一種互花米草耐鹽蛋白hkt及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及一種互花米草耐鹽蛋白HKT，具體涉及一種互花米草耐鹽蛋白HKT及其 編碼基因和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]自然界諸多環(huán)境因子如鹽漬、重金屬、干旱等都會限制或影響植物的正常生長發(fā) 育，其中鹽漬是影響最普遍的脅迫因子。鹽漬脅迫可造成植物細胞脫水，膜系統(tǒng)損傷，膜上 酶活性紊亂，各種代謝活動無序進行;還會使光合速率下降，呼吸速率發(fā)生變化，誘導(dǎo)糖類 和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變成可溶性化合物等。
[0003] 互花米草(Spartina alternif lora Loisel，）為禾本科米草屬多年生草本植物， 原產(chǎn)于北美大西洋沿岸，生長于海岸灘涂，可耐受周期性潮汐引起的全海水(約含3%NaCl) 的淹沒，是高度耐鹽的泌鹽鹽生植物?；セ撞莸目姑{迫能力和繁殖能力較強，生長迅速， 1979年從美國引入我國南方地區(qū)，在保灘護岸、加速淤積、控制污染等方面取得了一定的生 態(tài)和經(jīng)濟效益。從互花米草中發(fā)掘、定位、克隆耐鹽相關(guān)基因，將對探究植物耐鹽機制具有 重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種互花米草耐鹽重要蛋白HKT及其編碼基因和應(yīng)用，該 蛋白及其編碼基因可以提尚植物的耐鹽性。
[0005 ]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[0006] 一種互花米草耐鹽蛋白HKT，來源于互花米草（Spart ina al tern i f lora Loisel，），是如下(a)或(b):
[0007] (a)序列如SEQ ID N0，1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0008] (b)將SEQ ID N0，1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與植物耐鹽性相關(guān)的由序列SEQ ID N0，1衍生的蛋白質(zhì)。
[0009] 上述(b)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。
[0010] 本發(fā)明所述的蛋白HKT的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0011] 所述的編碼基因為（1)至(4)中任一所述的DNA分子：
[0012] 1)序列如SEQ ID N0,2所示的DNA分子；
[0013] 2)如SEQ ID N0,2所示序列中自5'末端第80至1756位核苷酸所示的DNA分子；
[00M] 3)在嚴(yán)格條件下與⑴或（2)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐鹽相關(guān)蛋白的DNA 分子；
[0015] 4)與（1)或⑵或（3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼植物耐鹽相關(guān)蛋 白的DNA分子。
[0016] 所述的嚴(yán)格條件為在0，1XSSPE或0，1XSSC和0，1%SDS的溶液中，65°C條件下雜 交并洗膜。
[0017] 本發(fā)明還要求保護含有上述基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組 菌。
[0018] 可用現(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達載體。所述植物表達載體 包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等;所述植物表達載體還可包含外源基 因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片 段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端。
[0019] 使用所述基因構(gòu)建重組植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種 增強型啟動子或組成型啟動子，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用;此外，使 用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子， 這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱 讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的， 可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
[0020] 為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行 加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性 的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選 擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0021 ]所述重組表達載體具體為將所述基因插入植物表達載體Superl300的多克隆位點 得到的重組質(zhì)粒。
[0022] 本發(fā)明還提供了所述編碼基因或含有該基因的重組載體在培育耐鹽轉(zhuǎn)基因植物 中的應(yīng)用，具體為通過將所述的基因或重組載體導(dǎo)入目的植物中，得到耐鹽性高于所述目 的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
[0023] 所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。
[0024] 同時，擴增所述基因的全長或其任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。 [0025]本發(fā)明所達到的有益效果是:一種互花米草耐鹽蛋白HKT及其編碼基因和應(yīng)用，將 對植物耐鹽分子機制的研究，植物耐鹽品種的選育及植物耐旱性分子育種具有重要的理論 及實際意義，為提高植物的耐鹽性提供了一條經(jīng)濟、快速、有效的途徑，本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域 將具有廣闊的應(yīng)用和市場前景。
【附圖說明】
[0026]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的 附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附 圖。
[0027] 圖1為本發(fā)明中第一次RACE后的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M:Marker2000; 1 :SaHKT 3'-RACE產(chǎn)物；2:SaHKT5'-RACE產(chǎn)物。
[0028] 圖2為本發(fā)明中第二次RACE后的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M:Marker2000; 1 :SaHKT 3'-RACE產(chǎn)物；2:SaHKT5'-RACE產(chǎn)物。
[0029] 圖3為本發(fā)明中鹽脅迫處理下互花米草HKT8基因的表達差異。
【具體實施方式】
[0030] 以下對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用 于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0031] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0032] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0033]實施例1:互花米草耐鹽蛋白HKT及其編碼基因的克隆與鑒定互花米草：公眾可以 從山東萊州海濱獲得;參考文獻:韓會玲，張俠，尹海波，陳世華，郭善利，鹽脅迫和鎘脅迫下 互花米草生理特性的變化，江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41 (2): 361-363。
[0034]以互花米草為材料提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以該DNA為模板，以3'-RACE引物、 5 ' -RACE引物進行PCR擴增。
[0035] 一、Bizol試劑法提取互花米草的總RNA
[0036] (1)稱取不同處理的新鮮互花米草葉片約0.2g，在液氮中研磨成粉末狀，將粉末轉(zhuǎn) 移到1 · 5ml的Eppendorf管中。
[0037] (2)預(yù)先在1 · 5ml的Eppendorf管中加入lml的trizol，用力震蕩15min。
[0038] (3)室溫下靜置5min。
[0039] (4)4Γ，10000γρπι 離心 lOmin。
[0040] (5)取上清，加200μ1氯仿，混勻，室溫下靜置2~5min。
[0041] (6)4°C，lOOOOrpm離心10min。
[0042] (7)取上清加入另一 1 · 5ml的Eppendorf管中，加入500μ1預(yù)冷的異丙醇，-20°C沉淀 20min〇
[0043] (8)4°C，12000rpm離心 15min。
[0044] (9)棄上清，加 lml75 %的乙醇，清洗沉淀。
[0045] (10)倒掉乙醇，4°C，12000rpm，離心lmin。
[0046] (11)在超凈工作臺內(nèi)用滅過菌的槍頭將剩余液體吸干，同時在超凈工作臺內(nèi)風(fēng)吹 5~10min〇
[0047] (12)用不含RNase的DEPC水溶解RNA(