口蹄疫和偽狂犬病二聯(lián)快速檢測(cè)試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種口蹄疫和偽狂犬病二聯(lián)快速檢測(cè)試紙條及其制備方法。該試紙條基于膜免疫層析的原理，采用膠體金雙抗原夾心法來(lái)制備，以葡萄球菌A蛋白(SPA)為捕獲抗原，以口蹄疫病毒3ABC和偽狂犬病毒GE蛋白為檢測(cè)抗原。在檢測(cè)一份血清樣品時(shí)，可同時(shí)診斷豬口蹄疫和偽狂犬病的野毒感染。該試紙條操作便捷，不需要儀器設(shè)備，結(jié)果判讀簡(jiǎn)單，能夠滿足基層組織、農(nóng)戶對(duì)于重大疫病診斷的需求，對(duì)豬口蹄疫、偽狂犬病防控具有重要意義。
【專利說(shuō)明】
口蹄疫和偽狂犬病二聯(lián)快速檢測(cè)試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明總體涉及動(dòng)物疫病快速診斷試紙條，具體涉及口蹄疫和偽狂犬病二聯(lián)快速檢測(cè)試紙條?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是一種急性、熱性、高度接觸性傳染病， 豬、牛、羊等偶蹄類動(dòng)物最易感。豬口蹄疫的發(fā)病率高，傳播迅速，可造成母豬流產(chǎn)、仔豬大批死亡，帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)對(duì)口蹄疫采取強(qiáng)制免疫策略，每年都會(huì)使用大量的滅活疫苗，并監(jiān)測(cè)疫苗免疫效果，提高動(dòng)物臨床抗體水平。如何區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物和野毒感染動(dòng)物成為影響口蹄疫防控的關(guān)鍵。在口蹄疫疫苗生產(chǎn)過(guò)程中，3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白會(huì)被除去，因此動(dòng)物接種口蹄疫疫苗不產(chǎn)生3ABC抗體。因此，檢測(cè)3ABC蛋白抗體，可作為診斷野毒感染的重要指標(biāo)。
[0003]偽狂犬病(Pseudorabies virus，PRV)是一種豬的急性傳染病，主要侵害生殖系統(tǒng)，可導(dǎo)致母豬不孕、流產(chǎn)、死胎，哺乳仔豬大量死亡，對(duì)成年育肥豬豬可引起生長(zhǎng)停滯、增重緩慢等，是危害養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一。疫苗免疫接種是防控偽狂犬病的重要措施。目前，可用的偽狂犬疫苗均為弱毒活疫苗，能否鑒別免疫動(dòng)物和野毒感染動(dòng)物是偽狂犬病凈化的關(guān)鍵。通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建缺失GE蛋白基因的偽狂犬病毒突變株，所制備的疫苗接種動(dòng)物，不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生GE蛋白抗體。所以，通過(guò)檢測(cè)GE蛋白抗體，可以精確區(qū)分偽狂犬疫苗免疫豬群和野毒感染豬群。
[0004]隨著生物技術(shù)的發(fā)展，目前市面上已經(jīng)有豬口蹄疫3ABC和偽狂犬病GE抗體檢測(cè)試劑盒，但主要是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)法。ELISA操作繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，而且需要儀器，不利于臨床實(shí)地的疾病診斷。之后出現(xiàn)了一種類似專利CN103792373A的膠體金快速檢測(cè)卡，但是只能單一診斷偽狂犬病野毒感染。豬口蹄疫、偽狂犬病對(duì)懷孕母豬和仔豬危害大，嚴(yán)重破壞養(yǎng)豬業(yè)可持續(xù)發(fā)展，研制快速、多聯(lián)的疾病診斷技術(shù)具有重大意義。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于:提供一種動(dòng)物疫病快速診斷試紙條及其制備方法，該試紙條可同時(shí)診斷豬口蹄疫和偽狂犬病的野毒感染。
[0006]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):該試紙條包括底板、包被膜、玻璃纖維膜、吸水紙和樣品墊;其中，包被膜的底面粘貼在底板上，包被膜正面的兩端分別粘貼玻璃纖維膜和吸水紙;在玻璃纖維膜遠(yuǎn)離吸水紙一端的正面粘貼樣品墊;在包被膜上設(shè)有檢測(cè)線1、檢測(cè)線 II和質(zhì)控線，檢測(cè)線I包被口蹄疫病毒3ABC蛋白，檢測(cè)線II包被偽狂犬病毒GE蛋白，質(zhì)控線包被兔抗葡萄球菌A蛋白IgG抗體;玻璃纖維膜上噴涂有葡萄球菌A蛋白(SPA)膠體金顆粒標(biāo)記偶聯(lián)物。
[0007]本發(fā)明試紙條應(yīng)用雙抗原夾心法，當(dāng)被檢樣品中含有3ABC或GE抗體時(shí)，則在樣品墊處與SPA蛋白結(jié)合，形成“SPA抗原-抗體復(fù)合物”，并在吸水紙的作用下向前滲透泳動(dòng)。當(dāng)復(fù)合物到達(dá)檢測(cè)線I，3ABC抗體與口蹄疫病毒3ABC蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，形成“SPA抗原-3ABC抗體-3ABC抗原復(fù)合物”，在包被膜上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的色帶。當(dāng)復(fù)合物到達(dá)檢測(cè)線II，GE 抗體與偽狂犬病毒GE蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，形成“SPA抗原-GE抗體-GE抗原復(fù)合物”，在包被膜上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的色帶。當(dāng)被檢樣品中不含3ABC和GE抗體時(shí)，膠體金標(biāo)記的SPA泳動(dòng)至質(zhì)控線，與兔抗葡萄球菌A蛋白IgG抗體結(jié)合，在包被膜上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的色帶。檢測(cè)時(shí)，吸取待檢血清樣品1滴，滴到樣品墊上，觀察檢測(cè)線1、11和質(zhì)控線是否出現(xiàn)紅色色帶，從而判定動(dòng)物是否被口蹄疫、偽狂犬野毒感染。
[0008]本發(fā)明的積極效果是:
[0009]1、本發(fā)明操作便捷，不需要儀器設(shè)備，結(jié)果判讀簡(jiǎn)單。在檢測(cè)一份血清樣品時(shí)，可同時(shí)診斷豬口蹄疫和偽狂犬病野毒感染。能夠滿足基層組織、農(nóng)戶對(duì)于重大疫病診斷的需求。
[0010]2、本發(fā)明采用雙抗原夾心法，不受樣品的宿主來(lái)源限制，除了診斷豬口蹄疫和偽狂犬病野毒感染，還可用于多種動(dòng)物口蹄疫野毒感染的鑒別診斷。
[0011]3、本發(fā)明將免疫層析法與膠體金技術(shù)相結(jié)合，研制出快速診斷試紙條。相對(duì)于 ELISA，試紙條原輔料更為簡(jiǎn)單，成本低，有益于推廣應(yīng)用?！靖綀D說(shuō)明】
[0012]圖1為本發(fā)明試紙條的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖。圖中1:底板;2:包被膜;3:玻璃纖維膜;4: 吸水紙;5:樣品墊。[〇〇13]圖2為圖1的正面結(jié)構(gòu)示意圖。圖中6:檢測(cè)線1;7:檢測(cè)線II ;8:質(zhì)控線。
[0014]圖3為口蹄疫野毒感染陽(yáng)性和偽狂犬野毒感染陽(yáng)性結(jié)果示意圖。包被膜2上的檢測(cè)線16、檢測(cè)線117和質(zhì)控線8均出現(xiàn)紅色色帶。
[0015]圖4為口蹄疫野毒感染陽(yáng)性和偽狂犬野毒感染陰性結(jié)果示意圖。包被膜2上的檢測(cè)線16和質(zhì)控線8均出現(xiàn)紅色色帶，檢測(cè)線117不出現(xiàn)紅色色帶。
[0016]圖5為偽狂犬野毒感染陽(yáng)性和口蹄疫野毒感染陰性結(jié)果示意圖。包被膜2上的檢測(cè)線117和質(zhì)控線8均出現(xiàn)紅色色帶，檢測(cè)線16不出現(xiàn)紅色色帶。
[0017]圖6為口蹄疫野毒感染陰性和偽狂犬野毒感染陰性結(jié)果示意圖。包被膜2上的質(zhì)控線8出現(xiàn)紅色色帶，檢測(cè)線16和檢測(cè)線117均不出現(xiàn)紅色色帶。
[0018]圖7為本發(fā)明檢測(cè)無(wú)效結(jié)果示意圖。包被膜2上的質(zhì)控線8、檢測(cè)線16和檢測(cè)線117 均不出現(xiàn)紅色色帶。
[0019]圖8為本發(fā)明檢測(cè)無(wú)效結(jié)果示意圖。包被膜2上的質(zhì)控線8不出現(xiàn)紅色色帶，檢測(cè)線 16和檢測(cè)線117出現(xiàn)紅色色帶。
[0020]圖9為本發(fā)明檢測(cè)無(wú)效結(jié)果示意圖。包被膜2上的質(zhì)控線8和檢測(cè)線16均不出現(xiàn)紅色色帶，檢測(cè)線117出現(xiàn)紅色色帶。
[0021]圖10為本發(fā)明檢測(cè)無(wú)效結(jié)果示意圖。包被膜2上的質(zhì)控線8和檢測(cè)線117均不出現(xiàn)紅色色帶，檢測(cè)線16出現(xiàn)紅色色帶。【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合附圖具體介紹本發(fā)明的口蹄疫和偽狂犬病二聯(lián)快速檢測(cè)試紙條及其制備方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，下面描述的實(shí)施例只是為了更好地理解本發(fā)明，并不用來(lái)限制本發(fā)明。
[0023]如圖1所示，根據(jù)本發(fā)明的口蹄疫和偽狂犬病二聯(lián)快速檢測(cè)試紙條包括底板1、包被膜2、玻璃纖維膜3、吸水紙4以及樣品墊5。其中，包被膜2粘貼在底板1上面，包被膜2正面的兩端分別粘貼玻璃纖維膜3和吸水紙4。在玻璃纖維膜3遠(yuǎn)離吸水紙4的一端的正面粘貼樣品墊5。底板1通常為PVC材質(zhì)，包被膜2為硝酸纖維素膜(NC膜)。在玻璃纖維膜3上涂覆有膠體金標(biāo)記SPA蛋白。
[0024]如圖2所示，在包被膜2上設(shè)有檢測(cè)線16、檢測(cè)線117和質(zhì)控線8。檢測(cè)線16包被口蹄疫病毒3ABC蛋白，檢測(cè)線117包被偽狂犬病毒GE蛋白，質(zhì)控線8包被兔抗葡萄球菌A蛋白IgG 抗體。所述檢測(cè)線16、檢測(cè)線117和質(zhì)控線8在包被膜2上呈3條線平行排列，依據(jù)檢測(cè)線16、 檢測(cè)線117和質(zhì)控線8是否出現(xiàn)紅色色帶來(lái)進(jìn)行結(jié)果判定。[〇〇25]下述實(shí)施例中的主要原材料來(lái)源為:口蹄疫病毒3ABC蛋白、偽狂犬病毒GE蛋白由鄭州中道生物技術(shù)有限公司制備。其它試劑和材料均可來(lái)源于商業(yè)途徑。所述的實(shí)驗(yàn)方法， 若無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法。[〇〇26]本發(fā)明所述試紙條采用3條帶顯色的膠體金免疫層析法制備，顯示條帶為紅色色帶，具體制備方法如下:[〇〇27]1.1包被膜2的制備[〇〇28]在硝酸纖維素膜上分別噴涂口蹄疫病毒3ABC蛋白、偽狂犬病毒GE蛋白和兔抗葡萄球菌A蛋白IgG抗體，并呈3條線平行排列，分組組成檢測(cè)線16、檢測(cè)線117和質(zhì)控線8。37°(:烘干處理2小時(shí)，置裝有干燥劑的密封袋中保存?zhèn)溆?。[〇〇29] 檢測(cè)線16:調(diào)試噴膜儀，噴液量為lul/cm，用包被緩沖液稀釋口蹄疫病毒3ABC蛋白，濃度為2.5mg/mL，用噴膜儀噴涂劃線。
[0030]檢測(cè)線117:調(diào)試噴膜儀，噴液量為lul/cm，用包被緩沖液稀釋偽狂犬病毒GE蛋白， 濃度為3.0mg/mL，用噴膜儀噴涂劃線。
[0031]質(zhì)控線8:調(diào)試噴膜儀，噴液量為lul/cm，用包被緩沖液稀釋兔抗葡萄球菌A蛋白 IgG抗體，濃度為lmg/mL，用噴膜儀噴涂劃線。[〇〇32]所述包被緩沖液配方:稱取牛血清白蛋白0.0lg，十二水合磷酸氫二鈉30.072g，磷酸二氫鉀2.176g，用超純水溶解，并定容至1000mL。[〇〇33]包被膜2上所劃3條線應(yīng)細(xì)致均勻，相鄰兩線間隔0.4-1.0cm。[〇〇34]1.2玻璃纖維膜3的制備[〇〇35](1)膠體金溶液的制備
[0036]將雙蒸水置于磁力攪拌器上加熱至沸騰，迅速加入濃度為1 %的氯金酸溶液至終濃度為〇.02%。煮沸5分鐘，之后加入濃度為1 %的檸檬酸三鈉溶液，加樣體積為氯金酸溶液的1.8倍。煮沸10分鐘后，冷卻至室溫，再用雙蒸水調(diào)整氯金酸濃度為0.02%，常溫避光保存?zhèn)溆?。[〇〇37](2)膠體金標(biāo)記SPA玻璃纖維膜3的制備[〇〇38]用5M碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金溶液PH值至7.5-8.0，按60ug抗體/mL膠體金溶液的比例加入SPA蛋白，混勻后靜置5分鐘。再按5 %體積的量加入10 %牛血清白蛋白溶液，混勻后靜置5 分鐘。lOOOOrpm離心30分鐘，棄去上清，用標(biāo)記洗滌液洗滌1次。沉淀用十分之一初始膠體金體積的金標(biāo)蛋白保存液溶解，然后按照每毫升溶液鋪l〇cm2的量噴涂于玻璃纖維膜3上。真空干燥3小時(shí)，置裝有干燥劑的密封袋中保存?zhèn)溆谩〇〇39]所述10%牛血清白蛋白溶液:取牛血清白蛋白100g，用雙蒸水定容至1000mL。[〇〇4〇]所述標(biāo)記洗滌液:取牛血清白蛋白4g，聚乙二醇80002g，聚乙烯吡咯烷酮2g，蔗糖 2g，Tris 1.211g，用雙蒸水定容至1000mL，并調(diào)節(jié)PH至8.1。[〇〇411 所述金標(biāo)蛋白保存液:取牛血清白蛋白25g，聚乙二醇80005g，Tris 10.2g，氫氧化鈉2.5g，吐溫207.5mL，用雙蒸水定容至1000mL，并調(diào)節(jié)PH至8.5。[〇〇42]1.3大板組條
[0043]各組份規(guī)格(長(zhǎng)X寬):底板1(30〇1^7.6〇11)、包被膜2(30〇11\2.0〇11)、樣品墊5 (30cmX 3.0cm)、涂覆膠體金標(biāo)記SPA蛋白的玻璃纖維膜3(30cmX0.7cm)和吸水紙4(30cmX 3.2cm) 〇
[0044]各層的組合方式如下:將包被膜2粘貼在底板1上面，包被膜2正面的兩端分別粘貼玻璃纖維膜3和吸水紙4。在玻璃纖維膜3遠(yuǎn)離吸水紙4的一端的正面粘貼樣品墊5。即在底板 1上按順序依次粘貼包被膜2、玻璃纖維膜3、吸水紙4、樣品墊5。
[0045]1.4切條
[0046]用切條機(jī)將大板切成單條，每條寬度為3-5cm。
[0047]下面再詳細(xì)描述本發(fā)明的試紙條檢測(cè)原理和結(jié)果判定。[〇〇48]2.1試紙條檢測(cè)原理
[0049]本發(fā)明試紙條應(yīng)用雙抗原夾心法，用SPA蛋白作為捕獲抗原，用口蹄疫病毒3ABC和偽狂犬病毒GE蛋白作為檢測(cè)抗原。其原理是當(dāng)被檢樣品中含有3ABC或GE抗體時(shí)，則在樣品墊5處與SPA蛋白結(jié)合，形成“SPA抗原-抗體復(fù)合物”，并在吸水紙4的作用下向前滲透泳動(dòng)。 當(dāng)復(fù)合物到達(dá)檢測(cè)線16，3ABC抗體與口蹄疫病毒3ABC蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，形成“SPA抗原-3ABC抗體-3ABC抗原復(fù)合物”，在包被膜2上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的色帶。當(dāng)復(fù)合物到達(dá)檢測(cè)線117， GE抗體與偽狂犬病毒GE蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，形成“SPA抗原-GE抗體-GE抗原復(fù)合物”，在NC 膜上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的色帶。當(dāng)溶液泳動(dòng)至質(zhì)控線8，與兔抗葡萄球菌A蛋白IgG抗體結(jié)合，在包被膜2上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的色帶。檢測(cè)時(shí)，吸取待檢血清樣品1滴，滴到樣品墊5上，觀察檢測(cè)線16、117和質(zhì)控線8是否出現(xiàn)紅色色帶，從而判定動(dòng)物是否被口蹄疫、偽狂犬病野毒感染。
[0050] 2.2試紙條結(jié)果判定[0051 ]下面結(jié)合附圖，具體介紹本發(fā)明試紙條的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。
[0052] 如圖3所示，包被膜2上的檢測(cè)線16、檢測(cè)線117和質(zhì)控線8均出現(xiàn)紅色色帶，則口蹄疫和偽狂犬病均為野毒感染陽(yáng)性。[〇〇53] 如圖4所示，包被膜2上的檢測(cè)線16和質(zhì)控線8均出現(xiàn)紅色色帶，檢測(cè)線117不出現(xiàn)紅色色帶，則口蹄疫野毒感染陽(yáng)性，而偽狂犬病野毒感染陰性。
[0054] 如圖5所示，包被膜2上的檢測(cè)線117和質(zhì)控線8均出現(xiàn)紅色色帶，檢測(cè)線16不出現(xiàn)紅色色帶，則口蹄疫野毒感染陽(yáng)性和偽狂犬病野毒感染陰性。
[0055] 如圖6所示，包被膜2上的質(zhì)控線8出現(xiàn)紅色色帶，檢測(cè)線16和檢測(cè)線117均不出現(xiàn)紅色色帶，則口蹄疫和偽狂犬病均為野毒感染陰性；[〇〇56]當(dāng)出現(xiàn)以下幾種情況時(shí)，檢測(cè)結(jié)果無(wú)效:包被膜2上的質(zhì)控線8、檢測(cè)線16和檢測(cè)線 117均不出現(xiàn)紅色色帶(圖7);包被膜2上的質(zhì)控線8不出現(xiàn)紅色色帶，檢測(cè)線16和檢測(cè)線117出現(xiàn)紅色色帶(圖8);包被膜2上的質(zhì)控線8和檢測(cè)線16不出現(xiàn)紅色色帶，檢測(cè)線117出現(xiàn)紅色色帶(圖9);包被膜2上的質(zhì)控線8和檢測(cè)線117不出現(xiàn)紅色色帶，檢測(cè)線16出現(xiàn)紅色色帶 (圖 10)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種口蹄疫和偽狂犬病二聯(lián)快速檢測(cè)試紙條，該試紙條包括底板、包被膜、玻璃纖維 膜、吸水紙和樣品墊；其中，包被膜的底面粘貼在底板上，包被膜正面的兩端分別粘貼玻璃纖維膜和吸水紙； 在玻璃纖維膜遠(yuǎn)離吸水紙一端的正面粘貼樣品墊;在包被膜上設(shè)有檢測(cè)線1、檢測(cè)線II和質(zhì) 控線，檢測(cè)線I包被口蹄疫病毒3ABC蛋白，檢測(cè)線II包被偽狂犬病毒GE蛋白，質(zhì)控線包被兔 抗葡萄球菌A蛋白IgG抗體;玻璃纖維膜上噴涂有葡萄球菌A蛋白膠體金顆粒標(biāo)記偶聯(lián)物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口蹄疫和偽狂犬病二聯(lián)快速檢測(cè)試紙條，其中檢測(cè)線1、檢測(cè) 線II和質(zhì)控線三條線呈平行布置，相鄰兩線間隔0.4-1.0cm。3.—種口蹄疫和偽狂犬病二聯(lián)快速檢測(cè)試紙條的制備方法，包括以下步驟:(1)將口蹄疫病毒3ABC蛋白、偽狂犬病毒GE蛋白、兔抗葡萄球菌A蛋白IgG抗體分別用包 被緩沖液稀釋后形成濃度為1.0-3.0mg/mL的噴涂液;用噴膜儀在包被膜上分別噴涂劃線相 應(yīng)噴涂液，形成檢測(cè)線1、檢測(cè)線II和質(zhì)控線；(2)將雙蒸水置于磁力攪拌器上加熱至沸騰，迅速加入氯金酸溶液;煮沸之后加入檸檬 酸三鈉溶液，加樣體積為氯金酸溶液的1.5-3倍;煮沸10-30分鐘后，冷卻至室溫形成膠體金 溶液；(3)用碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金溶液PH值至7.5-8.0，按60ug抗體/mL膠體金溶液的比例加入 SPA蛋白，混勻后靜置;再按5 %體積的量加入10 %牛血清白蛋白溶液，混勻后靜置;離心棄 去上清，用標(biāo)記洗滌液洗滌;沉淀物用十分之一初始膠體金溶液體積的金標(biāo)蛋白保存液溶 解，然后按照每毫升溶液鋪l〇-15cm2的量噴涂于玻璃纖維膜上，真空干燥后備用；(4)將步驟(1)中制成的包被膜粘貼在底板上面，再將步驟(3)中制成的玻璃纖維膜粘 貼在包被膜的一端，將吸水紙粘貼在包被膜的另一端，在玻璃纖維膜遠(yuǎn)離吸水紙的一端的 正面粘貼樣品塾；(5)用切條機(jī)將步驟(4)中制成的大板切成寬度為3-5cm的單條，形成口蹄疫和偽狂犬 病二聯(lián)快速檢測(cè)試紙條。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK105954514SQ201610465660
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月21日
【發(fā)明人】張 杰, 王軍, 王盼, 卜攀攀, 曾小宇, 苗銀萍, 任寶紅, 魯龍, 余清衛(wèi), 趙林萍
【申請(qǐng)人】鄭州中道生物技術(shù)有限公司