末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾多肽化合物及合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)生物學(xué)穩(wěn)定多肽方法學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種含有末端側(cè)鏈-尾鏈 連接手性二酸修飾的多肽化合物及其合成方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 多肽類藥物由于其相對于小分子更強(qiáng)的生物分子識別能力，極高的分子進(jìn)化潛能 等特點(diǎn)越來越引起醫(yī)藥行業(yè)的關(guān)注。但同時多肽類藥物存在生物利用度低，難以作用于胞 內(nèi)靶點(diǎn)，組織穿透性差等缺點(diǎn)。
[0003] 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明a-螺旋大約占蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的近30%，這種二級結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)與其 它生物分子的識別過程中起關(guān)鍵作用，故a-螺旋在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有很高的開發(fā)前景。然 而，截取自天然蛋白的短肽因?yàn)榻雍厦鏈p少造成的焓損失以及難以折疊帶來的較高的熵罰 難以與靶點(diǎn)有效的結(jié)合，加上其易被降解使之成藥性很低。
[0004] 自上世紀(jì)八九十年代以來，化學(xué)生物學(xué)家開始嘗試?yán)酶鞣N化學(xué)手段來穩(wěn)定或直 接模擬Ct螺旋。其中穩(wěn)定方法包括利用各種化學(xué)（二硫鍵、酰胺鍵、酰胺鍵、烯烴復(fù)分解 等）共價或者非共價連接側(cè)鏈，或者利用末端修飾成核誘導(dǎo)螺旋。穩(wěn)定螺旋可以提高短肽 與靶點(diǎn)結(jié)合的能力、穩(wěn)定性以及穿透細(xì)胞膜的能力。
[0005] 上述穩(wěn)定方法各有不同程度的缺陷。除了一些方法（離子鍵、二硫鍵）在穩(wěn)定性 上的缺陷，側(cè)鏈-側(cè)鏈連接對多肽與靶點(diǎn)結(jié)合的影響難以預(yù)測，導(dǎo)致篩選成本增加?；谀?端修飾成核誘導(dǎo)螺旋的氫鍵替代策略需要較為繁瑣的氮烷基化模塊的構(gòu)建等等。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多肽化合物， 該含有手性二酸修飾的多肽化合物，具有穩(wěn)定的α-螺旋結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的另一目的是提供 該多肽化合物的合成方法。本發(fā)明的末端手性二酸可以有效的穩(wěn)定短肽螺旋，提高多肽穩(wěn) 定性。同時該方法原料廉價，合成簡便高效。該方法還具有序列耐受性好、擁有額外修飾位 點(diǎn)等優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明首先提供一種含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多肽化合物，其結(jié) 構(gòu)通式如式（I)所示：
[0009]
[0010] 其中，R為任意氨基酸殘基，η為1~2的正整數(shù)，Rp R2連接的碳原子至少一個為 手性碳原子，且氏、R2各自獨(dú)立地選自氫、烷基、氨基或其衍生物取代基和羥基或其衍生物 取代基中的一種。
[0011] 本發(fā)明中，所述的手性二酸選自酒石酸或其衍生物、谷氨酸或其衍生物和天冬氨 酸或其衍生物中的一種。
[0012] 本發(fā)明中，所述的手性二酸為L型酒石酸或其衍生物。
[0013] 本發(fā)明中，所述的手性二酸為手性中心位于N端β位的乙酰化天冬氨酸或其衍生 物。
[0014] 本發(fā)明中，所述多肽的長度大于或等于5個氨基酸。
[0015] 本發(fā)明中，所述R為L型氨基酸或D型氨基酸。
[0016] 本發(fā)明中，所述R為α氨基酸或β氨基酸。
[0017] 本發(fā)明中，所述η為1。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多肽化合物的合 成方法，所述方法包括如下步驟：
[0019] 固相合成末端含手性二酸，倒數(shù)第三位含賴氨酸類似物的多肽，同時脫去羧基和 氨基保護(hù)基，關(guān)環(huán)得到含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多肽化合物。
[0020] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多肽化合 物的合成方法，所述方法包括如下步驟：
[0021] (1)含有手性二酸的多肽的固相合成，固相合成得到的多肽化合物，其結(jié)構(gòu)式如式 (II )所示：
[0022]
[0023] (2)用鈀催化劑同時脫去二酸保護(hù)基和氨基保護(hù)基；
[0024] (3)在PyBOP (六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷）/HOBt (1-羥基苯并 三唑）條件下分子內(nèi)酰胺基關(guān)環(huán)，獲得多肽；
[0025] (4)將步驟（3)所得的多肽從固相切下，經(jīng)分離純化獲得含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接 手性二酸修飾的多肽化合物（I )，通過圓二色譜表征方法驗(yàn)證含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手 性二酸修飾的多肽化合物的螺旋性；
[0026] 其中，所述步驟（2)至步驟（3)的合成路線為：
[0027]
[0028] 本發(fā)明中，當(dāng)R2為Fmoc (芴甲氧羰酰）保護(hù)的氨基時，需要脫除Fmoc (芴甲氧羰 酰），然后保留氨基，?；蛲榛蜻B接Biotin生物素或連接熒光基團(tuán)，其合成路線為：
[0029]
[0030] 本發(fā)明還提供了含有末端側(cè)鏈-尾鏈連接手性二酸修飾的多肽化合物的合成方 法在穩(wěn)定多肽α-螺旋二級結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用。
[0031] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下有益效果：
[0032] 本發(fā)明可很好的穩(wěn)定多肽螺旋，并提高多肽穩(wěn)定性，序列耐受性好。多肽的合成完 全在固相上進(jìn)行，合成過程中無需非天然氨基酸，與氫鍵替代策略相比沒有構(gòu)建較為繁瑣 的氮烷基化模塊，成本低。與側(cè)鏈-側(cè)鏈連接策略相比，僅消耗一個氨基酸殘基，尾環(huán)親水， 其引入對多肽結(jié)合的影響更具可預(yù)測性。本方法末端相對于氫鍵替代策略有一個額外氨 基，可根據(jù)需要進(jìn)行各種修飾。
【附圖說明】：
[0033] 圖 1 為實(shí)施例 1 中 Ac-(cyclo_l, 4)-[isoD_AspAlaAlaDapAlaAla]-NH2 在 H20 及 10% TFE水溶液中⑶圖。
[0034] 圖 2 為實(shí)施例 1 中 Ac-(cyclo_l, 4)-[isoD_AspAlaAlaDapAlaAla]-NH2 熱穩(wěn)定性 圖。
[0035] 圖 3 為實(shí)施例 1 中 Ac-(cyclo-1, 4)-[isoD-AspAlaAlaDapAlaAla] _NH2純化后 HPLC 圖。
[0036] 圖 4 為實(shí)施例 1 中 Ac-(cyclo_l, 4)-[isoD_AspAlaAlaDapAlaAla]-NH2 質(zhì)譜圖。
[0037] 圖 5 為實(shí)施例 2 中（cyclo-1, 4)-[L-tartaric acidAlaAlaDapAlaAla]_NH2 在 H20 中CD圖。
[0038] 圖 6 為實(shí)施例 2 中（cyclo-1, 4)-[L-tartaric acidAlaAlaDapAlaAla]_NH2 純化 后HPLC圖。
[0039] 圖 7 為實(shí)施例 2 中（cyclo-1, 4)-[L-tartaric acidAlaAlaDapAlaAla]_NH2 質(zhì)譜 圖。
[0040] 圖 8 為實(shí)施例 3 中 Ac- (cyclo-1, 4) -[isoD-AspValValDapAlaAla] -NH2粗產(chǎn)物HPLC 圖。
[0041] 圖 9 為實(shí)施例 3 中 Ac- (cyclo-1, 4) -[isoD-AspValValDapAlaAla] -Ml〗在 H20 中 CD 圖。
[0042] 圖 10 為實(shí)施例 3 中 Ac-(cyclo_l, 4)-[isoD_AspValValDapAlaAla]-NH2 純化后 HPLC 圖。
[0043] 圖 11 為實(shí)施例 3 中 Ac-(cyclo_l, 4)-[isoD_AspValValDapAlaAla]-NH2 質(zhì)譜圖。
[0044] 圖 12 為實(shí)施例 4 中 Ac-(cyclo_l, 4)-[isoD_AspGlnValDapAlaAla]-NH2 在 H20 中 CD圖。
[0045] 圖 13 為實(shí)施例 4 中 Ac-(cyclo_l, 4)-[isoD_AspGlnValDapAlaAla]-NH2 純化后 HPLC 圖。
[0046] 圖 14 為實(shí)施例 4 中 Ac-(cyclo_l, 4)-[isoD_AspGlnValDapAlaAla]-NH2 質(zhì)譜圖。
[0047] 圖 15 為實(shí)施例 5 中長肽 HIF-1 α B D-TCD Ac-(cycl〇-l, 4)-[isoD-AspGluLeuDap ArgAlaValAspGln]-NH2 在 H20 中 CD 圖。
[0048] 圖 16 為實(shí)施例 5 中長肽 HIF-1 α B D-TCD Ac-(cycl〇-l, 4)-[isoD-AspGluLeuDap ArgAlaValAspGln]-NH2 純化后 HPLC 圖。
[0049] 圖 17 為實(shí)施例 5 中長肽 HIF-1 α B D-TCD Ac-(cycl〇-l, 4)-[isoD-AspGluLeuDap ArgAlaValAspGln]_NH2 質(zhì)譜圖。
[0050] 圖 18 為實(shí)施例 6 中（cyclo-1, 4)-[L-tartaric acidAlaAlaDabAlaAla]_NH2 在 H20 中CD圖。
[0051] 圖 19 為實(shí)施例 6 中（cyclo-1, 4)-[L-tartaric