一種基于免疫過氧化物酶細(xì)胞單層試驗(yàn)的gcrv病毒ⅱ型抗體檢測(cè)試劑盒及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于免疫過氧化物酶細(xì)胞單層試驗(yàn)的草 魚呼腸孤病毒π型抗體檢測(cè)方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)隸屬水生呼腸孤病毒屬，為呼腸孤 病毒科一新成員，是中國(guó)大陸分離的第一株魚類病毒。該病毒主要引起中國(guó)、越南、緬甸等 亞洲國(guó)家淡水養(yǎng)殖中的草魚品種在魚種階段發(fā)生出血病，死亡率一般為30%-50%，最高可 達(dá)60%-90%，而且還能感染青魚、麥穗魚、布氏餐條魚等，并能使這幾種魚發(fā)生出血病癥狀 而死亡，該病毒流行廣、危害大、死亡率高、發(fā)病季節(jié)長(zhǎng)，嚴(yán)重影響了廣大養(yǎng)殖者的積極性和 我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。草魚呼腸孤病毒具雙層衣殼，病毒粒子平均直徑為60 nm-70nm，二十面體對(duì)稱，無(wú)囊膜，基因組由11條分節(jié)段的雙鏈RNA組成。目前己經(jīng)報(bào)道了20多個(gè) 分離株，包括6〇^854、6〇^861、6〇^873、6〇^875、6〇^876、6〇^991、!1962、2￥-8802、6〇^-854、GCRV HZ08、JX09-01、GCRV-104、GD10、HuNanl307、GZ1208等，不同分離株在基因組序 列、基因組帶型、細(xì)胞病變、對(duì)草魚的致病力等方面差異較大。草魚呼腸孤病毒至今還沒在 血清學(xué)或者基因型上對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)分類。根據(jù)現(xiàn)有的分離株序列信息，進(jìn)行核苷酸序列與 氨基酸序列比對(duì)以及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，所有毒株總體上可以分為3大類，分為3個(gè)基因 型，8卩60^1型（代表株為60^-873與60^-冗09-()1)、60^11型（代表株為60^-!1208與 GCRV-GD10)和GCRV ΙΠ 型(GCRV-104，GCRV-HB1007)。當(dāng)前，全國(guó)各地分離到的流行株中，三 類亞型均有報(bào)道，有的單獨(dú)感染，也有混合感染。通過我們2011年至2015年這5年的草魚出 血病監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查分析表明，目前導(dǎo)致草魚出血病流行和爆發(fā)的最主要為GCRV Π 型。因此，對(duì)GCRV Π 型病毒引起的草魚出血病的特異性診斷具有重要意義。
[0003] 草魚呼腸孤病毒的檢測(cè)方法有多種，各具優(yōu)勢(shì)和缺陷，病毒分離、電鏡觀察、核酸 帶型分析至今仍是檢測(cè)草魚呼腸孤病毒普遍采用的方法，但這些方法法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、操作比 較復(fù)雜，不能對(duì)病毒進(jìn)行快速診斷，不利于草魚出血病的流行病學(xué)調(diào)查工作。全病毒診斷涉 及病毒培養(yǎng)、純化及濃縮等過程，不僅制作過程復(fù)雜，耗時(shí)，成本較高，而且還潛在散毒危 險(xiǎn)，因此不利于推廣使用。當(dāng)前，對(duì)于草魚呼腸孤病毒的檢測(cè)，最為常用的方法是基于PCR擴(kuò) 增技術(shù)的各種分子生物學(xué)檢測(cè)方法，包括常規(guī)的RT-PCR和熒光定量PCR等，具有較高的敏感 性和特異性。但這些分子生物學(xué)方法都是檢測(cè)病毒的核酸存在與否，方法單一，經(jīng)常導(dǎo)致假 陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，難于對(duì)該病做到確診。因此，急需其它方法來(lái)彌補(bǔ)分子生物學(xué)檢測(cè)方法 的不足，如各種免疫學(xué)(血清學(xué))檢測(cè)方法。
[0004] 目前，針對(duì)草魚出血病的疫苗，無(wú)論是法規(guī)許可的細(xì)胞弱毒疫苗還是市場(chǎng)上流行 的土法疫苗，甚至一些細(xì)胞滅活疫，絕大部分都是針對(duì)GCRV Π 型的疫苗。而對(duì)這些疫苗免 疫效果的評(píng)價(jià)，只是根據(jù)免疫草魚的死亡率來(lái)初步估計(jì)，一旦其它疫病的爆發(fā)導(dǎo)致免疫草 魚死亡，就無(wú)法弄清是由于疫苗效果不好，草魚出血病依然爆發(fā)導(dǎo)致而的死亡，還是由于其 它疫病的爆發(fā)而導(dǎo)致的死亡，更無(wú)法對(duì)疫苗免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。因此，也急需要一種檢測(cè) GCRV特異性抗體的免疫學(xué)檢測(cè)方法。臨床和實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)證實(shí)草魚出血病弱毒疫苗是預(yù)防控 制草魚出血病的有效生物制劑，而對(duì)草魚呼腸孤病毒特異性抗體的監(jiān)測(cè)是評(píng)價(jià)魚出血病疫 苗免疫效果及合理制定免疫程序的關(guān)鍵。對(duì)于草魚呼腸孤病毒抗體的檢測(cè)，目前還沒有有 效可靠的方法，ELISA方法特異性好、靈敏度高、快速易行，可進(jìn)行大量樣品的檢測(cè)，但存在 病毒抗原或重組蛋白抗原純化條件苛刻、試劑保存條件要求高、檢測(cè)需要酶標(biāo)測(cè)定儀，只能 在具有一定條件的實(shí)驗(yàn)室使用等缺點(diǎn)。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述存在的問題，本發(fā)明建立的GCRV Π 免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn) (immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)采用病毒感染細(xì)胞后固定作為檢測(cè)抗原，試 驗(yàn)過程所需時(shí)間短、特異性好、敏感性高、操作方便、性能穩(wěn)定、易于臨床推廣，并且觀察時(shí) 只需普通的光學(xué)顯微鏡，適用于基層流行病學(xué)調(diào)查、臨床檢測(cè)和疫苗免疫后血清抗體的監(jiān) 測(cè) 。
[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種基于免疫過氧化物酶細(xì)胞單層試驗(yàn)的草魚呼腸孤病毒 Π 型抗體檢測(cè)試劑盒。
[0008] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種基于免疫過氧化物酶細(xì)胞單層試驗(yàn)的草魚呼腸孤病毒π型抗體檢測(cè)試劑盒，該試 劑盒含有細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性抗原。
[0009] 進(jìn)一步的，所述細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性抗原固定在細(xì)胞培養(yǎng)板上。
[0010] 進(jìn)一步的，所述細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性抗原為感染了 Π 型草魚呼腸孤病毒的細(xì)胞。
[0011] 進(jìn)一步的，所述細(xì)胞為草魚鰾細(xì)胞系GSB。
[0012] 進(jìn)一步的，所述細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性抗原固定在細(xì)胞培養(yǎng)板上的具體操作為:將草魚呼腸 孤病毒HZ08株接種到新消化的GSB細(xì)胞懸液中，混勻，加入到細(xì)胞板中，于27.5°028.5°C條 件下培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞后取出，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS清洗后，用固定液固定12~17 min，干燥后即可。
[0013]進(jìn)一步的，該試劑盒還含有抗草魚IgM單克隆抗體，HRP標(biāo)記的羊抗鼠單克隆抗體 IgG〇
[0014] 進(jìn)一步的，該試劑盒還含有細(xì)胞內(nèi)陰性抗原，陽(yáng)性對(duì)照血清，陰性對(duì)照血清，樣品 稀釋液，磷酸鹽緩沖液洗滌液，AEC顯色液和血清稀釋板。
[0015] 進(jìn)一步的，所述細(xì)胞內(nèi)陰性抗原為未感染草魚呼腸孤病毒的細(xì)胞，固定在細(xì)胞板 中； 所述陽(yáng)性對(duì)照血清為經(jīng)草魚呼腸孤病毒疫苗株892株病毒免疫后的血清，ELISA抗體效 價(jià)在1:400以上； 所述陰性對(duì)照血清為未經(jīng)草魚呼腸孤病毒免疫的血清； 所述樣品稀釋液由25mM DTT、100mM pH8.0的Tris緩沖液、2mM pH8.0的EDTA和200mM NaCl組成。
[0016] 進(jìn)一步的，所述細(xì)胞為草魚腦細(xì)胞系GSB。
[0017] -種基于免疫過氧化物酶細(xì)胞單層試驗(yàn)的草魚呼腸孤病毒Π 型抗體檢測(cè)方法，包 括如下步驟： 1) 將固定有細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性抗原和細(xì)胞內(nèi)陰性抗原的細(xì)胞板，于室溫預(yù)熱25~35 min，PBS 洗1~2次； 2) 加入一抗:用PBS將待檢血清進(jìn)行系列稀釋后，分別加入固定有細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性抗原或細(xì) 胞內(nèi)陰性抗原的細(xì)胞板孔中，每孔80~130μΜ另外加入陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清分別 作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照； 3) 溫育和洗滌:36.5~37.5 °C濕盒孵育45~75min，PBS洗滌； 4) 加入二抗:加入稀釋如的抗草魚IgM單克隆抗體，每孔80~130yL; 5) 溫育和洗滌：同步驟3); 6) 顯色：加入底物ACE，每孔80~12〇uL，室溫顯色15~45 min; 7) 去除底物液，每孔加入roS，用光學(xué)顯微鏡觀察，判定結(jié)果。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是： 1、 本發(fā)明的基于免疫過氧化物酶細(xì)胞單層試驗(yàn)的草魚呼腸孤病毒Π 型抗體檢測(cè)試劑 盒可以對(duì)無(wú)明顯CPE(細(xì)胞病變）的Π 型草魚呼腸孤病毒進(jìn)行定量分析，測(cè)定病毒的濃度和 滴度； 2、 本發(fā)明的基于免疫過氧化物酶細(xì)胞單層試驗(yàn)的草魚呼腸孤病毒Π 型抗體檢測(cè)試劑 盒可以對(duì)草魚呼腸孤病毒Π 型特異性抗體的進(jìn)行定性檢測(cè)，同時(shí)可以檢測(cè)草魚多份血清樣 品并達(dá)到早期診斷的目的，對(duì)草魚出血病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查和病原監(jiān)測(cè)具有較高的臨 床使用及推廣價(jià)值； 3、 本發(fā)明的基于免疫過氧化物酶細(xì)胞單層試驗(yàn)的草魚呼腸孤病毒Π 型抗體檢測(cè)試劑 盒能用于疫苗免疫注射后抗體的檢測(cè)，進(jìn)行疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)，為草魚出血病的預(yù)防控 制和免疫監(jiān)測(cè)等提供科學(xué)的技術(shù)手段。通過該試劑盒的應(yīng)用，將為我國(guó)控制并最終消滅草 魚出血病提