豬疾病多聯(lián)快速檢測試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬疾病多聯(lián)快速檢測試紙條及其制備方法。該試紙條采用雙抗原夾心法，利用葡萄球菌A蛋白(SPA)作為捕獲抗原，分別以酵母表達(dá)的豬瘟、藍(lán)耳病、O型口蹄疫病毒主要抗原區(qū)(rED)作為檢測抗原。本發(fā)明試紙條不需專業(yè)人員操作，不需借助任何儀器，檢測耗時短且制備簡單。采集一份血清樣品，可同時檢測豬瘟、豬藍(lán)耳病和豬O型口蹄疫病毒抗體。能夠滿足基層組織、農(nóng)戶對于重大疫病診斷的需求。
【專利說明】
豬疾病多聯(lián)快速檢測試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種動物疫病檢測試劑，具體涉及一種可同時檢測豬瘟、藍(lán)耳病和O型口蹄疫病毒抗體的免疫層析試紙條，本發(fā)明還涉及該試紙條的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]豬痕(classical swine fever，CSF)俗稱爛腸痕，是感染豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。豬瘟?xí)?dǎo)致患病豬發(fā)燒、厭食、腹瀉、死亡等，可造成母豬流產(chǎn)、仔豬大批死亡。豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)由于發(fā)病豬出現(xiàn)耳朵發(fā)紺癥狀，又稱藍(lán)耳病。藍(lán)耳病主要感染繁殖母豬和仔豬，引起免疫抑制，對豬鏈球菌病有誘發(fā)作用?？谔阋?foot and mouth disease，F(xiàn)MD)是一種多宿主傳染病，豬、牛、羊等偶蹄類動物最易感。豬O型口蹄疫發(fā)病率高，傳播迅速，可造成母豬流產(chǎn)、仔豬大批死亡。豬瘟、高致病性豬藍(lán)耳病和口蹄疫是對養(yǎng)豬業(yè)危害最嚴(yán)重的三種豬病，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類傳染病和法定申報動物疫病，我國也將其列為一類傳染病。目前，我國針對這三種豬病采取強制免疫與疫情監(jiān)測相結(jié)合的凈化策略，疫苗免疫成為影響疫病防控的關(guān)鍵，而針對疫苗建立合適的評價手段具有重要意義。
[0003]目前，疫苗免疫效果評價主要依賴ELISA方法。國內(nèi)外有許多動物疫病血清抗體檢測試劑，如美國愛德士(IDEXX)和韓國金諾(JBT)的豬瘟阻斷ELISA試劑盒，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的豬瘟間接ELISA試劑盒。ELISA敏感性高，可平行檢測多份樣品，但是該方法耗時較長，間接ELISA需要約2h，阻斷ELISA需要2?3h。此外，ELISA檢測需要使用酶標(biāo)儀等儀器，只能適用于具有實驗硬件支持的機構(gòu)，無法在臨床一線等簡陋條件下開展免疫監(jiān)測。因此，研發(fā)病毒抗體快速檢測手段對于豬病臨床診斷與免疫監(jiān)測具有重要意義，而基于免疫層析原理的膠體金試紙條檢測技術(shù)操作簡單，檢測時間短，成為重要的血清學(xué)監(jiān)測手段。目前已有類似專利CN103293306B膠體金檢測卡，但是所使用大腸桿菌表達(dá)抗原，而原核表達(dá)系統(tǒng)缺乏蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，會影響構(gòu)象抗原表位形成，并最終影響蛋白活性。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)屬于真核表達(dá)系統(tǒng)，具有完備的蛋白加工修飾機制，且能實現(xiàn)可溶性表達(dá)，是免疫學(xué)研究的重要工具。
[0004]豬瘟病毒(CSFV)是一種囊膜病毒，基因組含有一個大的開放閱讀框(ORF)，編碼一種約3898個氨基酸的多聚蛋白。該多聚蛋白在翻譯加工過程中被蛋白酶加工成12種成熟的病毒蛋白，包括C、E0、E1和E2等4種結(jié)構(gòu)蛋白，其中囊膜糖蛋白E2是主要的保護性抗原蛋白。E2蛋白由ORF 5，端的690位氨基酸開始，到1060位氨基酸終止，共含有370個氨基酸，其4個主要的抗原位點均位于N端的690位和866位氨基酸之間。E2蛋白攜帶豬瘟病毒主要的保護性抗原決定簇，被認(rèn)為是豬瘟基因工程疫苗和血清學(xué)診斷制品研發(fā)的重要靶標(biāo)。藍(lán)耳病病毒(PRRSV)是一種小RNA囊膜病毒，基因組合8個重疊的0RF，其中0RF5-7編碼結(jié)構(gòu)蛋白，分別為GP5、M和N蛋白。其中核衣殼蛋白N在免疫保護方面作用不大，但是保守性好、表達(dá)量高、抗原性強，是藍(lán)耳病診斷檢測的理想靶位?？谔阋卟《?FMDV)無囊膜結(jié)構(gòu)，衣殼蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白組成。研究表明，0型FMDV表面至少含有5個中和抗原表位，其中最重要的3個表位集中在VP 1蛋白。VP 1蛋白誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生，是FMD免疫預(yù)防、遺傳演化的重要研究對象。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可同時檢測豬瘟、藍(lán)耳病、0型口蹄疫病毒抗體的膠體金試紙條。該試紙條不需專業(yè)人員操作，不需借助任何儀器， 檢測耗時短且制備簡單。本發(fā)明試紙條利用葡萄球菌A蛋白(SPA)作為捕獲抗原，可同時結(jié)合多種疫病病原IgG抗體。此外，本發(fā)明試紙條分別以酵母表達(dá)的豬瘟、藍(lán)耳病、豬0型口蹄疫病毒主要抗原區(qū)(rED)為檢測抗原，具備特異性高，重復(fù)性好的特點。
[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0007]—種豬疾病多聯(lián)快速檢測試紙條，試紙條包括底板、包被膜、玻璃纖維膜、吸水紙和樣品墊。其中，包被膜的底面粘貼在底板上，包被膜正面的兩端分別粘貼玻璃纖維膜和吸水紙。在玻璃纖維膜遠(yuǎn)離吸水紙一端的正面粘貼樣品墊。在包被膜上設(shè)有檢測線1、I1、III 和質(zhì)控線，檢測線1、I1、III分別包被豬瘟、藍(lán)耳病、豬〇型口蹄疫病毒rED蛋白，質(zhì)控線包被兔抗豬IgG抗體。所述玻璃纖維膜上噴涂SPA蛋白膠體金顆粒標(biāo)記偶聯(lián)物。
[0008]所述rED蛋白通過酵母表達(dá)系統(tǒng)GS115-pGAPZaA表達(dá)制備，豬瘟病毒主要抗原區(qū) (rEDl)來源于E2基因，豬藍(lán)耳病病毒主要抗原區(qū)(rED2)來源于N基因，豬0型口蹄疫病毒主要抗原區(qū)(rED3)來源于VP1基因。
[0009]本發(fā)明試紙條采用雙抗原夾心法，當(dāng)被檢樣品中含有豬瘟、藍(lán)耳病和豬0型口蹄疫病毒抗體時，則在樣品墊處與SPA膠體金顆粒標(biāo)記偶聯(lián)物結(jié)合，分別形成“SPA偶聯(lián)物-病毒抗體復(fù)合物”，并在吸水紙的作用下向前滲透泳動。當(dāng)復(fù)合物到達(dá)檢測線I，豬瘟病毒抗體與 rEDl蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，形成“SPA偶聯(lián)物-豬瘟病毒抗體-rEDl復(fù)合物”，在包被膜上出現(xiàn)肉眼可見的色帶。當(dāng)復(fù)合物到達(dá)檢測線II，藍(lán)耳病病毒抗體與rED2蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，形成“SPA偶聯(lián)物-藍(lán)耳病病毒抗體-rED2復(fù)合物”，在包被膜上出現(xiàn)肉眼可見的色帶。當(dāng)復(fù)合物到達(dá)檢測線III，0型口蹄疫病毒抗體與rED3蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，形成“SPA偶聯(lián)物-口蹄疫病毒抗體_rED3復(fù)合物，，，在包被膜上出現(xiàn)肉眼可見的色帶。當(dāng)被檢樣品中不含豬瘟、藍(lán)耳病、0型口蹄疫病毒抗體時，SPA膠體金顆粒標(biāo)記偶聯(lián)物泳動至質(zhì)控線，與兔抗豬IgG抗體結(jié)合，在包被膜上出現(xiàn)肉眼可見的色帶。檢測時，吸取待檢血清樣品1滴，加入加樣孔，觀察檢測線1、I1、III和質(zhì)控線是否出現(xiàn)紅色色帶，從而判定動物體內(nèi)是否含有豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒和豬〇型口蹄疫病毒抗體。
[0010]本發(fā)明的積極效果是:
[0011]1、本發(fā)明試紙條結(jié)合膠體金技術(shù)和膜層析技術(shù)，操作便捷，不需要儀器，結(jié)果判讀簡單。相對于ELISA，試紙條原輔料更為簡單，成本低，有益于推廣應(yīng)用。采集一份血清樣品， 可同時檢測豬瘟、豬藍(lán)耳病和豬0型口蹄疫病毒抗體。能夠滿足基層組織、農(nóng)戶對于重大疫病診斷的需求。
[0012]2、本發(fā)明采用酵母真核表達(dá)系統(tǒng)制備試紙條上的檢測用抗原蛋白。酵母為真核表達(dá)宿主，蛋白翻譯后加工修飾機制更完善，表達(dá)蛋白活性尚。
[0013]3、本發(fā)明采用雙抗原夾心法，不受樣品的宿主來源限制，除檢測豬瘟、藍(lán)耳病和豬0型口蹄疫病毒抗體外，還可用于多種動物0型口蹄疫病毒檢測?！靖綀D說明】
[0014]圖1為本發(fā)明試紙條的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖。圖中1:底板;2:包被膜;3:玻璃纖維膜;4: 吸水紙;5:樣品墊。[0〇15]圖2為圖1的正面結(jié)構(gòu)不意圖。圖中6:檢測線1;7:檢測線11;8:檢測線111;9:質(zhì)控線。[〇〇16]圖3為豬瘟病毒主要抗原區(qū)(rEDl)Western blot鑒定圖。[〇〇17]圖4為藍(lán)耳病病毒主要抗原區(qū)(rED2)Western blot鑒定圖。[〇〇18]圖5為0型口蹄疫病毒主要抗原區(qū)(rED3)Western blot鑒定圖?！揪唧w實施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖具體介紹本發(fā)明的豬疾病多聯(lián)快速檢測試紙條及其制備方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，下面描述的實施例只是為了更好地理解本發(fā)明，并不用來限制本發(fā)明。
[0020]如圖1所示，根據(jù)本發(fā)明的豬疾病多聯(lián)快速檢測試紙條包括底板1、包被膜2、玻璃纖維膜3、吸水紙4和樣品墊5。其中，包被膜2粘貼在底板1上面，包被膜2正面的兩端分別粘貼玻璃纖維膜3和吸水紙4。在玻璃纖維膜3遠(yuǎn)離吸水紙4的一端的正面粘貼樣品墊5。底板1 通常為PVC材質(zhì)，包被膜2為硝酸纖維素膜(NC膜)。在玻璃纖維膜3上涂覆有膠體金標(biāo)記SPA 蛋白。
[0021]如圖2所示，在包被膜上設(shè)有檢測線16、檢測線117、檢測線III8和質(zhì)控線9,檢測線 16包被豬瘟病毒主要抗原區(qū)(rEDl)，檢測線117包被藍(lán)耳病病毒主要抗原區(qū)(rED2)，檢測線 III8包被0型口蹄疫病毒主要抗原區(qū)(rED3)，質(zhì)控線9包被兔抗豬IgG抗體。所述檢測線16、 檢測線117、檢測線III8和質(zhì)控線9在包被膜2上呈4條線平行排列，依據(jù)檢測線16、檢測線 117、檢測線III8和質(zhì)控線9是否出現(xiàn)紅色色帶來進行結(jié)果判定。
[0022]下述實施例中的主要原材料來源為:豬瘟病毒主要抗原區(qū)(rEDl )、藍(lán)耳病病毒主要抗原區(qū)(rED2)、0型口蹄疫病毒主要抗原區(qū)(rED3)、豬瘟病毒抗體陽性血清、藍(lán)耳病病毒抗體陽性血清、豬〇型口蹄疫病毒陽性血清為鄭州中道生物技術(shù)有限公司制備并對外提供。 其中3種抗原為畢赤酵母真核系統(tǒng)表達(dá)，3種陽性血清均為商品化疫苗免疫動物制備。其它試劑和材料均是來源于商業(yè)途徑。所述實驗方法，若無特別說明，均為常規(guī)實驗方法。
[0023]本發(fā)明的試紙條的具體制備方法如下:[〇〇24]1.1豬瘟、藍(lán)耳病、0型口蹄疫病毒主要抗原區(qū)(rED)的制備
[0025]根據(jù)所檢測的病原體，檢索NCBI數(shù)據(jù)庫并選擇相應(yīng)參考基因:豬瘟病毒 (AF531433.1)、藍(lán)耳病病毒(EU807840.1)、0型口蹄疫病毒(JQ973889)。設(shè)計3對引物，分別擴增豬瘟、藍(lán)耳病和0型口蹄疫病毒主要抗原區(qū)基因:[〇〇26](1)豬瘟病毒 rEDl:
[0027]p1:5' -TTTGAATTCAGACTAGCCTGCAAGGAAGATTAC-37 ；
[0028]P2:5/-TATGCGGCCGCGTTGAAGTCGAAGCCACACC-37 ；[〇〇29](2)豬藍(lán)耳病病毒rED2:
[0030] P3:5,-TTTGAATTCATGCCAAACAACAACGGTAA-3,；
[0031 ] P4:5,-TTTGCGGCCGCAGCAGATGGGGAAGCAGTGA-37 ；
[0032](3)豬0型口蹄疫病毒rED3:
[0033]P5:57-TTTGAATTCACCAGCACCGGTGAAAGCGC-37 ；
[0034]P6:57-TTTGCGGCCGCCAGGCTCTGTTTCACCGGGG-37。
[0035]根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，對目的基因進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的基因序列由金唯智生物公司合成。構(gòu)建重組酵母菌pGAPZaA-GS115，并在YTO培養(yǎng)基中進行IL體積的發(fā)酵表達(dá)。收集發(fā)酵液上清透析過夜，然后進行蛋白活性分析。如圖3、圖4和圖5所示，三種病毒的主要抗原區(qū)經(jīng)酵母表達(dá)后有很好的抗原活性，經(jīng)Western blot鑒定能與相應(yīng)的陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合。
[0036]1.2包被膜2的制備
[0037]在硝酸纖維素膜上分別噴涂豬瘟病毒主要抗原區(qū)(rEDl)、藍(lán)耳病病毒主要抗原區(qū)(rED2)、0型口蹄疫病毒主要抗原區(qū)(rED3)和兔抗豬IgG抗體，并呈4條線平行排列，分組組成檢測線16、檢測線117、檢測線III8和質(zhì)控線9。37°(:烘干處理2h，置裝有干燥劑的密封袋中保存?zhèn)溆谩?br>[0038]檢測線16:調(diào)試噴膜儀，噴液量為lyL/cm，用包被緩沖液稀釋豬瘟病毒主要抗原區(qū)(rEDl)，濃度為2.5mg/mL，用噴膜儀噴涂劃線。
[0039]檢測線117:調(diào)試噴膜儀，噴液量為lyL/cm，用包被緩沖液稀釋藍(lán)耳病病毒主要抗原區(qū)(rED2)，濃度為3.0mg/mL，用噴膜儀噴涂劃線。
[0040]檢測線118:調(diào)試噴膜儀，噴液量為lyL/cm，用包被緩沖液稀釋O型口蹄疫病毒主要抗原區(qū)(rED3)，濃度為3.0mg/mL，用噴膜儀噴涂劃線。
[0041]質(zhì)控線9:調(diào)試噴膜儀，噴液量為lyL/cm，用包被緩沖液稀釋兔抗豬IgG抗體，濃度為lmg/ mL，用噴膜儀噴涂劃線。
[0042]所述包被緩沖液配方:稱取牛血清白蛋白0.0lg，十二水合磷酸氫二鈉30.072g，磷酸二氫鉀2.176g，用超純水溶解，并定容至1000mL。
[0043]包被膜2上所劃4條線應(yīng)細(xì)致均勻，相鄰兩線間隔0.4-1.0cm。
[0044]1.3玻璃纖維膜3的制備
[0045](I)膠體金溶液的制備
[0046]將雙蒸水置于磁力攪拌器上加熱至沸騰，迅速加入濃度為I%的氯金酸溶液至終濃度為0.02%。煮沸5min，之后加入濃度為I %的檸檬酸三鈉溶液，加樣體積為氯金酸溶液的1.8倍。煮沸1min后，冷卻至室溫，再用雙蒸水調(diào)整氯金酸濃度為0.02%，常溫避光保存?zhèn)溆谩?br>[0047](2)膠體金標(biāo)記SPA玻璃纖維膜3的制備
[0048]用5M碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金溶液PH至7.5-8.0，按60ug抗體/mL膠體金溶液的比例加入SPA蛋白，混勻后靜置5min。再按5 %體積的量加入1 %牛血清白蛋白溶液，混勻后靜置SmirulOOOOr/min離心30min，棄去上清，用標(biāo)記洗滌液洗滌I次。沉淀用十分之一初始膠體金體積的金標(biāo)蛋白保存液溶解，然后按照每毫升溶液鋪1cm2的量噴涂于玻璃纖維膜3上。真空干燥3h，置裝有干燥劑的密封袋中保存?zhèn)溆谩?br>[0049]所述10%牛血清白蛋白溶液:取牛血清白蛋白10g，用雙蒸水定容至1000mL。
[0050]所述標(biāo)記洗滌液:取牛血清白蛋白4g，聚乙二醇80002g，聚乙烯吡咯烷酮2g，蔗糖 2g，Tris 1.211g，用雙蒸水定容至1000mL，并調(diào)節(jié)PH至8.1。[〇〇511 所述金標(biāo)蛋白保存液:取牛血清白蛋白25g，聚乙二醇80005g，Tris 10.2g，氫氧化鈉2.5g，吐溫207.5mL，用雙蒸水定容至1000mL，并調(diào)節(jié)PH至8.5。[〇〇52]1.4大板組條[〇〇53] 各組份規(guī)格(長X寬):底板l(30cmX7.6cm)、包被膜2(30cmX2.0cm)、樣品墊3 (30cmX 3.0cm)、涂覆膠體金標(biāo)記SPA蛋白的玻璃纖維膜3(30cmX0.7cm)和吸水紙4(30cmX 3.2cm) 〇[〇〇54]各組份按組合方式如下:將包被膜2粘貼在底板1上面，包被膜2正面的兩端分別粘貼玻璃纖維膜3和吸水紙4。在玻璃纖維膜3遠(yuǎn)離吸水紙4的一端的正面粘貼樣品墊5。即在底板1上按順序依次粘貼包被膜2、玻璃纖維膜3、吸水紙4、樣品墊5。
[0055]1.5切條
[0056]用切條機將大板切成單條，每條寬度為3_5mm。
[0057]下面再詳細(xì)描述本發(fā)明的試紙條檢測原理和結(jié)果判定。[〇〇58]2.1試紙條檢測原理
[0059]本發(fā)明試紙條采用雙抗原夾心法，當(dāng)被檢樣品中含有豬瘟、藍(lán)耳病和豬0型口蹄疫病毒抗體時，則在樣品墊5處與SPA膠體金顆粒標(biāo)記偶聯(lián)物結(jié)合，分別形成“SPA偶聯(lián)物-病毒抗體復(fù)合物”，并在吸水紙4的作用下向前滲透泳動。當(dāng)復(fù)合物到達(dá)檢測線16,豬瘟病毒抗體與rEDl蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，形成“SPA偶聯(lián)物-豬瘟病毒抗體-rEDl復(fù)合物”，在包被膜2上出現(xiàn)肉眼可見的色帶。當(dāng)復(fù)合物到達(dá)檢測線117,藍(lán)耳病病毒抗體與rED2蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，形成“SPA偶聯(lián)物-藍(lán)耳病病毒抗體-rED2復(fù)合物”，在包被膜2上出現(xiàn)肉眼可見的色帶。當(dāng)復(fù)合物到達(dá)檢測線II18，0型口蹄疫病毒抗體與rED3蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，形成“SPA偶聯(lián)物-口蹄疫病毒抗體_rED3復(fù)合物”，在包被膜2上出現(xiàn)肉眼可見的色帶。當(dāng)SPA膠體金顆粒標(biāo)記偶聯(lián)物泳動至質(zhì)控線9,與兔抗豬IgG抗體結(jié)合，在包被膜上出現(xiàn)肉眼可見的色帶。檢測時，吸取待檢血清樣品1滴，加入加樣孔，觀察檢測線和質(zhì)控線是否出現(xiàn)紅色色帶，從而判定動物體內(nèi)是否含有豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒和豬〇型口蹄疫病毒抗體。
[0060]2.2試紙條結(jié)果判定
[0061]陽性結(jié)果判定:當(dāng)質(zhì)控線9出現(xiàn)紅色條帶，檢測線16、117、III8分別出現(xiàn)紅色條帶時，分別代表豬瘟、藍(lán)耳病和〇型口蹄疫病毒抗體陽性。
[0062]陰性結(jié)果判定:當(dāng)質(zhì)控線9出現(xiàn)紅色條帶，而檢測線I6、II7、III8無紅色條帶出現(xiàn)時，表明豬瘟、藍(lán)耳病和〇型口蹄疫病毒抗體陰性。
[0063]無效結(jié)果:當(dāng)質(zhì)控線9不出現(xiàn)紅色條帶時，檢測結(jié)果無效。
【主權(quán)項】
1.一種豬疾病多聯(lián)快速檢測試紙條，該試紙條包括底板、包被膜、玻璃纖維膜、吸水紙和樣品墊； 其中，包被膜的底面粘貼在底板上，包被膜正面的兩端分別粘貼玻璃纖維膜和吸水紙；在玻璃纖維膜遠(yuǎn)離吸水紙一端的正面粘貼樣品墊;在包被膜上設(shè)有檢測線1、I1、III和質(zhì)控線，檢測線1、I1、III分別包被豬瘟、藍(lán)耳病、豬O型口蹄疫病毒rED蛋白，質(zhì)控線包被兔抗豬IgG抗體，玻璃纖維膜上噴涂SPA蛋白膠體金顆粒標(biāo)記偶聯(lián)物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬疾病多聯(lián)快速檢測試紙條，其中檢測線1、I1、III和質(zhì)控線呈平行布置，相鄰兩線間隔0.4-1.0cm03.—種豬疾病多聯(lián)快速檢測試紙條的制備方法，包括以下步驟: (1)將豬瘟、藍(lán)耳病、豬O型口蹄疫病毒rED蛋白、兔抗豬IgG抗體分別用包被緩沖液稀釋后形成濃度為1.0-3.0mg/mL的噴涂液；用噴膜儀在包被膜上分別噴涂劃線相應(yīng)噴涂液，形成檢測線Ι、Π、ΙΙΙ和質(zhì)控線； (2)將雙蒸水置于磁力攪拌器上加熱至沸騰，迅速加入氯金酸溶液;煮沸之后加入檸檬酸三鈉溶液，加樣體積為氯金酸溶液的1.5-3倍;煮沸10-30分鐘后，冷卻至室溫形成膠體金溶液； (3)用碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金溶液PH值至7.5-8.0，按60ug抗體/mL膠體金溶液的比例加入SPA蛋白，混勻后靜置;再按5 %體積的量加入1 %牛血清白蛋白溶液，混勻后靜置;離心棄去上清，用標(biāo)記洗滌液洗滌;沉淀物用十分之一初始膠體金溶液體積的金標(biāo)蛋白保存液溶解，然后按照每毫升溶液鋪10-15cm2的量噴涂于玻璃纖維膜上，真空干燥后備用； (4)將步驟(I)中制成的包被膜粘貼在底板上面，再將步驟(3)中制成的玻璃纖維膜粘貼在包被膜的一端，將吸水紙粘貼在包被膜的另一端，在玻璃纖維膜遠(yuǎn)離吸水紙的一端的正面粘貼樣品塾； (5)用切條機將步驟(4)中制成的大板切成寬度為3-5mm的單條，形成豬疾病多聯(lián)快速檢測試紙條。
【文檔編號】G01N33/569GK105974116SQ201610544386
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月12日
【發(fā)明人】張 杰, 王軍, 王盼, 卜攀攀, 吳智堅, 王圓圓, 柴素真, 劉玉輝, 李偉豪, 曾小宇, 苗銀萍, 余清衛(wèi), 趙林萍
【申請人】鄭州中道生物技術(shù)有限公司