一種肝竇內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型涉及一種肝竇內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)試劑盒，包括盒體和設(shè)在盒體內(nèi)的四個無菌密封瓶，所述四個無菌密封瓶內(nèi)分別裝有用于肝竇內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)的清洗濃縮液、消化液、分離液、培養(yǎng)液。該試劑盒包含分離培養(yǎng)肝竇內(nèi)皮細胞中所需的所有試劑，無需額外配制試劑，實驗方便快捷；所有的試劑瓶均采用無菌密封瓶，無需滅菌，操作簡單。
【專利說明】
_種肝竇內(nèi)皮細胞分禹培養(yǎng)試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本實用新型屬于細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種肝竇內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]肝竇內(nèi)皮細胞(Sinusoidal Endothelial cells, SECs)是肝臟內(nèi)數(shù)量最多的非實質(zhì)細胞，其在肝臟微循環(huán)、肝再生、肝移植缺血再灌注損傷及移植免疫耐受的誘導(dǎo)過程中的作用已引起科研人員重視，原代分離、培養(yǎng)高純度和高活力的肝竇內(nèi)皮細胞是研究其在肝臟各種病理生理環(huán)境中作用機制的基礎(chǔ)。
[0003]目前，肝竇內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)往往需要配置多種試劑完成清洗、消化、分離和培養(yǎng)等不同的步驟，不僅操作復(fù)雜而且還需要滅菌，整個分離培養(yǎng)過程效率較低。
【實用新型內(nèi)容】
[0004]本實用新型的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種包含實驗中所需的所有試劑無需額外配制試劑、無需滅菌、方便快捷的肝竇內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)試劑盒。
[0005]本實用新型所采用的技術(shù)方案是:
[0006]—種肝竇內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)試劑盒，包括盒體和設(shè)在盒體內(nèi)的四個無菌密封瓶，所述四個無菌密封瓶內(nèi)分別裝有用于肝竇內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)的清洗濃縮液、消化液、分離液、培養(yǎng)液。
[0007]進一步的，所述裝有清洗濃縮液、消化液和分離液的無菌密封瓶的容量為50mL，所述裝有培養(yǎng)液的無菌密封瓶的容量為100mL。
[0008]本實用新型的有益效果是:
[0009]該試劑盒包含肝竇內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)實驗中所需的所有試劑，無需額外配制試劑，實驗方便快捷;所有的試劑瓶均采用無菌密封瓶，無需滅菌，操作簡單。
【附圖說明】
[0010]圖1是本實用新型的示意圖。
[0011 ]圖中:1-盒體;2-裝有清洗濃縮液的無菌密封瓶;3-裝有消化液的無菌密封瓶;4-裝有分離液的無菌密封瓶;5-裝有培養(yǎng)液的無菌密封瓶;6-使用說明書。
【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合附圖和實施例對本實用新型作進一步說明。
[0013]如圖1所示，一種肝竇內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)試劑盒，包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的四個無菌密封瓶和使用說明書6，所述四個無菌密封瓶內(nèi)分別裝有用于肝竇內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)的清洗濃縮液、消化液、分離液、培養(yǎng)液;所述裝有清洗濃縮液、消化液和分離液的無菌密封瓶的容量為50mL，所述裝有培養(yǎng)液的無菌密封瓶的容量為100mL。該試劑盒包含肝竇內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)實驗中所需的所有試劑，無需額外配制試劑，實驗方便快捷;所有的試劑瓶均采用無菌密封瓶，無需滅菌，操作簡單。
[0014]下面以SD大鼠肝竇內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)實驗為例，說明該試劑盒在實驗中的應(yīng)用。
[0015]在本實施例中，所述清洗濃縮液為10XPBS溶液，使用本試劑盒時用無菌蒸餾水稀釋成I XPBS的工作液，用于灌注時沖洗血管內(nèi)的血細胞和PercolI溶液的配制。
[0016]在本實施例中，所述消化液為用PB S配制的膠原酶IV溶液，含0.2 %膠原酶IV、
0.001% DNase 1、5%胎牛血清，可將肝臟組織消化解離為單個細胞，本試劑盒采取離體反復(fù)多次消化的方式，能將肝臟組織充分消化成單細胞并節(jié)省酶的用量。
[0017]在本實施例中，所述分離液為100%Percoll分離液，使用時用I XPBS按體積比1:1和1: 3配制成50% Percol I和25% Percol I溶液，用于細胞密度梯度離心，吸取在50%和25%Percol I界面層間的細胞。
[0018]在本實施例中，所述培養(yǎng)液為在DMEM高糖的基礎(chǔ)上添加10%胎牛血清、100U/mL青霉素、lOOyg/mL鏈霉素和多種細胞生長因子，提供肝竇內(nèi)皮細胞生長所需營養(yǎng)。
[0019]在具體操作前，為保存酶和營養(yǎng)物質(zhì)的活性應(yīng)該將試劑盒置于2?8°C低溫保存。
[0020]實驗具體操作步驟如下:
[0021]1、將試劑盒內(nèi)溶液取出置于超凈工作臺內(nèi)，待溶液恢復(fù)至室溫。
[0022]2、用無菌蒸餾水按體積比9:1稀釋清洗濃縮液，即450mL蒸餾水:50mL清洗濃縮液，混勾后備用。
[0023]3、將SD大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，無菌狀態(tài)切開腹部，用輸液栗將清洗液以10mL/min的速度從門靜脈灌入，同時剪開肝下腔靜脈，讓清洗液流出，灌注將血管內(nèi)血液清洗干凈，減少后期消化所得的細胞含有血細胞，待肝臟由鮮紅色變成均勻的土黃色時終止灌注。
[0024]4、完整剪下肝臟置于平皿中，清洗液潤洗肝臟表面。用1mL消化液反復(fù)灌注2-3次，待肝實質(zhì)呈菜花狀、肝包膜已與實質(zhì)分離時用眼科鑷提起肝臟，去除包膜、血管及結(jié)締組織。
[0025]5、在平皿中將剩下的組織剪碎，剪成盡量小的組織塊，5mL消化液重懸后轉(zhuǎn)移到15mL離心管內(nèi)，37°C振蕩消化1min，加入培養(yǎng)液終止消化。
[0026]6、細胞懸液10g離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到無菌容器內(nèi)。沉淀的組織塊用清洗液洗一次后繼續(xù)用5mL消化液37°C振蕩消化，離心后收集上清，沉淀繼續(xù)消化，重復(fù)消化2-3次，將收集到的細胞懸液用150目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，收集濾過液。
[0027]7、濾過的肝臟細胞懸液用清洗液離心洗滌2次，400g離心1min，細胞沉淀用1mL
清洗液重懸。
[0028]8、清洗液按比例稀釋分離液，即清洗液:分離液按體積比1:1和3:1分別配制成50%Percoll和25% Percoll溶液。
[0029]9、在50mL尖底離心管中，沿管壁依次加入50% Percoll溶液15mL，25% Percoll溶液20mL和1mL細胞懸液，900g離心20min，小心吸取50%和25% Percoll界面層的富含肝竇內(nèi)皮細胞的混濁帶。
[0030]10、加等體積清洗液，混勻，900g離心lOmin，沉淀懸于1mL培養(yǎng)液中。用血細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，將細胞濃度調(diào)整為1.2?1.5 X 16個/mL，細胞懸液接種24孔板，每孔lmL。培養(yǎng)板放37°C溫箱靜置孵育20min，待KupfTer細胞選擇性貼壁后，收集未貼壁細胞懸液，即為肝竇內(nèi)皮細胞，37 °C溫箱繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細胞狀態(tài)，每兩天換新鮮培養(yǎng)液一次。
[0031]應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應(yīng)屬于本實用新型所附權(quán)利要求的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種肝竇內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)試劑盒，其特征在于:包括盒體和設(shè)在盒體內(nèi)的四個無菌密封瓶，所述四個無菌密封瓶內(nèi)分別裝有用于肝竇內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)的清洗濃縮液、消化液、分尚液、培養(yǎng)液。2.如權(quán)利要求1所述的一種肝竇內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)試劑盒，其特征在于:所述裝有清洗濃縮液、消化液和分離液的無菌密封瓶的容量為50mL，所述裝有培養(yǎng)液的無菌密封瓶的容量為I OOmL。
【文檔編號】C12N5/071GK205420442SQ201520725886
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年9月19日
【發(fā)明人】冷毅斌, 胡勤芹, 吳娟
【申請人】武漢普諾賽生命科技有限公司