本發(fā)明涉及血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)Asia I型口蹄疫的膠體金試紙及其制備方法。

背景技術(shù)：

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由FMD病毒(FMDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性的傳染病。該病毒主要分為A型、O型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型和Asia I型7種血清型，各血清型之間不能產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)。此外，F(xiàn)MDV還包括許多亞型和突變株，目前已發(fā)現(xiàn)80多種亞型，同一血清型內(nèi)的不同亞型或分離株的抗原性也有不同程度的差異，血清學(xué)交叉反應(yīng)的程度也各不相同，這種特性給FMD的診斷和防制造成一定的困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)Asia I型口蹄疫的膠體金試紙及其制備方法，能夠?qū)崟r(shí)快速診斷Asia I型口蹄疫，且準(zhǔn)確度較高。

為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

一種用于檢測(cè)Asia I型口蹄疫的膠體金試紙，包括底板，底板的頂部設(shè)置有檢測(cè)層，檢測(cè)層上設(shè)置有檢測(cè)線和對(duì)照線，檢測(cè)層的頂部靠近對(duì)照線的一側(cè)設(shè)置有吸收層，靠近檢測(cè)線的一側(cè)設(shè)置有免疫金標(biāo)墊，免疫金標(biāo)墊的頂部設(shè)置有樣品墊；

免疫金標(biāo)墊上涂覆有膠體金顆粒，該膠體金顆粒上結(jié)合有proteinG，檢測(cè)線上涂覆/浸潤(rùn)有Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒相對(duì)應(yīng)的純化蛋白，對(duì)照線上涂覆/浸潤(rùn)有兔IgG；

所述免疫金標(biāo)墊上膠體金與proteinG的比例為2×10⁴:1～2。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述免疫金標(biāo)墊上膠體金與proteinG的比例為2×10⁴:1.3。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述免疫金標(biāo)墊的吸附比例為10～50μL/cm。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述檢測(cè)線上涂覆/浸潤(rùn)有濃度為0.5～1mg/mL的Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述對(duì)照線上涂覆/浸潤(rùn)有濃度為0.8～1.5mg/mL的免疫兔血清IgG。

一種用于檢測(cè)Asia I型口蹄疫的試紙的制備方法，包括以下步驟：

A、制備LgG，制備并純化膠體金，將膠體金與proteinG按質(zhì)量比為2×10⁴:1～1.5反應(yīng)，得到免疫膠體金，將濃度為1～1.2g/ml的免疫膠體金按吸附比為10～50μL/cm吸附在玻璃膜上，得到免疫金標(biāo)墊；

B、使用硝酸纖維膜作為檢測(cè)層基材，在檢測(cè)線上噴涂濃度為0.5～1mg/mL的Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒，在對(duì)照線上噴涂濃度為0.8～1.5mg/mL的免疫兔血清IgG；

在檢測(cè)層的中部距檢測(cè)線0.3～1cm處，噴涂對(duì)照線，噴膜量為5～15μl/1cm進(jìn)行噴膜，噴膜后干燥得到檢測(cè)層；

C、在底板1的頂部設(shè)置檢測(cè)層，并將檢測(cè)層；壓平，將吸收層一部分固定在底板上，一部分固定在檢測(cè)層；上靠近對(duì)照線的部分，將免疫金標(biāo)墊的一側(cè)固定在底板上，另一側(cè)固定在檢測(cè)層；靠近檢測(cè)線的一側(cè)，樣品墊的一側(cè)固定在底板上，樣品墊的一側(cè)固定在底板上，另一側(cè)固定在免疫金標(biāo)墊上。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，免疫金標(biāo)墊的制備方法為：使用濃度為0.1M的K₂CO₃調(diào)整膠體金的pH值為5.9，按質(zhì)量比為2×10⁴::1～1.5將相應(yīng)的proteinG溶液加入膠體金中放置30min后，在轉(zhuǎn)速為10000r/min、溫度為4℃的條件下離心30min，將沉淀溶于重懸液中混合均勻，用玻璃膜吸附后晾干。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述檢測(cè)線上Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒的濃度為0.8mg/mL，所述對(duì)這線上免疫兔血清IgG的濃度為1mg/mL。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)本發(fā)明的一種用于檢測(cè)Asia I型口蹄疫的膠體金試紙，檢測(cè)層上設(shè)置有檢測(cè)線和對(duì)照線，檢測(cè)層靠近檢測(cè)線的一側(cè)設(shè)置有免疫金標(biāo)墊，免疫金標(biāo)墊的頂部設(shè)置有樣品墊。免疫金標(biāo)墊包括膠體金顆粒，該膠體金顆粒上結(jié)合有proteinG標(biāo)記物，檢測(cè)線涂覆/浸潤(rùn)有Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒，對(duì)照線上涂覆/浸潤(rùn)有兔IgG，免疫金標(biāo)墊上膠體金與proteinG的比例為2×10⁴:1～2，檢測(cè)線上涂覆/浸潤(rùn)有濃度為0.5～1mg/mL的Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒。

在使用時(shí)，直接將血液樣品稀釋后在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)，如果血液樣品中含有Asia I型口蹄疫抗體，血液樣品中的抗體與免疫金標(biāo)墊中proteinG修飾的膠體金結(jié)合形成復(fù)合物，與檢測(cè)線上Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒結(jié)合形成紫紅色線條，繼續(xù)前行，未與抗原結(jié)合的抗體攜帶重組蛋白proteinG與對(duì)照線中的IgG抗體形成紫紅色線條。

將檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)的CFT、VNT凝集試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散和ELISA進(jìn)行比較，結(jié)果基本一致，且本發(fā)明的血液未經(jīng)過純化，說(shuō)明本發(fā)明的準(zhǔn)確度較高，且檢測(cè)條件不高，穩(wěn)定性較好，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、結(jié)果清楚，易于判斷和保存，且無(wú)需大型儀器設(shè)備，成本較低，能夠用于臨床快速實(shí)時(shí)檢測(cè)，快速檢測(cè)流行病，便于快速采取相應(yīng)措施，避免疾病大規(guī)模爆發(fā)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中用于檢測(cè)Asia I型口蹄疫的膠體金試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖中：1-底板，2-樣品墊，3-免疫金標(biāo)墊，4-檢測(cè)層，5-吸收層，6-檢測(cè)線，7-對(duì)照線。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

參見圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供一種用于檢測(cè)Asia I型口蹄疫的膠體金試紙，包括采用PVC制成的底板1，底板1的頂部設(shè)置有檢測(cè)層4，檢測(cè)線6上設(shè)置有檢測(cè)線6和對(duì)照線7，檢測(cè)層4的頂部靠近對(duì)照線7的一側(cè)設(shè)置有吸收層5，靠近檢測(cè)線6的一側(cè)設(shè)置有免疫金標(biāo)墊3，免疫金標(biāo)墊3的頂部設(shè)置有樣品墊2。

免疫金標(biāo)墊3包括膠體金顆粒，該膠體金顆粒上結(jié)合有proteinG標(biāo)記物，檢測(cè)線6涂覆/浸潤(rùn)有Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒，對(duì)照線7上涂覆/浸潤(rùn)有兔IgG，本實(shí)施例中，免疫金標(biāo)墊3上膠體金與proteinG的比例為2×10⁴:1～2，免疫金標(biāo)墊3上膠體金與proteinG的最佳比例為2×10⁴:1.3，免疫金標(biāo)墊3的吸附比例為10～50μL/cm。

檢測(cè)線6上涂覆/浸潤(rùn)有濃度為0.5～1mg/mL的Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒，對(duì)照線7上涂覆/浸潤(rùn)有濃度為0.8～1.5mg/mL的免疫兔血清IgG。

本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)Asia I型口蹄疫的膠體金試紙的制備方法，包括以下步驟：

S1、制備IgG：用proteinG采用多點(diǎn)注射法免疫陰性家兔2只，每隔2周加強(qiáng)免疫1次，共進(jìn)行3次，最后一次免疫10天后采血備用，放入4℃冰箱過夜沉淀，將沉淀的全血在轉(zhuǎn)速為4000r/min的條件下離心10min，取上清即為血清。將20ml血清中加入20ml生理鹽水中，再加入10ml飽和(NH₄)₂SO₄溶液，混合均勻后靜置30min，然后在轉(zhuǎn)速為3000r/min的條件下離心20min，棄去沉淀除去纖維蛋白，取上清液。

b、在上清液中加入30ml(NH₄)₂SO₄飽和溶液，混合均勻后靜置30min，在轉(zhuǎn)速為3000r/min的條件下離心20min，棄上清液，取沉淀物，向沉淀物中加20ml生理鹽水，10ml(NH₄)₂SO₄飽和溶液，混合均勻后靜置30min，3000r/min離心20min，棄上清。

重復(fù)b步驟2～3次后，向純化后的沉淀中加入10ml生理鹽水并透析，先放入純水中透析過夜除鹽，然后放入生理鹽水中在4℃下透析24h，透析期間每2～3h換液一次。

檢測(cè)透析是否完全：檢測(cè)試劑為濃度為1％的BaCl₂(用于檢測(cè)SO₄^2-)或以納氏試劑(用于檢測(cè)NH₄⁺)：取3～4ml透析液，加入檢測(cè)試劑1～2滴，出現(xiàn)磚紅色即認(rèn)為有NH₄⁺存在)，出現(xiàn)白色沉淀即有SO₄^2-存在，透析至無(wú)沉淀出現(xiàn)后，離心去沉淀(去除雜蛋白)，上清液即為純化后的兔IgG。

S2、制備膠體金：取1g氯金酸溶于100ml三蒸水中制成濃度為1％的氯金酸溶液，向99ml水中加入1ml 1％的氯金酸水溶液，加熱至沸騰，邊攪拌邊逐滴加入1ml濃度為1％的檸檬酸鈉三鈉水溶液，待顏色變紅后繼續(xù)煮沸5min，冷卻后加入蒸餾水至100ml，即為膠體金放置于溫度為4℃的條件下保存。

S3、判斷proteinG的最小蛋白用量：取一個(gè)1.5ml離心管，加入1ml膠體金，用0.1M的K₂CO₃調(diào)節(jié)PH值至8；取96孔板，每孔加入100μL的膠體金，取10μL濃度為5mg/ml的proteinG加入990μL的蒸餾水中，取1～20μLproteinG溶液分別加入每孔混勻，室溫靜置15min；每孔加入濃度為10％的Nacl溶液20μL混合均勻，在室溫下放置10min，觀察膠體金顏色變化，記錄顏色仍保持紅色的最小蛋白用量，重復(fù)3次，取平均值，本實(shí)施例中，最小蛋白用量為10μL，即每100μL濃度為1g/100ml的膠體金至少需要10μL濃度為0.05mg/ml的proteinG，膠體金與proteinG的質(zhì)量比為2×10⁴:1，最佳膠體金與proteinG的比例為2×10⁴:1.3，在實(shí)際使用時(shí)，可以根據(jù)需要調(diào)整膠體金和proteinG的比例，可以為2×10⁴:1～1.5。

S4、制備proteinG修飾的膠體金和免疫金標(biāo)墊3：將相應(yīng)比例的proteinG溶液加入膠體金中放置30min，再加入1％BSA(牛血清白蛋白)放置30min，在轉(zhuǎn)速為10000r/min、溫度為4℃的條件下離心30min，取沉淀溶于重懸液中溶解，均勻的鋪在玻璃纖維膜上，吸附比為5～15μL/cm，最佳吸附比為10μL/cm，得到免疫金標(biāo)墊3。

S5、制備檢測(cè)層4

使用硝酸纖維膜作為檢測(cè)層4基材，在檢測(cè)層4上標(biāo)記檢測(cè)線6和對(duì)照線7，檢測(cè)線6與對(duì)照線7之間的距離為0.3～1cm(最優(yōu)為0.5cm)，且對(duì)照線7位于纖維素膜的中段，在檢測(cè)線6上噴涂濃度為0.5～1mg/mL(最優(yōu)為0.8mg/mL)的Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒；在對(duì)照線7上噴涂兔IgG，噴涂量為10μl/1cm。

S6、制備樣品墊2：以玻璃纖維膜作為樣品墊2的基材，將20mM的PB(磷酸鹽緩存溶液)、1％的吐溫20、1％的BSA和2.5％的蔗糖溶于100ml三蒸水中并過濾得到樣品液，把玻璃纖維膜浸泡于該樣品液中，完全浸潤(rùn)后取出并晾干。

S7、在底板1的頂部設(shè)置檢測(cè)層4，并將檢測(cè)層4壓平，將吸收層5(吸水紙)一部分固定在底板1上，一部分固定在檢測(cè)層4上靠近對(duì)照線7的部分，將免疫金標(biāo)墊3的一側(cè)固定在底板1上，另一側(cè)固定在檢測(cè)層4靠近檢測(cè)線6的一側(cè)，樣品墊2的一側(cè)固定在底板1上，樣品墊2的一側(cè)固定在底板1上，另一側(cè)固定在免疫金標(biāo)墊3上。

本發(fā)明膠體金試紙?jiān)谑褂脮r(shí)，先將樣品稀釋，然后將膠體金試紙的樣品墊2端插入樣品中，樣品墊2上設(shè)置有液面線，樣品的液面不能沒過液面線，當(dāng)吸收層5完全被液體浸潤(rùn)后，取出試紙條，平放后5～15分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。

如果血液樣品中含有Asia I型口蹄疫抗體，血液樣品中的抗體與免疫金標(biāo)墊3中proteinG修飾的膠體金結(jié)合形成復(fù)合物，與檢測(cè)線6上Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒結(jié)合形成紫紅色線條，繼續(xù)前行，未與抗原結(jié)合的抗體攜帶重組蛋白proteinG與對(duì)照線7中的IgG抗體形成紫紅色線條。

如果對(duì)照線7不出現(xiàn)紫紅條帶則說(shuō)明該試紙條失效，如果檢測(cè)血液樣品中不含有Asia I型口蹄疫相關(guān)抗體，則檢測(cè)線6處不會(huì)出現(xiàn)紫紅色條帶，而對(duì)照線7處必定仍出現(xiàn)紫紅色條帶。

本發(fā)明不局限于上述實(shí)施方式，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本說(shuō)明書中未作詳細(xì)描述的內(nèi)容屬于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)。