檢測(cè)犬惡絲蟲抗體膠體金免疫層析試紙條及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種檢測(cè)犬惡絲蟲抗體膠體金免疫層析試紙條及制備方法，其特點(diǎn)在于：利用膠體金標(biāo)記的金黃色葡萄球菌A蛋白制作本發(fā)明的金標(biāo)抗體，即金標(biāo)墊；再利用犬惡絲蟲MTFP蛋白，作為診斷抗原包被硝酸纖維膜（NC膜），作為檢測(cè)線（T線），兔抗SPA抗體作為質(zhì)控線(C線)，以上為基礎(chǔ)研制出本發(fā)明夾心法檢測(cè)犬惡絲蟲血清抗體的膠體金免疫層析試紙條。本發(fā)明具有方便快捷、試驗(yàn)結(jié)果肉眼可見，不需要特殊實(shí)驗(yàn)儀器，不需專業(yè)技術(shù)人員操作等特點(diǎn)，更適合基層單位現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。具有高特異性，高敏感性，本發(fā)明利用犬惡絲蟲的重組蛋白MTFP作為診斷性抗原，比全蛋白提高了檢測(cè)的特異性；又采用金黃色葡萄球菌A蛋白作為金標(biāo)蛋白，由于其可以與抗體的Fc段發(fā)生特異性結(jié)合，兩者的夾心結(jié)合既保證了本發(fā)明試紙條的特異性又保證了敏感性。
【專利說明】
檢測(cè)犬惡絲蟲抗體膠體金免疫層析試紙條及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明提供一種檢測(cè)犬惡絲蟲血清抗體的膠體金試紙條檢測(cè)方法，利用膠體金免疫層析技術(shù)檢測(cè)犬血清內(nèi)的惡絲蟲抗體，屬于免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]犬惡絲蟲病在我國幾乎各地均有發(fā)生，該病不僅可引起犬、狐猝死，還能嚴(yán)重影響狐的毛皮質(zhì)量，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，并且已成為潛在的嚴(yán)重威脅人類健康的新發(fā)人獸共患傳染病病而受到廣泛關(guān)注和重視，迄今為止，該病仍沒有理想的診斷治療方法。
[0003]犬惡絲蟲MTFP基因編碼肌球蛋白馬達(dá)域，即Π型肌球蛋白。作為細(xì)胞骨架的分子馬達(dá)，是一種多功能蛋白質(zhì)，其主要功能是為肌肉收縮提供動(dòng)力。與編碼馬來絲蟲肌球蛋白尾家族蛋白部分序列同源性為88%。已有研究表明MTFP編碼的蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，是診斷犬惡絲蟲較好的診斷性抗原。目前，國內(nèi)外未見利用MTFP蛋白作為診斷抗原建立的膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]
本發(fā)明的目的是公開一種高特異性、高靈敏度、方便快捷的檢測(cè)犬惡絲蟲血清抗體的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法，適合于臨床診斷及大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。
[0005]本發(fā)明所述的檢測(cè)犬惡絲蟲抗體膠體金免疫層析試紙條及制備方法，其特點(diǎn)在于:利用膠體金標(biāo)記的金黃色葡萄球菌A蛋白制作本發(fā)明的金標(biāo)抗體，即金標(biāo)墊;再利用犬惡絲蟲MTFP蛋白，作為診斷抗原包被硝酸纖維膜(NC膜)，作為檢測(cè)線(T線)，兔抗SPA抗體作為質(zhì)控線(C線)，以上為基礎(chǔ)研制出本發(fā)明夾心法檢測(cè)犬惡絲蟲血清抗體的膠體金免疫層析試紙條。其中:
一、重組蛋白MTFP的克隆、表達(dá)及純化
1、引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)目的基因序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物:
F2:5 ’ -GGATCCCAACTTACGCAGGAAGCA- 3 ’，下劃線為 BamH I 酶切位點(diǎn)；
S2:5 ’-CTCGAGCTCGAGTTAGCAGTAATTGATGCC- 3 ’，下劃線為 Xho I 酶切位點(diǎn)。
[0006]2、目的基因的擴(kuò)增
以含有MTFP插入片段的噬菌體基因組作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收。
[0007]3、目的基因與PMD18-T克隆載體的連接
將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體連接。之后進(jìn)行連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及陽性克隆的鑒定。
[0008]4、目的片段與pGEX-4T-l載體的連接與轉(zhuǎn)化
將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒PMD18-T-MTFP進(jìn)行凝膠回收，與pGEX_4T_l載體進(jìn)行連接，再轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)，然后進(jìn)行酶切鑒定及測(cè)序鑒定。
[0009]5、目的基因的原核表達(dá)
將表達(dá)菌活化后，S%qIPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h之后，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果表明MTFP蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)。
[0010]6、重組蛋白MTFP的純化
將菌體沉淀超聲破碎，利用SM尿素法進(jìn)行純化，首先用2M尿素反復(fù)清洗，最后將蛋白沉淀溶于8M尿素中。經(jīng)Western blot驗(yàn)證該蛋白可被犬惡絲蟲陽性血清識(shí)別。
[0011]7、重組蛋白的透析復(fù)性
利用梯度透析的方法對(duì)純化的MTFP蛋白進(jìn)行透析復(fù)性，目的是將其中的尿素去除，以用于下一步劃膜。
[0012]二、膠體金試紙條的組裝
首先，將包被好檢測(cè)線和質(zhì)控線的21mm硝酸纖維素膜粘貼到PVC底板上，再取24mm樣品墊、9mm金標(biāo)墊、32mm吸水紙從下到上依次重疊2mm粘貼于PVC底板上;依次粘貼好后，將試紙板上的各種耗材與PVD底板壓緊，用切紙機(jī)將組裝好的試紙板切成每條寬度為4mm的試紙條即可。
[0013]本發(fā)明的積極效果在于:
本發(fā)明具有方便快捷、試驗(yàn)結(jié)果肉眼可見，不需要特殊實(shí)驗(yàn)儀器，不需專業(yè)技術(shù)人員操作等特點(diǎn)，更適合基層單位現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。具有高特異性，高敏感性，本發(fā)明利用犬惡絲蟲的重組蛋白MTFP作為診斷性抗原，比全蛋白提高了檢測(cè)的特異性;又采用金黃色葡萄球菌A蛋白作為金標(biāo)蛋白，由于其可以與抗體的Fe段發(fā)生特異性結(jié)合，兩者的夾心結(jié)合既保證了本發(fā)明試紙條的特異性又保證了敏感性。重復(fù)性好，保存期長，4°情況下可保存60天以上。
【附圖說明】
[0014]圖1試紙條組裝示意圖；
圖2金標(biāo)抗體透射電鏡圖；
圖3試紙條特異性試驗(yàn)結(jié)果示意圖；
圖4試紙條靈敏性試驗(yàn)結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明的具體方法及應(yīng)用性，而不是限制本發(fā)明。
[0016]實(shí)施例1
膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)方法的建立
(I)膠體金標(biāo)記SPA的鑒定
取金標(biāo)SPA溶液與透射電鏡下觀察其狀態(tài)，主要包括:大小是否相等、形狀是否均勻一致、有無聚集情況，金顆粒周圍有無蛋白暈等，從而鑒定金標(biāo)抗體的標(biāo)記效果。
[0017](2)金標(biāo)墊的選擇
本發(fā)明選用4種金標(biāo)墊分別是聚酯纖維VL68、玻璃纖維RB45、聚酯纖維VL78、聚酯纖維VL98，首先分別滴加金標(biāo)抗體，觀察四種金標(biāo)墊對(duì)金標(biāo)抗體的吸收情況，以及干燥之后金標(biāo)抗體在四種金標(biāo)墊上的分布情況，邊緣效應(yīng)等。
[0018](3) NC膜上C線抗體包被濃度的確定
將C線抗體稀釋成1、0.5、0.25、Omg/ml，每個(gè)試紙條包被Iul，T線蛋白包被濃度為Img/ml，包被lul，按照常規(guī)條件進(jìn)行操作，觀察結(jié)果C線的顯色情況，確定C線抗體的最佳包被濃度。
[0019](4) NC膜上T線蛋白包被濃度的確定
將T線蛋白稀釋成1、0.5、0.25、Omg/ml，每個(gè)試紙條包被Iul，C線抗體包被濃度為Img/ml，包被lul，按照常規(guī)條件進(jìn)行操作，觀察結(jié)果T線的顯色情況，確定T線蛋白的最佳包被濃度。
[0020]、結(jié)果
(I)膠體金標(biāo)記SPA的鑒定
在透射電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)顆粒大小基本相等，約在40nm左右，形狀較為均一，無聚集現(xiàn)象，分散較好，且膠體金顆粒周圍存在一圈明顯的蛋白暈，表明金標(biāo)SPA標(biāo)記成功(見圖2)。
[0021](2)金標(biāo)墊的選擇
結(jié)果表明金標(biāo)SPA在玻璃纖維RB45上分布的更加均勻，邊緣效應(yīng)較小，以玻璃纖維RB45為金標(biāo)墊的金標(biāo)抗體釋放更為完全，所以選擇玻璃纖維RB45為本試驗(yàn)組裝試紙條的金標(biāo)墊。
[0022](3) NC膜上C線抗體包被濃度的確定
將C線抗體稀釋成0、0.25、0.5、lmg/ml，當(dāng)抗體濃度在0.5mg/ml時(shí)，C線顯色清晰均勾，而0.25mg/ml時(shí)顯色較淡，不清晰，故選擇0.5mg/ml為C線抗體包被濃度。
[0023](4) NC膜上T線蛋白包被濃度的確定
將T線蛋白稀釋成O、0.25、0.5、lmg/ml，當(dāng)?shù)鞍诐舛仍趌mg/ml時(shí)，T線顯色較為清晰均勾，而0.5mg/ml時(shí)T線幾乎沒有顯色，故選擇lmg/ml為T線蛋白包被濃度。
[0024]實(shí)施例2、膠體金免疫層析試紙條性能測(cè)試
對(duì)試紙條耗材以及T/C線包被量選擇完成之后，將試紙條進(jìn)行組裝，為了檢測(cè)試紙條的工作性能，要對(duì)試紙條進(jìn)行一系列的測(cè)試，其中包括特異性試驗(yàn)、靈敏度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)(穩(wěn)定性試驗(yàn)中包括重復(fù)性試驗(yàn))。
[0025](I)特異性試驗(yàn)
分別取犬蛔蟲陽性血清，犬等孢球蟲陽性血清作對(duì)照，犬心絲蟲陰性血清作為陰性對(duì)照，按照上述建立的膠體金試紙條方法進(jìn)行操作，觀察試紙條顯色情況，從而評(píng)價(jià)試紙條的特異性。
[0026](2)靈敏性試驗(yàn)
將犬心絲蟲陽性血清進(jìn)行倍比稀釋(1:1,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32),按常規(guī)操作觀察試紙條顯色情況。當(dāng)用肉眼無法觀察到T線，并且C線依舊清晰可見時(shí)，此時(shí)的稀釋度即為該方法的最低檢出濃度。
[0027](3)穩(wěn)定性試驗(yàn)
一次性制備試紙條18只，分三個(gè)批次，于4°C密封保存。分別在I天、I月、2月這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出6只分別對(duì)同一陰性樣品、同一陽性樣品進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，觀察三個(gè)重復(fù)試紙條的顯色情況，從而判斷試紙條檢測(cè)的穩(wěn)定情況。
[0028](4)試紙條檢測(cè)陽性血清符合率試驗(yàn)應(yīng)用已經(jīng)建立的膠體金試紙條檢測(cè)方法，對(duì)11份遼寧省丹東市犬心絲蟲參照陽性血清進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢出的陽性樣品數(shù)，評(píng)價(jià)該方法檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際陽性血清的符合率。
[0029](5)試紙條的初步應(yīng)用
應(yīng)用所組裝的試紙條對(duì)62份犬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，觀察試紙條顯色情況，計(jì)算犬心絲蟲的的陽性感染率。
[0030]、結(jié)果
(I)特異性試驗(yàn)
結(jié)果表明犬蛔蟲陽性血清與犬等孢球蟲陽性血清的T檢測(cè)線均無顯色，表明該試紙條與犬蛔蟲，犬等孢球蟲陽性血清均無交叉反應(yīng)，說明此方法的特異性良好(見圖3)。
[0031](2)靈敏性試驗(yàn)
當(dāng)犬心絲蟲陽性血清稀釋到32倍時(shí)，試紙條的T線幾乎不能看見，而C線顯色清晰，當(dāng)犬心絲蟲陽性血清稀釋到16倍時(shí)，試紙條的T線與C線顯色都較為清晰，說明該方法的最低檢出線為1:16(見圖4)。
[0032](3)穩(wěn)定性試驗(yàn)
結(jié)果表明I個(gè)月和2個(gè)月的T線、C線條帶清晰度沒有I天的檢測(cè)結(jié)果明顯，顏色明顯變淡，金標(biāo)墊的釋放性也相對(duì)較差，但仍然可以指示正確的結(jié)果，說明根據(jù)本試驗(yàn)得到結(jié)果顯示該試紙條至少可以保存2個(gè)月以上。且3個(gè)重復(fù)的結(jié)果和T、C線的顯色效果較為一致，說明重復(fù)性較好。
[0033](4)試紙條檢測(cè)陽性血清符合率試驗(yàn)
對(duì)犬心絲蟲標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的檢測(cè)結(jié)果表明，犬心絲蟲膠體金試紙條檢測(cè)方法對(duì)11份已知的犬心絲蟲陽性血清檢測(cè)均表現(xiàn)為陽性，即陽性符合率為100%。
[0034](5)試紙條的初步應(yīng)用
利用組裝好的試紙條對(duì)62份犬血清進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的結(jié)果為4份陽性，58份陰性，陽性率為6.4%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測(cè)犬惡絲蟲抗體膠體金免疫層析試紙條，其特征在于:主要包括玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、吸水紙、PVC底板;金標(biāo)墊為利用膠體金標(biāo)記金黃色葡萄球菌A蛋白制作的金標(biāo)抗體;利用犬惡絲蟲MTFP蛋白作為診斷抗原包被硝酸纖維膜(NC膜)作為檢測(cè)線(T線);兔抗SPA抗體作為質(zhì)控線(C線)。2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)犬惡絲蟲抗體膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其特點(diǎn)在于: 重組蛋白MTFP的克隆、表達(dá)及純化: I)引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)目的基因序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物: F2:5 ’ -GGATCCCAACTTACGCAGGAAGCA- 3 ’，下劃線為 BamH I 酶切位點(diǎn)； S2:5 ’-CTCGAGCTCGAGTTAGCAGTAATTGATGCC- 3 ’，下劃線為 Xho I 酶切位點(diǎn)； 2)目的基因的擴(kuò)增 以含有MTFP插入片段的噬菌體基因組作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收； 3)目的基因與PMD18-T克隆載體的連接 將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體連接。3.之后進(jìn)行連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及陽性克隆的鑒定； 4)目的片段與pGEX-4T-l載體的連接與轉(zhuǎn)化 將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒PMD18-T-MTFP進(jìn)行凝膠回收，與pGEX-4T-l載體進(jìn)行連接，再轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)，然后進(jìn)行酶切鑒定及測(cè)序鑒定； 5)目的基因的原核表達(dá) 將表達(dá)菌活化后，S%qIPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h之后，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果表明MTFP蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)； 6)重組蛋白MTFP的純化 將菌體沉淀超聲破碎，利用SM尿素法進(jìn)行純化，首先用2M尿素反復(fù)清洗，最后將蛋白沉淀溶于8M尿素中；經(jīng)Western blot驗(yàn)證該蛋白可被犬惡絲蟲陽性血清識(shí)別； 7)重組蛋白的透析復(fù)性 利用梯度透析的方法對(duì)純化的MTFP蛋白進(jìn)行透析復(fù)性，目的是將其中的尿素去除，以用于下一步劃膜； 膠體金試紙條的組裝: 首先，將包被好檢測(cè)線和質(zhì)控線的21mm硝酸纖維素膜粘貼到PVC底板上，再取24mm樣品墊、9mm金標(biāo)墊、32mm吸水紙從下到上依次重疊2mm粘貼于PVC底板上;依次粘貼好后，將試紙板上的各種耗材與PVD底板壓緊，用切紙機(jī)將組裝好的試紙板切成每條寬度為4mm的試紙條即可。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK105929178SQ201610363379
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年5月30日
【發(fā)明人】張西臣, 姜鑫, 侯洪烈, 高珺珊, 李建華, 宮鵬濤, 楊舉, 李 赫, 李棕松, 楊正濤, 尹繼剛
【申請(qǐng)人】吉林大學(xué)