋后的羧基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合懸濁液，加入20mg砸化鎘量子點(diǎn)，混勻24小時(shí)，離心機(jī)8000rpm離心，棄去上清，并用0.02M，pH7.4的I3B緩沖液重懸沉淀顆粒物，之后再次離心機(jī)8000rpm離心，棄去上清，沉淀顆粒物復(fù)溶于0.02M，pH7.4的PB緩沖液中，得量子點(diǎn)-羧基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸池液；
[0070]d:取步驟c制備的量子點(diǎn)-羧基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液，用0.02M，pH6.1的MES緩沖液將其稀釋至10mg/ml，然后按照量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物與活化劑的質(zhì)量比為I: 10，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，活化15分鐘后，8000rpm離心，棄去上清，并用0.02M，pH7.4的I3B緩沖液重懸沉淀物顆粒，之后按照腺病毒抗體:量子點(diǎn)-羧基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物=1:20的比例加入腺病毒抗體，混勻3小時(shí)后，SOOOrpm離心15分鐘，將沉淀物顆粒用封閉液重懸，室溫混勾I小時(shí)，之后8000rpm離心15min，沉淀顆粒物復(fù)溶于分散液，即得量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體；
[0071 ] e:按照上述步驟a?c同樣的方法制備量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體，然后將量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體混合，噴涂于玻璃纖維素模上，37°C干燥4小時(shí)，即得量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體混合物標(biāo)記的玻璃纖維素膜；
[0072]2)制備硝酸纖維素膜:取硝酸纖維素膜，間隔6mm依次劃分檢測線3、檢測線2、檢測線I和控制線，之后取濃度均為lmg/ml的腺病毒抗原、輪狀病毒抗原、羊抗鼠IgG，以lul/cm，1cm/秒的速度分別噴涂到硝酸纖維膜的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上，之后將硝酸纖維素膜放入牛血清白蛋白溶液中封閉，37°C干燥3小時(shí)，即得所述的硝酸纖維素膜；
[0073]3)組裝:在塑料板上放置步驟I)制備的玻璃纖維素模，在步驟I)制備的玻璃纖維素膜上放置步驟2)制備的硝酸纖維素膜，然后在硝酸纖維素的一端放置樣品墊，對應(yīng)的另一端放置吸水墊，37°C干燥5小時(shí)，即得第一試紙條；
[0074]第二、按照上述第一試紙條同樣的制備方法制備第二試紙條；
[0075]第三、將第一試紙條和第二試紙條對應(yīng)的放入具有兩個(gè)檢視窗的殼體內(nèi)，使得試紙條的檢測線和控制線均從檢視窗可見。
[0076]實(shí)施例2
[0077]本實(shí)施例四種腸道病毒聯(lián)合檢測用試劑盒，與實(shí)施例不同的地方在于，采用的量子點(diǎn)為硫化錦量子點(diǎn)，米用的改性環(huán)糊精為氨基化干性環(huán)糊精，制備腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的星狀病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的諾如病毒抗體的過程中，在活化的量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳懸濁液中加入抗體或抗原的混勻時(shí)間為2小時(shí)，其他同實(shí)施例I。
[0078]實(shí)施例3
[0079]本實(shí)施例四種腸道病毒聯(lián)合檢測用試劑盒，與實(shí)施例不同的地方在于，制備腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的星狀病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的諾如病毒抗體的過程中，在活化的量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳懸濁液中加入抗體或抗原的混勻時(shí)間為4小時(shí)，其他同實(shí)施例1。
[0080]最后應(yīng)說明的是:以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制;盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒，包括具有兩個(gè)檢視窗口的殼體，所述殼體內(nèi)放置有第一試紙條和第二試紙條，所述第一試紙條和第二試紙條均包括塑料板、設(shè)置在塑料板上的玻璃纖維素膜、設(shè)置在玻璃纖維素膜上的硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上一端設(shè)有樣本墊，對應(yīng)的另一端設(shè)有吸水墊，所述硝酸纖維纖維素膜上設(shè)置有檢測線1、檢測線2和控制線，其特征在于，所述第一試紙條的玻璃纖維素膜上包被有量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體的混合物;所述第一試紙條的檢測線I上包被有腺病毒抗原，檢測線2上包被有輪狀病毒抗原;所述第二試紙條的玻璃纖維素膜上包被有量子點(diǎn)標(biāo)記的星狀病毒抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記的諾如病毒抗體混合物;所述第一試紙條的檢測線I上包被有星狀病毒抗原，檢測線2上包被有諾如病毒抗原;所述第一試紙條和第二試紙條控制線上均包被有羊抗鼠lgG。2.如權(quán)利要求1所述的四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒，其特征在于，所述第一試紙條玻璃纖維素膜上包被的量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體混合物中量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體質(zhì)量比為1:1;所述第二試紙條玻璃纖維膜上包被的量子點(diǎn)標(biāo)記的星狀病毒抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記的諾如病毒抗體混合物中量子點(diǎn)標(biāo)記的星狀病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的諾如病毒抗體的質(zhì)量比為1:1。3.如權(quán)利要求1所述的四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒，其特征在于，所述量子點(diǎn)為砸化錦或硫化錦量子點(diǎn)。4.如權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述的四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒，其特征在于，所述硝酸纖維素膜上設(shè)置的檢測線I與檢測線2之間、檢測線2與檢測線3之間、檢測線I與控制線之間的間隔均不小于5_。5.—種如權(quán)利要求1所述的四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下操作步驟: 第一、制備第一試紙條: 1)原材料的制備: A:制備玻璃纖維素膜:將量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體混合包被在玻璃纖維素膜上，干燥，備用； B:制備硝酸纖維素膜:取硝酸纖維素膜，間隔劃分出檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線，然后將腺病毒抗原、輪狀病毒抗原、羊抗鼠IgG分別包被在硝酸纖維素膜的檢測線1、檢測線2和控制線上，之后將包被后的硝酸纖維素膜放入封閉液中封閉，干燥，備用； 2)組裝:在塑料板上放置步驟I)制備的玻璃纖維素模，然后在步驟I)制備的玻璃纖維素膜上放置步驟I)制備的硝酸纖維素膜，然后在硝酸纖維素的一端放置樣品墊，對應(yīng)的另一端放置吸水墊，干燥，即的第一試紙條； 第二、按照上述第一試紙條同樣的制備方法制備第二試紙條； 第三、將制備的第一試紙條和第二試紙條對應(yīng)放置在具有兩個(gè)檢視窗口的殼體內(nèi)，即完成。6.如權(quán)利要求5所述的四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟A中還包括首先制備量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體的混合物，具體方法包括以下操作步驟: a:在膠乳顆粒懸濁液中加入改性環(huán)糊精，混勻24小時(shí)，純化，得改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液； b:在步驟a制備的改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入量子點(diǎn)，混勻24小時(shí)，純化，得量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸池液； c:在步驟b制備的量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入活化劑，活化15分鐘，純化，之后加入腺病毒抗體，混勻2?4小時(shí)后，離心得沉淀物顆粒，將沉淀物顆粒用封閉液重懸，室溫混勻I小時(shí)，之后再進(jìn)行純化，即得量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體； d:按照上述步驟a?c同樣的方法制備量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體，然后將量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體混合，備用。7.如權(quán)利要求6所述的四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒的制備方法，其特征在于，所述改性環(huán)糊精為羧甲基化改性環(huán)糊精或氨基化改性環(huán)糊精。8.如權(quán)利要求6所述的四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟a中所述改性環(huán)糊精與膠乳顆粒的質(zhì)量比為20:1;步驟b中所述量子點(diǎn)與環(huán)糊精-乳膠復(fù)合物的質(zhì)量比為10:1;步驟c中所述腺病毒抗體與量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物的質(zhì)量比為1:20。9.如權(quán)利要求6所述的四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟A中將量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體混合物包被在玻璃纖維素膜上的具體方法為:將量子點(diǎn)標(biāo)記的腺病毒抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的輪狀病毒抗體混合物均勻噴涂于玻璃纖維素膜上。10.如權(quán)利要求6所述的四種腸道病毒聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟B中將腺病毒抗原、輪狀病毒抗原羊抗鼠IgG分別包被在硝酸纖維素膜的檢測線.1、檢測線2和控制線上的具體方法為:分別取濃度均為lmg/ml的腺病毒抗原、輪狀病毒抗原和羊抗鼠IgG，以lul/cm，10cm/秒的速度分別噴涂到硝酸纖維的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK105866408SQ201610326804
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】金鑫, 曾濱, 趙正道
【申請人】北京美康基因科學(xué)股份有限公司