綠盲蝽感知傷害溫度通道蛋白及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及昆蟲(chóng)基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種綠盲睹感知傷害溫度的通道 蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 農(nóng)作物蟲(chóng)害嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，蟲(chóng)害嚴(yán)重發(fā)生時(shí)，不僅造成農(nóng)作物大幅減產(chǎn)，而且 影響農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。自化學(xué)殺蟲(chóng)劑出現(xiàn)后，農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的防治主要W化學(xué) 殺蟲(chóng)藥劑為主。然而隨著大范圍高劑量化學(xué)殺蟲(chóng)藥劑的使用，由此帶來(lái)的弊端也日趨明顯， 例如祀標(biāo)害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性、殺死非祀標(biāo)生物、污染環(huán)境、破壞生態(tài)系統(tǒng)等。因此，發(fā)展現(xiàn)代植 保技術(shù)，尋找新的祀標(biāo)位點(diǎn)來(lái)發(fā)展高效、安全、環(huán)保的害蟲(chóng)防治新方法顯得尤為迫切。
[0003] 綠盲睹屬于半翅目盲睹科，其重要寄主設(shè)及棉花、綠豆、蠶豆、向日葵、首猜、蘋(píng)果、 桃子、要、葡萄等28個(gè)科的作物，是我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要害蟲(chóng)。近十年來(lái)，盲睹已在我國(guó) 由次要害蟲(chóng)上升為了主要害蟲(chóng)，在棉花、要、葡萄等多種作物生產(chǎn)上造成了嚴(yán)重危害。盲睹 作為昆蟲(chóng)中的一種屬于變溫動(dòng)物，生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖、遷移、滯育等生命活動(dòng)更易受到環(huán)境溫 度變化的影響。研究表明，低溫（18°C)抑制綠盲睹生殖腺的發(fā)育并延緩卵的成熟，高溫則 抑制田間綠盲睹的種群密度。因此，通過(guò)調(diào)控綠盲睹溫度感知對(duì)其種群或生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行控 審IJ，進(jìn)而有效防控綠盲睹對(duì)農(nóng)作物的危害，是一項(xiàng)長(zhǎng)期而艱巨的任務(wù)。
[0004] 生物總是躲避極端的溫度并選擇適宜的溫度環(huán)境，快速、準(zhǔn)確的感知環(huán)境溫度的 變化已成為生物的基本生存能力。研究發(fā)現(xiàn)位于細(xì)胞膜及胞內(nèi)細(xì)胞器膜上的一類(lèi)非選擇性 陽(yáng)離子通道蛋白參與傷害溫度感知。此類(lèi)通道蛋白在某些昆蟲(chóng)外周神經(jīng)元表達(dá)時(shí)，一方面 參與調(diào)控其躲避傷害溫度、傷害性機(jī)械刺激及干燥的生存環(huán)境，另一方面有助于昆蟲(chóng)對(duì)來(lái) 自于某些植物揮發(fā)物產(chǎn)生厭惡反應(yīng)。目前，對(duì)于此類(lèi)通道蛋白，對(duì)于調(diào)控昆蟲(chóng)生理活動(dòng)及其 行為活動(dòng)的重要性顯而易見(jiàn)，但是研究卻主要集中于模式生物，尚未見(jiàn)針對(duì)綠盲睹中此類(lèi) 通道蛋白基因序列、功能等方面的研究報(bào)道。由此可見(jiàn)，對(duì)于該通道蛋白基因的鑒定及功能 研究有助于闡明昆蟲(chóng)感知傷害溫度的分子機(jī)制，從而很有可能使該通道蛋白及與其共同作 用的相關(guān)基因成為一種新的祀標(biāo)基因，同時(shí)新基因的發(fā)掘?qū)檗D(zhuǎn)基因植物的培育和基因工 程殺蟲(chóng)劑的生產(chǎn)提供有效的基因來(lái)源，用來(lái)發(fā)展高效、安全、環(huán)保的害蟲(chóng)防治新方法控制農(nóng) 業(yè)害蟲(chóng)的危害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種綠盲睹感知傷害溫度通道蛋白的 編碼基因、功能及其應(yīng)用。
[0006] 綠盲睹感知傷害溫度通道蛋白DTRC通道蛋白，其特征在于：
[0007] (a)其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示；或
[000引 化）在（a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或者多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或者添加 且具有相同活性的由（a)衍生的蛋白質(zhì)；或
[0009] (c)與SEQIDNO. 1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白。
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供編碼上述綠盲睹感知傷害溫度通道蛋白的基因。
[ocm] 其中，所述基因的核巧酸序列如序列表SEQIDNO. 2所示。
[0012] 本發(fā)明的目的也在于提供含有上述基因的表達(dá)載體。
[0013] 本發(fā)明的目的也在于提供含有上表達(dá)載體的宿主。
[0014] 本發(fā)明的目的也在于提供含所述基因的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
[0015] 本發(fā)明的目的也在于提供所述綠盲睹傷害溫度通道蛋白在制備殺蟲(chóng)劑中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的目的也在于提供綠盲睹傷害溫度通道蛋白在殺蟲(chóng)劑制備中作為祀標(biāo)的 應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的目的還在于提供所述基因在殺蟲(chóng)劑制備中作為祀標(biāo)的應(yīng)用。
[001引本發(fā)明中的DTRC通道蛋白或其基因可W通過(guò)從半翅目盲睹科昆蟲(chóng)綠盲睹 (Apolyguslucorum)提取、基因工程或化學(xué)方法制備。
[0019] 本發(fā)明中利用生物信息學(xué)技術(shù)，分析了綠盲睹觸角轉(zhuǎn)錄組，并獲得了DTRC通道蛋 白的基因片段，W此片段設(shè)計(jì)正向和反向引物，進(jìn)行3' -RACE,獲得了該基因的3'端序列。 根據(jù)基因測(cè)序拼接獲得DNA序列，在5'端和3'端非編碼區(qū)重新設(shè)計(jì)一對(duì)引物DTRC-F與 DTRC-R，提取綠盲睹RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，W此cDNA為模板并進(jìn)一步設(shè)計(jì)巢式引物來(lái)擴(kuò)增 DTRC基因的全長(zhǎng)序列進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。在此基因內(nèi)重新設(shè)計(jì)一對(duì)引物，提取綠盲睹不同組織 RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，W該些cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，獲得該基因在綠盲睹不同組織 中表達(dá)譜，分析證明該基因在足中高水平表達(dá)。構(gòu)建表達(dá)載體，對(duì)該基因利用爪贍卵母細(xì)胞 異源表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行體外表達(dá)，結(jié)合雙電極電壓錯(cuò)技術(shù)，對(duì)該通道蛋白功能進(jìn)行驗(yàn)證。并通過(guò) 綠盲睹行為學(xué)研究證明DTRC基因在綠盲睹感知環(huán)境溫度傷害中發(fā)揮著重要作用。
[0020] 本發(fā)明中的綠盲睹感知傷害溫度通道蛋白值TRC通道蛋白）在爪贍卵母細(xì)胞異源 表達(dá)系統(tǒng)中表現(xiàn)出在感知環(huán)境溫度傷害中發(fā)揮著重要作用。因此可W利用此基因和RNAi 轉(zhuǎn)基因植物的工作原理，用于轉(zhuǎn)基因棉花育種。綠盲睹取食此轉(zhuǎn)基因棉花后，其編碼的蛋白 即此感知傷害溫度通道蛋白功能受到影響，進(jìn)而影響綠盲睹感知環(huán)境溫度，導(dǎo)致其生存能 力下降，對(duì)棉花的抗綠盲睹育種將起到重要的促進(jìn)作用。本發(fā)明中的基因或蛋白作為祀標(biāo) 控制綠盲睹提供了理論基礎(chǔ)，可W作為新的有效祀標(biāo)來(lái)設(shè)計(jì)高效、安全、環(huán)保的化合物或者 發(fā)展新穎的物理防治措施來(lái)控制綠盲睹的危害。無(wú)論把該基因做成轉(zhuǎn)基因作物或者殺蟲(chóng)藥 劑，利用RNAi干擾原理，當(dāng)綠盲睹取食該轉(zhuǎn)基因作物或藥劑后，其體內(nèi)該基因受到干擾，使 基因功能喪失，因此蛋白表達(dá)受到影響。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為綠盲睹DTRC基因蛋白序列及結(jié)構(gòu)不意圖；
[002引其中陰影部分序列為預(yù)測(cè)的錯(cuò)蛋白重復(fù)序列（Ankl-Ank8);下劃線序列為預(yù)測(cè)的 跨膜結(jié)構(gòu)（TM1-TM6)。
[0023] 圖2為綠盲睹DTRC基因不同齡期和組織表達(dá)譜分析；
[0024] 其中（A)為綠盲睹DTRC基因在不同齡期的表達(dá)譜分析柱狀圖；1-6代表1-5齡若 蟲(chóng)及成蟲(chóng)；炬）為綠盲睹DTRC基因在成蟲(chóng)不同組織的表達(dá)譜分析柱狀圖。
[0025] 圖3為表達(dá)DTRC基因的爪贍卵母細(xì)胞對(duì)20-45°C溫度刺激的反應(yīng)檢測(cè)圖；
[0026] 其中（A)為對(duì)照組爪贍卵母細(xì)胞對(duì)20-45°C溫度刺激的反應(yīng)軌跡；炬）為表達(dá) DTRC基因的爪贍卵母細(xì)胞對(duì)20-45°C溫度刺激的反應(yīng)；（C)為對(duì)照組和表達(dá)DTRC的爪贍 卵母細(xì)胞對(duì)20-45°C溫度刺激反應(yīng)的電流值；1為表達(dá)DTRC的爪贍卵母細(xì)胞對(duì)20-45°C溫 度刺激反應(yīng)的電流值圖4為表達(dá)DTRC基因的爪贍卵母細(xì)胞對(duì)一系列溫度刺激的反應(yīng)檢測(cè) 圖；
[0027] 其中（A)、做分別代表對(duì)照及表達(dá)DTRC基因的爪贍卵母細(xì)胞對(duì)不同溫度刺激的 反應(yīng)軌跡，（C)為對(duì)照組和表達(dá)DTRC的爪贍卵母細(xì)胞對(duì)不同溫度刺激的反應(yīng)電流值，A代表 表達(dá)DTRC基因的爪贍卵母細(xì)胞對(duì)不同溫度刺激的電流值；與對(duì)照相比，*表示差異顯著，** 表示差異極顯著。
[002引圖5綠盲睹在不同溫度區(qū)域的分布比例柱狀分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。W下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái) 限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作 的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī) 方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售常規(guī)生化試劑。
[0030] 實(shí)施例1DTRC蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)、獲得和分離
[0031] 1.DTRC基因的生物信息學(xué)分析
[0032]利用生物信息學(xué)技術(shù)及軟件對(duì)綠盲睹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行初步的分析，篩選到綠盲睹 DTRC基因cDNA的序列片段。
[0033] 2.供試?yán)ハx(chóng)及組織收集
[0034] 綠盲睹在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所使用新鮮玉米狂eamaysL)及四季豆 任]1336〇1113￥111肖31'13 1.)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為25-28°0，相對(duì)濕度為60%-70%，光照為 16:8(L:D)。取綠盲睹不同齡期的全蟲(chóng)（晚皮24小時(shí)內(nèi)），成蟲(chóng)的觸角、頭、瞭、足、腹、翅等 組織，置于-70°C冰箱等待使用。
[00對(duì)3.RNA的提取
[0036] 昆蟲(chóng)總RNA提取的全部過(guò)程在無(wú)RNA酶條件下進(jìn)行。整個(gè)提取步驟如下所示：
[0037] 1)取-70°C保存的昆蟲(chóng)組織，加入已經(jīng)用液氮預(yù)冷的玻璃勻漿器中，立即向勻漿 器內(nèi)加入1血Trizol試劑，將組織充分研磨磨碎；將研磨好的組織溶液用無(wú)RNA酶的槍頭 轉(zhuǎn)移到無(wú)RNA酶的1. 5mL離屯、管中，暫時(shí)至于冰上。
[003引 2)4°C，12000g離屯、15min，將上清轉(zhuǎn)移到新的無(wú)RNA酶的1. 5mL離屯、管中。
[0039]如將上清在室溫下放置5min后，向離屯、管中加入0.2血氯仿，用手劇烈震蕩15s， 再室溫靜置2-3min。