本發(fā)明屬于熒光免疫層析
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種25-羥基維生素D熒光免疫層析試紙條用的活化熒光乳膠微球及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：熒光免疫層析試紙條（試劑卡）因其快速便捷的特性，廣泛用于快檢領(lǐng)域。待測(cè)物抗體標(biāo)記熒光乳膠微球，乳膠微球在液相中存在著表面電子斥力和范德華力使得液相中的乳膠顆粒保持均勻分布。但是噴涂于玻璃纖維素膜并烘干后隨著溶液被蒸發(fā)干，表面張力推動(dòng)乳膠顆粒間無限靠近導(dǎo)致分子間斥力消失，范德華力增大，最終使得多個(gè)乳膠分子團(tuán)聚成大大小小不同的顆粒。當(dāng)免疫層析時(shí)加入樣本復(fù)溶乳膠微球時(shí)，乳膠微球不再均勻分散導(dǎo)致層析失敗。因此本領(lǐng)域多采用熒光免疫層析試劑盒，含試紙條加上樣本緩沖液。增加了檢測(cè)復(fù)雜度。或者由于乳膠微球部分凝聚，使得檢測(cè)靈敏度降低，檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性。另外，乳膠微球的不穩(wěn)定，也會(huì)使得熒光試紙條的穩(wěn)定性差，不便于保存以及運(yùn)輸。維生素D是一種類固醇激素，經(jīng)皮膚光照后產(chǎn)生，維生素D的兩種重要形式包括維生素D3（膽鈣化醇）和維生素D2（麥角鈣化醇），在人體中，維生素結(jié)合蛋白與維生素D3和維生素D2相結(jié)合，并將它們轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟中，在那里這兩種形式都被羥基化，生成維生素D，即25－羥基維生素D。25－羥基維生素D是一種代謝混合物，可在血中檢出，由于它是人體中維生素D的主要儲(chǔ)存形式，能夠促進(jìn)腸道對(duì)鈣的吸收以及調(diào)節(jié)鈣平衡。維生素D是維持骨骼健康的主要元素。兒童期維生素D的嚴(yán)重缺乏將導(dǎo)致骨骼畸形，即佝僂病。25-羥基維生素D濃度降低與骨密度下降有關(guān)。結(jié)合其它臨床資料，檢測(cè)結(jié)果有助于評(píng)估骨代謝情況。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：熒光免疫層析試紙條的熒光乳膠微球在烘干后，容易團(tuán)聚，分散不均勻，從而導(dǎo)致層析失敗或使得檢測(cè)靈敏度降低。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種25-羥基維生素D熒光免疫層析試紙條用的活化熒光乳膠微球及其制備，應(yīng)用該活化熒光乳膠微球制備的25-羥基維生素D干式熒光免疫層析試紙條，本試紙條可用于體外定量測(cè)定人血清、血漿或全血中25－羥基維生素D的含量。本發(fā)明的試紙條可以解決熒光乳膠微球在噴涂、烘干玻璃纖維素膜時(shí)發(fā)生團(tuán)聚的現(xiàn)象，以便制備標(biāo)記物墊，從而得到干式熒光免疫層析試紙條，無需稀釋液配置檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供的25-羥基維生素D熒光免疫層析試紙條用活化熒光乳膠微球的制備方法，包括如下步驟：1）取表面活性劑加入pH為8~10的緩沖溶液中，再加入二甲基甲酰胺、N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺；2）取氨基表面的熒光乳膠微球的分散液，以緩沖溶液調(diào)pH至8~10后，加入到步驟1）所得的混合物中，攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完畢后，離心去除上清液，得到活化熒光乳膠微球；其中，所述表面活性劑含有聚乙二醇單月桂酸酯和硬脂酸鈉，二者的重量比為0.5~5:1。優(yōu)選地，所述表面活性劑還含有椰油酰基谷氨酸三乙醇胺鹽，聚乙二醇單月桂酸酯、硬脂酸鈉和椰油?；劝彼崛掖及符}的重量比為0.5~5:1:2~4。更優(yōu)選地，所述表面活性劑為聚乙二醇單月桂酸酯、硬脂酸鈉和椰油?；劝彼崛掖及符}重量比為2:1:3的混合物。優(yōu)選地，所述表面活性劑與所述氨基表面的熒光乳膠微球的質(zhì)量比為500~2000:1。優(yōu)選地，步驟1）和步驟2）中所述的緩沖溶液為碳酸緩沖液；步驟2）中的攪拌反應(yīng)時(shí)間為2~4小時(shí)，溫度為20~30℃；氨基表面的熒光乳膠微球?yàn)榘被郾揭蚁晒馕⑶颉１景l(fā)明還提供上述的制備方法得到的25-羥基維生素D熒光免疫層析試紙條用活化熒光乳膠微球。本發(fā)明還提供上述的25-羥基維生素D熒光免疫層析試紙條用活化熒光乳膠微球的標(biāo)記物工作液的制備方法：取25-羥基維生素D熒光免疫層析試紙條用活化熒光乳膠微球分散于微球緩沖液中，得到標(biāo)記物工作液；表面活化的熒光乳膠微球在標(biāo)記物工作液中所占的比例為0.5~2wt%；其中，微球緩沖液的制備方法為：將BSA（牛血清蛋白）、生物防腐劑、雷米邦A(yù)和甜菜堿溶于0.01M、pH7.4的磷酸緩沖液中。優(yōu)選地，BSA、生物防腐劑、雷米邦A(yù)和甜菜堿在所述微球緩沖液中的濃度均為0.1wt%。本發(fā)明還提供25-羥基維生素D熒光免疫層析試紙條的標(biāo)記物墊的制備方法，包括如下步驟:1）活化熒光乳膠微球標(biāo)記的兔IgG的制備：取上述制備方法得到的標(biāo)記物工作液，離心，棄上清液后，用標(biāo)記緩沖液復(fù)溶，并且同時(shí)加入碳二亞胺和兔IgG，攪拌反應(yīng)，然后離心，棄上清液，最后用標(biāo)記稀釋液復(fù)溶；2）活化熒光乳膠微球標(biāo)記的標(biāo)記用鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體的制備方法：取上述制備方法得到的標(biāo)記物工作液，離心，棄上清液后用標(biāo)記緩沖液復(fù)溶，并且同時(shí)加入碳二亞胺和標(biāo)記用鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體，攪拌反應(yīng)，然后離心，棄上清液，最后用標(biāo)記稀釋液復(fù)溶；3）取步驟1）所得分散液和步驟2）所得分散液，混合，噴涂于玻璃纖維之上，烘干；所述標(biāo)記緩沖液的配方為：碳酸鈉4.33g、碳酸氫鈉2.96g，溶于1000mL水中；所述標(biāo)記稀釋液的配方為：檸檬酸三鈉7.33g、檸檬酸4.44g、氫氧化鈉1g，溶于1000mL水中。本發(fā)明提供一種25-羥基維生素D熒光免疫層析試紙條，包括上述的標(biāo)記物墊、包被墊和吸收墊，其中所述標(biāo)記物墊搭接于包被墊的一端上，吸收墊搭接于包被墊的另一端上，包被墊上設(shè)有質(zhì)控線和檢測(cè)線，質(zhì)控線上包被有羊抗兔IgG的抗體，檢測(cè)線上包被有25-羥基維生素D完全抗原。本發(fā)明能夠達(dá)到如下技術(shù)效果：1、本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)特定的表面活性劑活化的熒光乳膠微球在烘干時(shí)保持顆粒間的相對(duì)距離不易團(tuán)聚。層析過程時(shí)，加入樣本能即刻復(fù)溶并順利層析，以便制備干式熒光免疫層析試紙條（試劑卡），方便用戶使用，且檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠。2、本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)篩選出適合用于25-羥基維生素D熒光免疫層析試紙條的熒光乳膠微球的特定表面活性劑組合。采用特定的表面活性劑事先處理化學(xué)修飾的熒光乳膠微球，處理后的乳膠微球標(biāo)記25-羥基維生素D抗體，用于制備25-羥基維生素D熒光免疫層析試紙條的標(biāo)記物墊，實(shí)現(xiàn)乳膠微球均勻噴涂，無團(tuán)聚現(xiàn)象。并且，在加入待測(cè)樣本后，標(biāo)記的熒光乳膠微球可以快速的、順利實(shí)現(xiàn)層析，無需特殊樣本稀釋液或者緩沖液處理試紙條。3、本發(fā)明所制備的25-羥基維生素D干式熒光免疫層析試紙條，穩(wěn)定性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，用戶友好，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，靈敏度高。附圖說明圖1是本發(fā)明的25-羥基維生素D熒光免疫層析試劑卡的截面分解結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是本發(fā)明的25-羥基維生素D熒光免疫層析試劑卡的俯視結(jié)構(gòu)示意圖。圖325-羥基維生素D(25-OH-D)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。圖4全血樣本中25-羥基維生素D(25-OH-D)含量測(cè)定曲線。圖5是實(shí)施例5的試紙條的熒光信號(hào)曲線。圖6是實(shí)施例6的試紙條的熒光信號(hào)曲線。圖7是實(shí)施例7的試紙條的熒光信號(hào)曲線。圖8是實(shí)施例8的試紙條的熒光信號(hào)曲線。圖9是對(duì)比例的試紙條的熒光信號(hào)曲線。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。本發(fā)明提供了一種25-羥基維生素D熒光免疫層析試紙條用活化熒光乳膠微球，包括如下步驟：1）取表面活性劑加入pH為8~10的緩沖溶液中，加入二甲基甲酰胺、N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，攪拌反應(yīng)；2）取氨基表面的熒光乳膠微球的分散液，以緩沖溶液調(diào)pH至8~10后，加入到步驟1）所得的混合物中，攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完畢后，離心去除上清液，得到活化熒光乳膠微球；其中，所述表面活性劑含有聚乙二醇單月桂酸酯和硬脂酸鈉，二者的重量比為0.5~5:1。本發(fā)明采用聚乙二醇單月桂酸酯和硬脂酸鈉（還可包括椰油酰基谷氨酸三乙醇胺鹽）通過共價(jià)偶聯(lián)的方法修飾乳膠微球外表面，使其具有疏水性。采用處理后的活化熒光乳膠微球標(biāo)記25-羥基維生素D抗體。熒光乳膠微球標(biāo)記的25-羥基維生素D抗體與熒光乳膠微球標(biāo)記的兔IgG混勻后噴涂在玻璃纖維素膜上制備成標(biāo)記物墊1，包被墊2（硝酸纖維素膜）靠近質(zhì)控線的一端覆蓋上吸水墊，靠近檢測(cè)線的另一端覆蓋標(biāo)記物墊，用于制備干式熒光免疫層析試劑卡，檢測(cè)線上包被25-羥基維生素D完全抗原。加入待測(cè)樣本后，25-羥基維生素D與熒光乳膠微球標(biāo)記的25-羥基維生素D抗體接觸反應(yīng)，乳膠微球能夠保持分散狀態(tài)不團(tuán)聚，且在接觸待測(cè)樣本后可迅速、均勻分散，并沿著硝酸纖維素膜快速層析。本發(fā)明以下實(shí)施例中所用的熒光乳膠微球是指被化學(xué)修飾的氨基表面的聚苯乙烯熒光微球，直徑100-500nm。一、活化熒光乳膠微球的制備實(shí)施例11）取表面活性劑（4mg聚乙二醇單月桂酸酯、2mg硬質(zhì)酸鈉和6mg椰油酰基谷氨酸三乙醇胺鹽）首先溶解在0.5MpH9.6的碳酸緩沖液（H值到9.6），再加入在0.1ml的DMF中，0.1ml的DMF中，加入N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)1mg和0.6mgN-羥基琥珀酰亞胺（NHS）后室溫?cái)嚢?小時(shí)。2）將1ml含1%固體物的氨基表面的熒光乳膠微球溶液用0.5MpH9.6的碳酸緩沖液調(diào)PH值到9.6后加入到步驟1）中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)3小時(shí)。既得活化的乳膠微球。3）用高速離心機(jī)將熒光乳膠微球反應(yīng)液高速離心分離，去除反應(yīng)溶液上清液，用1mL微球緩沖液復(fù)溶熒光乳膠微球，形成標(biāo)記物工作液。微球磷酸緩沖液配制：0.01MpH7.4的磷酸緩沖液，含0.1wt%BSA，含0.1wt%生物防腐劑，含0.1wt%雷米邦A(yù)，含0.1wt%甜菜堿。微球磷酸緩沖液提供一定的例子強(qiáng)度和PH值，使微球均勻分散。實(shí)施例2本實(shí)施例的操作方法與實(shí)施例1類似，不同之處在于，步驟1）中表面活性劑為：5mg聚乙二醇單月桂酸酯、1mg硬質(zhì)酸鈉和4mg椰油?；劝彼崛掖及符}。實(shí)施例3本實(shí)施例的操作方法與實(shí)施例1類似，不同之處在于，步驟1）中表面活性劑為：1mg聚乙二醇單月桂酸酯、2mg硬質(zhì)酸鈉和7mg椰油酰基谷氨酸三乙醇胺鹽。實(shí)施例4本實(shí)施例的操作方法與實(shí)施例1類似，不同之處在于，步驟1）中表面活性劑為：5mg聚乙二醇單月桂酸酯和5mg硬質(zhì)酸鈉。二、以25-羥基維生素D熒光免疫層析試紙條為例對(duì)實(shí)施例1~4制備的活化熒光乳膠微球的應(yīng)用及效果進(jìn)行說明。實(shí)施例5采用實(shí)施例1得到的標(biāo)記物工作液制備的熒光免疫層析試紙條1）熒光乳膠微球標(biāo)記的兔IgG：取5mL實(shí)施例1得到的標(biāo)記物工作液，用離心機(jī)離心30min（轉(zhuǎn)速為10000r/min），離心完后棄上清液，用5mL標(biāo)記緩沖液復(fù)溶，再加入1mg的兔IgG混勻，另加入5mg碳化二亞胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1h，然后離心15min（轉(zhuǎn)速為10000r/min），棄上清液，用10mL的標(biāo)記物稀釋液稀釋復(fù)溶混勻后備用。2）熒光乳膠微球標(biāo)記的標(biāo)記用鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體取10mL實(shí)施例1得到的標(biāo)記物工作液，用離心機(jī)離心30min（轉(zhuǎn)速為10000r/min），離心完后棄上清液，用10mL標(biāo)記緩沖液復(fù)溶，再加入2mg的標(biāo)記用鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體混勻，另加入10mg碳化二亞胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1h，然后離心15min（轉(zhuǎn)速為10000r/min），棄上清液，用20mL的標(biāo)記物稀釋液稀釋復(fù)溶混勻后備用。步驟1）和2）中標(biāo)記緩沖液的配方為：碳酸鈉4.33g、碳酸氫鈉2.96g，溶于1000mL水中；標(biāo)記稀釋液的配方為：檸檬酸三鈉7.33g、檸檬酸4.44g、氫氧化鈉1g，溶于1000mL水中。3）標(biāo)記物墊制備步驟2）得到的熒光乳膠微球標(biāo)記的標(biāo)記用待測(cè)物抗體與步驟1）得到的熒光乳膠微球標(biāo)記的兔IgG混勻，二者體積比例為2:1。然后將混勻的熒光乳膠微球按1微升/厘米的量均勻噴涂在玻璃纖維素紙上轉(zhuǎn)置45℃的烘干箱烘干2小時(shí)即完成標(biāo)記物墊的制備。4）包被液制備：取25-羥基維生素D完全抗原加入磷酸鹽緩沖液中，制成檢測(cè)線包被液；取羊抗兔IgG加入磷酸鹽緩沖液中，制成質(zhì)控線包被液。該磷酸鹽緩沖液的配方為：0.99g磷酸二氫鈉，5.16g磷酸氫二鈉溶于1000mL純化水中。5）包被墊的處理：檢測(cè)線包被液在包被墊上劃線包被形成檢測(cè)線，質(zhì)控線包被液在在包被墊上劃線包被形成質(zhì)控線，然后干燥。6）試紙條組裝：將干燥好的標(biāo)記物墊和剪裁好的吸收墊（吸水紙），按包被墊（硝酸纖維素膜）靠近質(zhì)控線的一端覆蓋上吸收墊，靠近檢測(cè)線的另一端覆蓋標(biāo)記物墊的要求進(jìn)行貼條。按切條機(jī)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行操作，切成4mm±0.1mm寬的試紙條。如圖1和2所示，試紙條包括：包被墊2（硝酸纖維素膜），其兩端各設(shè)有一連接段（如圖所示第一連接段20、第二連接段22），兩連接段中間為檢測(cè)段21，檢測(cè)段21表面設(shè)有檢測(cè)線5和質(zhì)控線7；標(biāo)記物墊1（玻璃纖維素膜），其一端設(shè)有連接段10，標(biāo)記物墊的連接段10覆蓋并固定于包被墊2的第一連接段20上；標(biāo)記物墊1上噴涂有標(biāo)記物8，具體在一實(shí)施方式中，是在靠近連接段10附近（距連接段2mm，標(biāo)記物沿包被墊長(zhǎng)度方向的長(zhǎng)度為5mm）噴涂標(biāo)記物8（含有熒光乳膠微球標(biāo)記的兔IgG和熒光乳膠微球標(biāo)記的標(biāo)記用鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體）。吸收墊3（吸水紙），其一端設(shè)有連接段30，吸收墊的連接段30覆蓋并固定于包被墊2的第二連接段22上；底板4，包被墊2、標(biāo)記物墊1和吸收墊3均固定于底板上。本試紙條在測(cè)定時(shí)采用競(jìng)爭(zhēng)法反應(yīng)原理，將25-羥基維生素D完全抗原和羊抗兔lgG包被于NC膜上，分別作為T線（檢測(cè)線）和C線（質(zhì)控線），將鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體和兔lgG分別標(biāo)記在乳膠熒光微球上，混合噴于玻璃纖維素膜上作為標(biāo)記物，血液中的25-OH-D抗原與包被抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合標(biāo)記物中的抗體，被T線和C線結(jié)合上的標(biāo)記物顯示一定強(qiáng)度光信號(hào)，T線和C線的光信號(hào)的比值與濃度成負(fù)相關(guān)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算即可得出待測(cè)樣品濃度。（一）本實(shí)施例制得的試紙條校準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣本的測(cè)定將50ul校準(zhǔn)品或者待測(cè)樣本緩慢滴加在標(biāo)記物墊上。在室溫條件下靜置15分鐘反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將試紙條放入到Savant-100熒光免疫層析分析儀中檢測(cè)。校準(zhǔn)品的每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)做3遍，取T/C面積比的平均值后與濃度生成一條標(biāo)準(zhǔn)曲線（線性范圍5-120ng/mL）。標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果如下表所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線如附圖3所示。線性x1x2x3x4x54.8323.5650.2485.35107.024.5625.6354.3990.14105.354.8926.3952.6386.35117.38平均值4.7625.1952.4287.28109.92SD0.181.462.082.536.52CV3.69%5.81%3.97%2.90%5.93%理論值平均值x14.764.76x225.1931.05x352.4257.34x487.2883.63x5109.92109.92收集臨床樣本200例，與西門子（SIEMENS）醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品總維生素D測(cè)定試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，樣本檢測(cè)值如附圖4所示，可見當(dāng)r>0.975時(shí)，證明與西門子（SIEMENS）醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果等同，具有同樣的有效性。（二）關(guān)于熒光乳膠微球的分散性和涌動(dòng)性試紙條的層析完成后，使用儀器采集包被墊的檢測(cè)段21上的熒光信號(hào)，其將檢測(cè)段沿長(zhǎng)度方向平分為300段，每段為單位輸出電信號(hào)（熒光強(qiáng)度）。共計(jì)輸出300個(gè)電信號(hào)，如圖5所示。圖5中，縱坐標(biāo)：FluonescenceIntensity發(fā)光強(qiáng)度；橫坐標(biāo)：檢測(cè)段21的位置長(zhǎng)度（檢測(cè)段21靠近第二連接段22的一側(cè)邊為0）；橫坐標(biāo)50-100測(cè)的是質(zhì)控線7，取值是50-100此段的峰面積。橫坐標(biāo)200-250測(cè)的是檢測(cè)線5，取值是200-250此段的峰面積。從圖5中可看出，表面活化的熒光乳膠微球易形成單分散狀態(tài)，提高微球涌動(dòng)性能。當(dāng)血液移動(dòng)至抗原的檢測(cè)線時(shí)，待測(cè)物和試劑的復(fù)合物便可以進(jìn)行充分的特異性結(jié)合（200-250段峰值）。峰清晰，檢測(cè)段21上除了檢測(cè)線與質(zhì)控線之外無熒光微球殘留。本實(shí)施例制得的試紙條，檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、發(fā)光效率高且能夠定量反應(yīng)血液中檢測(cè)物的濃度。實(shí)施例6采用實(shí)施例2得到的標(biāo)記物工作液制備的熒光免疫層析試紙條本實(shí)施例的熒光免疫層析試紙條與實(shí)施例5類似，區(qū)別在于步驟1）和2）中使用實(shí)施例2得到的標(biāo)記物工作液取代實(shí)施例1得到的標(biāo)記物工作液。對(duì)熒光乳膠微球的分散性和涌動(dòng)性進(jìn)行檢測(cè)，方法同實(shí)施例5，結(jié)果見圖6，本實(shí)施例制得的熒光免疫層析試紙條的具有如下效果：表面活化的熒光乳膠微球易形成單分散狀態(tài)，提高微球涌動(dòng)性能。當(dāng)血液移動(dòng)至抗原的檢測(cè)線時(shí)，待測(cè)物和試劑的復(fù)合物便可以進(jìn)行充分的特異性結(jié)合（200-250段峰值）。峰清晰，檢測(cè)段21上除了檢測(cè)線與質(zhì)控線之外無熒光微球殘留。本實(shí)施例制得的試紙條，檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、發(fā)光效率高且能夠定量反應(yīng)血液中檢測(cè)物的濃度。實(shí)施例7采用實(shí)施例3得到的標(biāo)記物工作液制備的熒光免疫層析試紙條本實(shí)施例的熒光免疫層析試紙條與實(shí)施例5類似，區(qū)別在于步驟1）和2）中使用實(shí)施例3得到的標(biāo)記物工作液取代實(shí)施例1得到的標(biāo)記物工作液。對(duì)熒光乳膠微球的分散性和涌動(dòng)性進(jìn)行檢測(cè)，方法同實(shí)施例5，結(jié)果見圖7，本實(shí)施例制得的熒光免疫層析試紙條的具有如下效果：表面活化的熒光乳膠微球易形成單分散狀態(tài)，提高微球涌動(dòng)性能。當(dāng)血液移動(dòng)至抗原的檢測(cè)線時(shí)，待測(cè)物和試劑的復(fù)合物便可以進(jìn)行充分的特異性結(jié)合（200-250段峰值）。峰清晰，檢測(cè)段21上除了檢測(cè)線與質(zhì)控線之外無熒光微球殘留。本實(shí)施例制得的試紙條，檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、發(fā)光效率高且能夠定量反應(yīng)血液中檢測(cè)物的濃度。實(shí)施例8采用實(shí)施例3得到的標(biāo)記物工作液制備的熒光免疫層析試紙條本實(shí)施例的熒光免疫層析試紙條與實(shí)施例5類似，區(qū)別在于步驟1）和2）中使用實(shí)施例4得到的標(biāo)記物工作液取代實(shí)施例1得到的標(biāo)記物工作液。對(duì)熒光乳膠微球的分散性和涌動(dòng)性進(jìn)行檢測(cè)，方法同實(shí)施例5，結(jié)果見圖8，本實(shí)施例制得的熒光免疫層析試紙條的具有如下效果：表面活化的熒光乳膠微球易形成單分散狀態(tài)，提高微球涌動(dòng)性能。當(dāng)血液移動(dòng)至抗原的檢測(cè)線時(shí)，待測(cè)物和試劑的復(fù)合物便可以進(jìn)行充分的特異性結(jié)合（200-250段峰值）。峰清晰，檢測(cè)段21上除了檢測(cè)線與質(zhì)控線之外無熒光微球殘留。本實(shí)施例制得的試紙條，檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、發(fā)光效率高且能夠定量反應(yīng)血液中檢測(cè)物的濃度。對(duì)比例本對(duì)比例的熒光免疫層析試紙條與實(shí)施例5類似，區(qū)別在于步驟1）和2）中使用市售的氨基聚苯乙烯熒光微球分散液取代實(shí)施例1得到的標(biāo)記物工作液。分散性和涌動(dòng)性檢測(cè)方法同實(shí)施例1，檢測(cè)結(jié)果見圖9，從圖9可看出：1.未活化微球，爬膜效果差。乳膠微球易凝聚，同時(shí)因其疏水性，易發(fā)生非特異性吸附，造成顆粒聚并。2.在檢測(cè)時(shí)的層析過程中，強(qiáng)大的吸附性凝聚成團(tuán)的熒光微球很難再形成單分散微球?qū)游觥?.因包被墊（NC膜）是多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)膜，因此可能與較大顆粒發(fā)生不利于層析檢測(cè)的非特異性吸附以及導(dǎo)致大顆粒熒光微球釋放性差。4.致NC膜前（檢測(cè)線5到第一連接段20之間的檢測(cè)段21）端有明顯大量熒光微球殘留。圖9中的200-300段，測(cè)試峰難以分辨。以上所述實(shí)施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實(shí)施例，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3