一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條及其制備方法，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC底板，特點是在PVC底板上按順序依次粘附有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，該結(jié)合墊上包被有所述的抗三疣梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體一膠體金標記物，該硝酸纖維素膜上分別包被有三疣梭子蟹呼腸孤病毒抗原構(gòu)成的檢測線和兔抗雞卵黃抗體構(gòu)成的質(zhì)控線，優(yōu)點是靈敏度高、特異性強、操作簡便、檢測快速、準確性高。
【專利說明】
一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及免疫化學檢測技術(shù)，尤其是涉及一種基于卵黃抗體的膠體金免疫層析 技術(shù)用以快速檢測動物各種組織及血液中三疣梭子蟹呼腸孤病毒的檢測試紙及其制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 三疣梭子蟹是我國大型多年生食用蟹類，廣泛分布于我國、朝鮮與日本海域。三疣 梭子蟹具有較高的食用與藥用價值，其生長快、經(jīng)濟價值高，現(xiàn)已成為繼對蝦之后的主要海 水養(yǎng)殖對象，是我國沿海水產(chǎn)養(yǎng)殖的主導產(chǎn)品。隨著三疣梭子蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖 規(guī)模不斷擴大，養(yǎng)殖密度不斷提高，病害日益嚴重，并成為制約其健康發(fā)展的重要因素。
[0003] 近年來，本課題組對三疣梭子蟹大量死亡疫病進行了流行病學、病理學、病原生物 學研究后，發(fā)現(xiàn)呼腸孤病毒大量存在于發(fā)病梭子蟹各組織中。經(jīng)回歸感染試驗表明呼腸孤 病毒（Swimming Crab Reovirus，SCRV)可引起梭子蟹90-100%的死亡率，是其主要爆發(fā)病 原，弧菌等可加劇病情。經(jīng)調(diào)查，呼腸孤病毒廣泛存在于梭子蟹養(yǎng)殖地區(qū)，一經(jīng)感染幾乎全 池覆沒，引起的疫病常規(guī)藥物治療無效，給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。因此，在苗種 購買、引進和發(fā)病初期進行檢測，確定病情，以便及時采取措施控制傳染和情況惡化，對減 少養(yǎng)殖場損失具有重要意義。
[0004] 目前，病原體的檢測方法主要有分離培養(yǎng)、電鏡觀察、PCR、ELISA、色譜分析等，這 些方法多耗時耗力，需要專用場地和儀器設(shè)備，需要專業(yè)人員操作。研究人員已成功建立了 ELISA檢測梭子蟹呼腸孤病毒（SCRV)的技術(shù)，但是整個檢測過程至少需要數(shù)小時，且對操 作者要求較高，需要酶標儀這樣的專業(yè)設(shè)備。
[0005] 膠體金免疫層析試驗（gold-immunochromatography assay GICA)是 20 世紀 80 年代開始發(fā)展起來的新的免疫分析方式，是應用膠體金標記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，基 于抗原抗體反應的一種新型免疫標記技術(shù)，它具有簡便，快速，特異性強，靈敏度高，費用低 等優(yōu)點。依據(jù)膠體金免疫層析技術(shù)，在國內(nèi)外無論人醫(yī)應用方面，還是獸醫(yī)應用方面，都已 經(jīng)研制出了多種膠體金免疫層析快速檢測各種病原和有毒有害物質(zhì)的試紙條。但是，目前 國內(nèi)外還沒有公開任何關(guān)于三疣梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條及其制備方法的相關(guān)研究 報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于膠體金免疫層析技術(shù)的特異性強、靈 敏度高、檢測速度快、成本低并且操作簡便的三疣梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條及其制備 方法，滿足了現(xiàn)場快速檢測的需求。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒檢測 試紙條，所述的試紙條由PVC底板和在PVC底板上依次搭接的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素 膜及吸水墊；所述的結(jié)合墊上包被有抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體-膠體金標記物，所述 的硝酸纖維素膜上分別設(shè)置有由梭子蟹呼腸孤病毒抗原包被的檢測線和由兔抗雞卵黃抗 體（IgY)包被的質(zhì)控線。
[0008] 所述的抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體-膠體金標記物的制備方法如下：將抗三疣 梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為20-30nm的膠體金溶液按7-9i! g : lmL 混合，在pH5. 4的條件下通過攪拌振蕩30-60min使其結(jié)合，加含10wt%的牛血清白蛋白的 PBST緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min去除未充分穩(wěn)定的膠體金 顆粒及其凝聚物，再高速離心12000-15000rpm，1-1. 5h去除未結(jié)合的抗梭子蟹呼腸孤病毒 卵黃抗體，取離心管底部暗紅色沉淀即得到抗三疣梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體-膠體金標 記物。
[0009] 一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條的制備方法，包括以下步驟：
[0010] ⑴樣品墊的制備
[0011] 將玻璃纖維紙浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖、lwt%吐 溫-20的0. 01M pH7. 4的PBS緩沖液中30min后取出，于37°C干燥2-3h即得到樣品墊，真 空封裝，4 °C保存?zhèn)溆茫?br>[0012] (2)特定包被的結(jié)合墊的制備
[0013] 將玻璃纖維紙浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖，lwt%吐 溫-20的0. 01M pH7. 4的PBS緩沖液中30min后，于37°C干燥l_2h后，在每平方厘米的玻 璃纖維紙上均勻噴涂10-20 y L的抗三疣梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體-膠體金標記物，真空 冷凍干燥l_2h，即得到結(jié)合墊，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0014] (3)特定包被的硝酸纖維素膜的制備
[0015] 將三疣梭子蟹呼腸孤病毒抗原用點膜儀將其包被于硝酸纖維膜上形成檢測線，將 兔抗雞卵黃抗體用點膜儀將其包被于硝酸纖維膜上形成質(zhì)控線，即得到特定包被的硝酸纖 維膜，真空冷凍干燥1-1. 5h，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆?；其中檢測線與質(zhì)控線相互平行，所述 的檢測線靠近結(jié)合墊端，所述的質(zhì)控線靠近吸水墊端；
[0016] (4)試紙條的制備
[0017] 將步驟⑴得到的樣品墊、步驟⑵得到的特定包被的結(jié)合墊、步驟（3)得到的特 定包被的硝酸纖維膜和吸水墊按序搭接并粘貼于底板上，裁成4-6mm寬的細條，即得三疣 梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條，真空封裝，4°C保存。
[0018] 所述的三疣梭子蟹呼腸孤病毒抗原的制備方法如下：取攻毒感染死亡的梭子蟹， 冰上解剖取其內(nèi)臟，稱量，按1 : 5-1 : 20加入預先冰浴過的含有ImM苯甲基磺酰氟（PMSF) 的TNE2緩沖溶液中勻漿，將勻漿液于4°C，8000g離心20min，沉淀用含ImM PMSF的TNE2緩 沖液重新懸浮勻漿后再次于4°C，8000g離心20min，合并兩次離心所得上清液，將上清液于 4°C，6000g離心10min后，取上清液于4°C，38000g離心1. 5h，用預冷的TM2緩沖液洗去沉淀 上層疏松部分，取下層結(jié)實白色沉淀部分用含ImM PMSF的預冷的TM2緩沖液重懸后于4°C， 3500g離心5min后，取上清液于4°C，38000g離心1. 5h，用TM2緩沖液洗去上層疏松部分， 下層結(jié)實的白色沉淀部分再次用含ImM PMSF的預冷的TM2緩沖液重懸后于4°C，3500g離 心5min后，取上清液再次于4°C，38000g離心1. 5h，用TM2緩沖液洗去上層疏松部分，最終 得到的下層結(jié)實的白色沉淀即為三疣梭子蟹呼腸孤病毒抗原。
[0019] 所述的抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體-膠體金標記物的制備方法如下：
[0020] (1)抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體的制備
[0021] 取健康的初產(chǎn)蛋的母雞作為免疫對象，將三疣梭子蟹呼腸孤病毒抗原和弗氏完全 佐劑等體積混合，充分乳化后對母雞的雙翅、雙腿、背部和胸肌部位肌肉注射進行基礎(chǔ)免 疫，每只母雞免疫劑量為500-800 ii g/mL，15-20天后，將梭子蟹呼腸孤病毒抗原和弗氏不 完全佐劑進行等體積混合，充分乳化后對母雞肌肉注射進行加強免疫，每只母雞免疫劑量 為400-600 ii g/mL，加強免疫重復進行三次，每次間隔時間為7-10天，然后收集雞蛋測定效 價，當卵黃抗體效價> 1 : 20000時收集雞蛋，分離卵黃，用飽和硫酸銨沉淀法純化卵黃抗 體；
[0022] (2)膠體金標記抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體
[0023] 將抗三疣梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為20_30nm的膠體金溶 液按7 _9 ii g : lmL混合，在pH5. 4的條件下通過攪拌振蕩30-60min使其結(jié)合，加含10wt% 的牛血清白蛋白的PBST緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min去除未 充分穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝聚物，再高速離心12000-15000rpm，1-1. 5h去除未結(jié)合的抗 梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體，取離心管底部暗紅色沉淀即得到抗三疣梭子蟹呼腸孤病毒卵 黃抗體 -膠體金標記物，用含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%鹿糖、lwt%海藻糖，0. 02wt%疊 氮化鈉的PH7. 4的0. 01M PBS重懸至所述膠體金溶液體積的1/10-1/20作為其工作濃度。
[0024] 用飽和硫酸銨沉淀法純化卵黃抗體的具體方法如下：稱取適量步驟（1)分離得到 的卵黃，按質(zhì)量比1 : 9加入pH5. 0的0. 05M的乙酸-乙酸鈉緩沖液，攪拌均勻后4°C靜置 過夜，8000g離心20min，取上清液加入飽和硫酸銨至飽和度為40%，4°C攪拌6h，lOOOOg離 心20min，沉淀用10-20倍卵黃質(zhì)量的雙蒸餾水重懸，加入飽和硫酸鈉至飽和度為40 %，4°C 攪拌過夜，l〇〇〇〇g離心20min，沉淀用少量pH7. 4的0. 01M的PBS緩沖液重懸后，在PBS緩 沖液中透析即得到抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體。
[0025] 步驟（2)中膠體金制備方法如下：將100mL 0.0 lwt%的氯金酸溶液，加熱煮沸后， 邊攪拌邊加入l_2mL lwt%檸檬酸三鈉迅速搖勻，繼續(xù)加熱，溶液由淡黃色變黑變酒紅色， 至顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5-10min，冷卻后補足失水至100mL，無菌密封，4°C避光保存。
[0026] 所述的檢測線距離所述的結(jié)合墊6-8mm ;所述的質(zhì)控線距離所述的吸水墊6-8mm， 所述的檢測線和所述的質(zhì)控線的寬度分別為〇. 8-lmm，兩條線相距為5mm。
[0027] 所述的TNE2緩沖液配制方法如下：Tris 6. 0578g、NaCl 23. 4g、乙二胺四乙酸二鈉 1. 8612g，補足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至8. 5,高壓滅菌；
[0028] 所述的 TM2 緩沖液配制方法如下：Tris 6.0578g、MgCl2.6H20 2.0338g、NaCl 15g， 補足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌；
[0029] 所述的 PBST 緩沖液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HP04. 12H20 2.9g、 KH2P040 . 2g，500 i! L吐溫-20,補足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌；
[0030] 所述的 PBS 緩沖液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HP04. 12H20 2.9g、 KH2P040 . 2g，補足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌；
[0031] 所述的乙酸-乙酸鈉緩沖液配方如下：乙酸鈉2. 604g、冰乙酸1. 095g，補足雙蒸水 至1L，調(diào)pH至5. 0,高壓滅菌。
[0032] 所述的三疣梭子蟹呼腸孤病毒抗原的包被量為2-4 ii L/cm ;所述的兔抗雞卵黃抗 體的包被量為1-2 U L/cm，所述的梭子蟹呼腸孤病毒抗原中含有濃度為ImM的苯甲基磺酰 氟和5wt%的海藻糖作為蛋白酶抑制劑和抗原保護劑。
[0033] 本發(fā)明選用三疣梭子蟹呼腸孤病毒抗原作為檢測線，抗三疣梭子蟹呼腸孤病毒特 異性卵黃抗體作為膠體金標記的抗體，利用競爭法來檢測待測樣品中是否含有梭子蟹呼腸 孤病毒。通過待檢樣品中的梭子蟹呼腸孤病毒與包被于硝酸纖維膜上的三疣梭子蟹呼腸 孤病毒抗原共同競爭結(jié)合抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體_膠體金標記物。若待檢樣品中 梭子蟹呼腸孤病毒的量高于試紙條的檢測限，抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體-膠體金標記 物與樣品中三疣梭子蟹呼腸孤病毒全部結(jié)合，從而不與固定在硝酸纖維膜上的病毒結(jié)合而 不出現(xiàn)紅色條帶而顯陽性；若待檢樣品中不含梭子蟹呼腸孤病毒或其量低于試紙條的檢測 限，抗三疣梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體-膠體金標記物不能與樣品中梭子蟹呼腸孤病毒全 部結(jié)合，這樣金標抗體在層析過程中會被固定在硝酸纖維膜上的病毒結(jié)合而出現(xiàn)紅色條帶 而顯陰性。因此，若待測樣品試紙條的檢測線和質(zhì)控線同時出現(xiàn)紅色條帶，則判斷為陰性樣 品；若待測樣品試紙條檢測線不出現(xiàn)紅色條帶，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶則判斷為陽性 樣品；若質(zhì)控線上沒有紅色條帶出現(xiàn)，則該試紙條無效。
[0034] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于
[0035] 1、檢測快速：整個檢測過程只需5-10分鐘，能夠滿足現(xiàn)場檢測的需要。
[0036] 2、檢測準確率高、特異性強：本反應與其他病毒沒有交叉反應，檢測準確性能達到 95%以上，與操作復雜的ELISA水平基本相同。
[0037] 3、攜帶方便，操作簡便：本發(fā)明改變了對三疣梭子蟹呼腸孤病毒的檢測必須由專 業(yè)人員才能進行檢測的局限性，使各個梭子蟹養(yǎng)殖場均可即時、即地進行檢測。
[0038] 4、本發(fā)明的檢測試紙條制備工藝簡單，成本低廉，不需要任何特殊儀器、設(shè)備。
[0039] 5、本發(fā)明的檢測試紙條儲存方便，對溫度要求不高，在4°C可有效保存半年以上。
【附圖說明】
[0040] 圖1為本發(fā)明試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖，圖中1為樣品墊，2為結(jié)合墊，3為硝酸纖維素 膜，4為吸收墊，5為檢測線，6為質(zhì)控線，7為PVC底板；
[0041] 圖2為本發(fā)明試紙條的制備工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0042] 以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0043] 具體實施例1
[0044] 一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條，如圖1所示，該試紙條由PVC底板7和在 PVC底板7上依次搭接的樣品墊1、結(jié)合墊2、硝酸纖維素膜3及吸水墊4 ;結(jié)合墊2上包被 有抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體-膠體金標記物，硝酸纖維素膜3上分別設(shè)置有由三疣梭 子蟹呼腸孤病毒抗原包被的檢測線5和由兔抗雞卵黃抗體（IgY)包被的質(zhì)控線6。
[0045] 上述抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體-膠體金標記物的制備方法如下：將抗三疣梭 子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為20-30nm的膠體金溶液按7-9 ii g : lmL混 合，在pH5. 4的條件下通過攪拌振蕩30-60min使其結(jié)合，加含10wt%的牛血清白蛋白的 PBST緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min去除未充分穩(wěn)定的膠體金 顆粒及其凝聚物，再高速離心12000-15000rpm，1-1. 5h去除未結(jié)合的抗梭子蟹呼腸孤病毒 卵黃抗體，取離心管底部暗紅色沉淀即得到抗三疣梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體-膠體金標 記物。
[0046] 具體實施例2
[0047] 快速檢測三疣梭子蟹呼腸孤病毒膠體金試紙條的制備方法，如圖2所示，其具體 操作步驟如下：
[0048] (1)三疣梭子蟹呼腸孤病毒的純化
[0049] 取攻毒感染死亡的梭子蟹，冰上解剖取其內(nèi)臟，稱量后按體積比1 : 5-1 : 20加 入預先冰浴過的含有ImM苯甲基磺酰氟（PMSF)的TNE2緩沖溶液勻漿，將勻漿液于4°C， 8000g離心20min，沉淀用含ImM PMSF的TNE2緩沖液重新懸浮勻漿后再次于4°C，8000g離心 20min，合并兩次離心所得上清液，將上清液于4°C，6000g離心10min后，取上清液于4°C， 38000g離心1. 5h，用預冷TM2緩沖液洗去沉淀上層疏松部分，取下層結(jié)實白色沉淀部分用 含ImM PMSF的預冷的TM2緩沖液重懸后于4°C，3500g離心5min后，取上清液再次于4°C， 38000g離心1. 5h，用TM2緩沖液洗去上層疏松部分，下層結(jié)實的白色沉淀部分再次用含ImM PMSF的預冷的TM 2緩沖液重懸后于4°C，3500g離心5min后，取上清液再次于4°C，38000g 離心1. 5h，用TM2緩沖液洗去上層疏松部分，最終得到的下層結(jié)實的白色沉淀用TM2緩沖液 洗去上層疏松部分，下層結(jié)實的白色沉淀即為三疣梭子蟹呼腸孤病毒抗原。
[0050] (2)抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體的制備
[0051] 取健康的初產(chǎn)蛋的母雞作為免疫對象，將三疣梭子蟹呼腸孤病毒抗原和弗氏完全 佐劑等體積混合，充分乳化后對母雞的雙翅、雙腿、背部和胸肌部位肌肉注射進行基礎(chǔ)免 疫，每只母雞免疫劑量為500-800 i! g/mL，15-20天后，將梭子蟹呼腸孤病毒抗原和弗氏不 完全佐劑進行等體積混合，充分乳化后對母雞肌肉注射進行加強免疫，每只母雞免疫劑量 為400-600 ii g/mL,加強免疫重復進行三次，每次間隔時間為7-10天，進行三次免疫后收 集雞蛋測定效價，當卵黃抗體效價> 1 : 20000時收集雞蛋，分離卵黃，用飽和硫酸銨沉淀 法純化卵黃抗體。卵黃抗體的純化的具體方法如下：稱取適量卵黃，按質(zhì)量比1 : 9加入 pH5. 0的0. 05M乙酸-乙酸鈉緩沖液，攪拌均勻后4°C靜置過夜，8000g離心20min，取上清 液加入飽和硫酸銨至飽和度為40%，4°C攪拌6h，lOOOOg離心20min，沉淀用10-20倍卵黃 質(zhì)量的雙蒸餾水重懸，加入飽和硫酸鈉至飽和度為40%，4°C攪拌過夜，10000g離心20min， 取沉淀用少量pH7. 4的0. 01M PBS溶液重懸，在PBS溶液中透析即得到抗梭子蟹呼腸孤病 毒卵黃抗體；
[0052] (3)膠體金標記抗三疣梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體的方法
[0053] 用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備膠體金。用新制的去離子水配制100mL 0.0 lwt% 的氯金酸溶液，加熱煮沸后，邊攪拌邊加入l_2mL lwt%檸檬酸三鈉溶液后迅速搖勻，繼續(xù) 加熱，溶液由淡黃色變黑變酒紅色，至顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5-10min，冷卻后補足失水至 100mL，無菌密封，4°C避光保存；
[0054] 將抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為20-30nm的膠體金溶液按 7_9iig : lmL混合，在pH5. 4的條件下通過攪拌振蕩30-60min使其結(jié)合，加含10wt%的牛 血清蛋白的PBST緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min去除未充分 穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝聚物，再高速離心12000-15000rpm，1-1. 5h去除未結(jié)合的卵黃抗 體，取離心管底部暗紅色沉淀即得到抗三疣梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體-膠體金標記物， 用含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%鹿糖、lwt%海藻糖，0. 02wt%疊氮化鈉的pH7. 4的0. 01M PBS重懸至所述膠體金溶液體積的1/10-1/20作為其工作濃度。
[0055] (4)結(jié)合墊的包被
[0056] 將玻璃纖維紙浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖，lwt%吐 溫-20的pH7. 4的0. 01M PBS緩沖液中30min后，37°C干燥l_2h后，在每平方厘米的玻璃 纖維紙上均勻噴涂10-20 y L抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體-膠體金標記物，真空冷凍干燥 1-2h，即得到結(jié)合墊，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0057] (5)樣品墊的處理
[0058] 將玻璃纖維紙浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖、lwt%吐 溫-20的pH7. 4的0. 01M PBS緩沖液中30min后取出，37°C干燥2-3h即得到樣品墊，真空 封裝，4 °C保存?zhèn)溆茫?br>[0059] (6)硝酸纖維素膜的包被
[0060] 將三疣梭子蟹呼腸孤病毒抗原用點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上形成檢測線， 包被量為2-4 y L/cm ;將兔抗雞卵黃抗體用點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控 線，包被量為1-2 P L/cm，即得到特定包被的硝酸纖維素膜，真空冷凍干燥1-1. 5h，真空封 裝，4°C保存?zhèn)溆茫黄渲袡z測線與質(zhì)控線相互平行，所述的檢測線靠近結(jié)合墊端，所述的質(zhì)控 線靠近吸水墊端；三疣梭子蟹呼腸孤病毒抗原中含有濃度為ImM的苯甲基磺酰氟（蛋白酶 抑制劑）和5wt %的海藻糖（抗原保護劑）。
[0061] (7)試紙條組裝
[0062] 將樣品墊（1)、結(jié)合墊（2)、硝酸纖維膜（3)、吸水墊⑷按圖2所示的順序依次粘 附在PVC底板（7)上，PVC底板作為支撐載體，由下及上是由玻璃纖維紙組成的樣品吸收 區(qū)，然后是吸附了膠體金所標記的卵黃抗體的玻璃纖維層，其次是硝酸纖維素膜，最上一層 是吸水層，由濾紙組成，外面用膠帶封住，成為手持部分。各層之間均有1. 5_左右的重疊 交叉。將試紙條切成4-6_寬的小條，真空封裝，4°C保存。
[0063] 其中步驟（1)中采用的TNE2緩沖液配制方法是：Tris 6. 0578g、NaCl 23. 4g、乙 二胺四乙酸二鈉1. 8612g，補足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至8. 5,高壓滅菌；TM2緩沖液配制方法 是：作18 6.05788、]\%(：12*61120 2.03388、恥(：1158，補足雙蒸水至比，調(diào)節(jié)口11至7.4，高壓 滅菌。
[0064] 步驟（2)中的乙酸-乙酸鈉緩沖液配方如下：乙酸鈉2. 604g、冰乙酸1. 095g，補足 雙蒸水至1L，調(diào)pH至5. 0,高壓滅菌。
[0065] 步驟（3)中采用的PBST緩沖液配制方法如下：NaCl 8g、KC1 0. 2g、 Na2HP04 ? 12H202. 9g、KH2P040 . 2g，500 ii L 吐溫-20,補足雙蒸水至 1L，調(diào)節(jié) pH 至 7. 4,高壓滅 菌。
[0066] 步驟⑵（3) (4)、（5)中采用PBS緩沖液配制方法是：NaCl 8g、KC1 0. 2g、 Na2HP04 ? 12H20 2. 9g、KH2P040 . 2g補足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌。
[0067] 具體實施例3
[0068] 膠體金試紙條對臨床樣品的檢測，具體步驟如下：
[0069] 從當?shù)馗鞒泻透黟B(yǎng)殖場購買三疣梭子蟹，同時在某暴發(fā)疾病大量死亡梭子蟹養(yǎng) 殖場采集梭子蟹樣品。取梭子蟹的組織樣品，將tne2緩沖液滴加于組織樣上，破碎組織， 2000-3000rpm離心5min后取上清液，將檢測試紙條插入待檢樣品中，10分鐘后觀察結(jié)果： 若只在檢測試紙條的質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅線者為陽性結(jié)果，即樣品中帶有梭子蟹呼腸孤病 毒；若試紙條的檢測線和質(zhì)控線同時出現(xiàn)紅線者為陰性結(jié)果，即樣品中不含有梭子蟹呼腸 孤病毒。每個樣品做5次重復，所有臨床樣品檢測結(jié)果用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)進行比 較。
[0070] 檢測結(jié)果見表1，我們可以看到在收集的40份三疣梭子蟹樣品中，只有在發(fā)病養(yǎng) 殖場的梭子蟹樣品中出現(xiàn)了陽性結(jié)果，8只樣品中有7只為陽性結(jié)果。對于其余各大超市 及養(yǎng)殖場收集的梭子蟹樣品均為陰性結(jié)果。所有檢測樣品只有一份樣品結(jié)果與ELISA結(jié) 果沖突，其余均與ELISA結(jié)果相同，說明兩者具有高度一致性，膠體金試紙條的準確率高達 97. 5% ;另一方面，膠體金試紙條操作方便快速，5-10分鐘即可得到結(jié)果，不需要專業(yè)人員 和專業(yè)設(shè)備；綜上所述，這種研發(fā)的三疣梭子蟹呼腸孤病毒膠體金試紙條是可行的，我們可 以通過膠體金試紙條對發(fā)病梭子蟹進行檢測確定病因，從而對癥下藥，及時防治，防止病情 擴大，減少養(yǎng)殖戶損失，同時也可以作為在苗種引進時的一種初步篩選工具，這種膠體金試 紙條方便實用，非常適合現(xiàn)場檢測。
[0071] 表1梭子蟹呼腸孤病毒試紙條檢測臨床樣品結(jié)果
[0073] + :試紙條只出現(xiàn)質(zhì)控線一條紅線，為陽性結(jié)果；
[0074] _ :試紙條出現(xiàn)兩條紅線，為陰性結(jié)果。
[0075] 具體實施例4
[0076] 膠體金試紙條的靈敏度檢測，具體步驟如下：
[0077] 按具體實施例2中步驟（1)的方法，純化三疣梭子蟹呼腸孤病毒，用少量的PBS 緩沖液的進行重懸稀釋，用超微量核酸/蛋白測定儀（Nanodrop 2000)測定其蛋白濃度。 用PBS緩沖液將其進行一系列的梯度稀釋，分別稀釋為15 ii g/mL，30 ii g/mL，40 ii g/mL， 50 ii g/mL，75 ii g/mL，100 ii g/mL。吸取三疣梭子蟹呼腸孤病毒液（100 ii L)滴加于檢測試紙 條的樣品墊上，靜置10分鐘后觀察結(jié)果。以檢測線消失的最低檢測濃度為其最低檢測極 限。每種濃度做5次重復。
[0078] 檢測結(jié)果見表2,我們可以看出在三疣梭子蟹呼腸孤病毒濃度為15 yg/mL， 30 y g/mL，40 y g/mL時試紙條上均出現(xiàn)兩條線，檢測結(jié)果為陰性，而當梭子蟹呼腸孤病毒濃 度為50 ii g/mL，75 ii g/mL，100 ii g/mL時，檢測線消失，只有質(zhì)控線出現(xiàn)一條紅色條帶，檢測 結(jié)果為陽性。因此，梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條的檢測極限為50y g/mL。
[0079] 表2三疣梭子蟹呼腸孤病毒試紙條靈敏度檢測結(jié)果
[0081] + :試紙條只出現(xiàn)質(zhì)控線一條紅線，為陽性結(jié)果；
[0082] _ :試紙條出現(xiàn)兩條紅線，為陰性結(jié)果。
[0083] 具體實施例5
[0084] 三疣梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條的特異性檢測，其具體步驟如下：
[0085] 將對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV)、甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒（STSSSV)和三疣梭 子蟹呼腸孤病毒（SCRV)分別稀釋至100 yg/mL，用制備的試紙條分別檢測這三種病毒，每 種病毒做5個重復，10分鐘后觀察結(jié)果。若試紙條只在質(zhì)控線出現(xiàn)一條紅色條帶，則檢測結(jié) 果為陽性，若試紙條的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)都分別出現(xiàn)一條紅色條帶，則檢測結(jié)果為陰性。
[0086] 檢測結(jié)果見表3,我們可以看出用試紙條檢測對蝦白斑綜合癥（WSSV)和甲魚系統(tǒng) 性敗血癥球狀病毒（STSSSV)時，在試紙條的檢測線和質(zhì)控線分別都出現(xiàn)了一條紅色條帶， 即檢測結(jié)果為陰性；而用試紙條檢測三疣梭子蟹呼腸孤病毒（SCRV)時只在試紙條的質(zhì)控 區(qū)出現(xiàn)了一條紅色條帶，檢測結(jié)果為陽性。由此可見，這種梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條具 有良好的特異性，它不與對蝦白斑綜合癥（WSSV)和甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒（STSSSV) 發(fā)生交叉反應。
[0087] 表3三疣梭子蟹呼腸孤病毒試紙條特異性檢測結(jié)果
[0089] 當然，上述說明并非對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應屬于本發(fā)明的 保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條，其特征在于：所述的試紙條由PVC底板和 在PVC底板上依次搭接的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜及吸水墊；所述的結(jié)合墊上包被有 抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體-膠體金標記物，所述的硝酸纖維素膜上分別設(shè)置有由三疣 梭子蟹呼腸孤病毒抗原包被的檢測線和由兔抗雞卵黃抗體（IgY)包被的質(zhì)控線。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條，其特征在于所述的 抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體-膠體金標記物的制備方法如下：將抗梭子蟹呼腸孤病毒卵 黃抗體與膠體金顆粒直徑為20-30nm的膠體金溶液按7-9 μ g : ImL混合后，在pH5. 4的條件 下通過攪拌振蕩30-60min，加含IOwt %的牛血清白蛋白的PBST緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低 速離心2000-3500rpm，10_20min，再高速離心12000-15000rpm，1-1. 5h，取離心管底部暗紅 色沉淀即得到抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體-膠體金標記物。3. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的三疣梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條的制備方法，其特征 在于包括以下步驟： (1) 樣品墊的制備 將玻璃纖維紙浸泡于含Iwt %牛血清白蛋白、2. 5wt %蔗糖、Iwt %海藻糖、Iwt %吐 溫-20的pH 7. 4的0.0 lM PBS緩沖液中30min后取出，于37°C干燥2-3h即得到樣品墊，真 空封裝，4 °C保存?zhèn)溆茫? (2) 特定包被的結(jié)合墊的制備 將玻璃纖維紙浸泡于含Iwt %牛血清白蛋白、2. 5wt %蔗糖、Iwt %海藻糖，Iwt %吐 溫-20的pH7. 4的0.0 lM PBS緩沖液中30min后，于37°C干燥l_2h后，在每平方厘米的玻 璃纖維紙上均勻噴涂10-20 μ L的抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體-膠體金標記物，真空冷凍 干燥1-2h，即得到結(jié)合墊，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆茫? (3) 特定包被的硝酸纖維素膜的制備 將三疣梭子蟹呼腸孤病毒抗原用點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上形成檢測線，將兔 抗雞卵黃抗體用點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線，即得到特定包被的硝酸纖 維素膜，真空冷凍干燥1-1. 5h，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆茫黄渲袡z測線與質(zhì)控線相互平行，所 述的檢測線靠近結(jié)合墊端，所述的質(zhì)控線靠近吸水墊端； (4) 試紙條的制備 將步驟（1)得到的樣品墊、步驟（2)得到的特定包被的結(jié)合墊、步驟（3)得到的特定包 被的硝酸纖維膜和吸水墊按序搭接并粘貼于底板上，裁成4-6mm寬的細條，即得三疣梭子 蟹呼腸孤病毒檢測試紙條，真空封裝，4°C保存。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條的制備方法，其特征 在于所述的梭子蟹呼腸孤病毒抗原的制備方法如下：取攻毒感染死亡的梭子蟹，冰上解剖 取其內(nèi)臟，稱量，按1 : 5-1 : 20加入預先冰浴過的含有ImM苯甲基磺酰氟（PMSF)的TNE2 緩沖溶液勻漿，將勻漿液于4°C，8000g離心20min，沉淀用含ImM PMSF的TNE2緩沖液重新懸 浮勻漿后再次于4°C，SOOOg離心20min，合并兩次離心所得上清液，將上清液于4°C，6000g 離心10min后，取上清液于4°C，38000g離心I. 5h，用預冷TM2緩沖液洗去沉淀上層疏松部 分，取下層結(jié)實白色沉淀部分用含ImM PMSF的預冷的TM2緩沖液重懸后于4°C，3500g離心 5min后，取上清液再次于4°C，38000g離心I. 5h，用TM2緩沖液洗去上層疏松部分，下層結(jié) 實的白色沉淀再次用含ImM PMSF的預冷的TM2緩沖液重懸后于4°C，3500g離心5min后， 取上清液再次于4°C，38000g離心I. 5h，用TM2緩沖液洗去上層疏松部分，最終得到的下層 結(jié)實的白色沉淀即為梭子蟹呼腸孤病毒抗原。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條的制備方法，其特征 在于所述的抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體-膠體金標記物的制備方法如下： (1) 抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體的制備 取健康的初產(chǎn)蛋的母雞作為免疫對象，將梭子蟹呼腸孤病毒抗原和弗氏完全佐劑等 體積混合，充分乳化后對母雞的雙翅、雙腿、背部和胸肌部位肌肉注射進行基礎(chǔ)免疫，每 只母雞免疫劑量為500-800 μ g/mL，15-20天后，將梭子蟹呼腸孤病毒抗原和弗氏不完全 佐劑進行等體積混合，充分乳化后對母雞肌肉注射進行加強免疫，每只母雞免疫劑量為 400-600 μ g/mL，加強免疫重復進行三次，每次間隔時間為7-10天，然后收集雞蛋測定效 價，當卵黃抗體效價> 1 : 20000時收集雞蛋，分離卵黃，用飽和硫酸銨沉淀法純化卵黃抗 體； (2) 膠體金標記抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體 將抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為20-30nm的膠體金溶液按 7-9 μ g :lmL混合，在pH 5. 4的條件下通過攪拌振蕩30-60min，加含IOwt %的牛血清 白蛋白的PBST緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min，再高速離心 12000-15000rpm，I -1. 5h，取離心管底部暗紅色沉淀即得到抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗 體-膠體金標記物，用含Iwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%鹿糖、Iwt%海藻糖，0. 02wt%疊氮化 鈉的pH 7. 4的0.0 lM PBS緩沖液重懸至所述膠體金溶液體積的1/10-1/20作為其工作濃 度。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條的制備方法，其特征 在于用飽和硫酸銨沉淀法純化卵黃抗體的具體方法如下：稱取適量步驟（1)分離得到的卵 黃，按體積比1 : 9加入pH 5. 0的0. 05M的乙酸-乙酸鈉緩沖液，攪拌均勻后4°C靜置過 夜，8000g離心20min，取上清液加入飽和硫酸銨至飽和度為40%，4°C攪拌6h，1000 Og離心 20min，沉淀用10-20倍卵黃質(zhì)量的雙蒸餾水重懸，加入飽和硫酸鈉至飽和度為40%，4°C攪 拌過夜，1000 Og離心20min，沉淀用少量pH7. 4的0.0 lM的PBS緩沖液重懸后，在PBS緩沖 液中透析即得到抗梭子蟹呼腸孤病毒卵黃抗體。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條的制備方法，其特征 在于步驟（2)中膠體金制備方法如下：將IOOmL O.Olwt%的氯金酸溶液，加熱煮沸后，邊攪 拌邊加入l_2mL lwt%檸檬酸三鈉迅速搖勻，繼續(xù)加熱，溶液由淡黃色變黑變紅色，至顏色 穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5-10min，冷卻后補足失水至IOOmL，無菌密封，4°C避光保存。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條的制備方法，其特征 在于：所述的檢測線距離所述的結(jié)合墊6-8mm ;所述的質(zhì)控線距離所述的吸水墊6-8mm，所 述的檢測線和所述的質(zhì)控線的寬度分別為0. 8-lmm，兩條線相距為5mm。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條的制備方法，其特征 在于： 所述的TNE2緩沖液配制方法如下：Tris 6. 0578g、NaCl 23. 4g、乙二胺四乙酸二鈉 I. 8612g，補足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至8. 5,高壓滅菌； 所述的TM2緩沖液配制方法如下：Tris 6.0578g、MgCl2*6H20 2.0338g、NaCl 15g，補足 雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌； 所述的 PBST 緩沖液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0· 2g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、 KH2PO4O. 2g，500ul吐溫-20,補足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌； 所述的 PBS 緩沖液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0. 2g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、 KH2PO4O. 2g，補足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌； 所述的乙酸-乙酸鈉緩沖液配方如下：乙酸鈉2. 604g、冰乙酸I. 095g，補足雙蒸水至 1L，調(diào)pH至5. 0,高壓滅菌。10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒檢測試紙條的制備方法，其特 征在于：所述的梭子蟹呼腸孤病毒抗原的包被量為2-4 μ L/cm ;所述的兔抗雞卵黃抗體的 包被量為1-2 μ L/cm，所述的三疣梭子蟹呼腸孤病毒抗原中含有濃度為ImM的苯甲基磺酰 氟和5wt%的海藻糖。
【文檔編號】G01N33/569GK105891469SQ201410657337
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年11月14日
【發(fā)明人】章禮平, 李登峰, 劉聯(lián)國, 劉飛, 吳寒華, 顧葉華
【申請人】寧波大學