Gpc1作為腫瘤診斷標(biāo)志物的用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供了GPC1蛋白作為腫瘤診斷標(biāo)志物的用途。GPC1蛋白作為腫瘤診斷標(biāo)志物可用于制備消化系統(tǒng)惡性腫瘤診斷試劑或試劑盒。本發(fā)明申請(qǐng)的腫瘤標(biāo)志物GPC1，目前在小規(guī)模臨床樣本中即可證實(shí)適合作為消化系統(tǒng)腫瘤的診斷標(biāo)志物，較傳統(tǒng)AFP、CEA、CA199等均具有更好的敏感性和特異性，可作為人群普查的腫瘤標(biāo)志物。
【專利說明】
GPC1作為腫瘤診斷標(biāo)志物的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及GPC1作為腫瘤診斷標(biāo)志物的用途，用于早期診斷腫瘤。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤標(biāo)志物是指特異性存在于惡性腫瘤細(xì)胞，或由惡性腫瘤細(xì)胞異常產(chǎn)生的物 質(zhì)，或是宿主對(duì)腫瘤細(xì)胞的刺激反應(yīng)而產(chǎn)生的物質(zhì)。腫瘤標(biāo)志物能夠反映腫瘤發(fā)生、發(fā)展， 監(jiān)測(cè)腫瘤對(duì)治療反應(yīng)的一類物質(zhì)。目前體檢常見的腫瘤標(biāo)志物包括:1 )CEA:常見于胃腸癌、 肺癌、卵巢癌等腫瘤中；2)AFP:是最早發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)識(shí)物，常見于原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌；3) PSA:常見于前列腺癌;4)CA199:常見于胰腺癌。但目前臨床應(yīng)用的腫瘤標(biāo)志物都缺乏很好 的敏感性和特異性，因此，對(duì)于新型高特異性敏感性腫瘤標(biāo)志物的開發(fā)十分關(guān)鍵，有利于我 們?cè)缙诎l(fā)現(xiàn)腫瘤、預(yù)測(cè)患者預(yù)后、和進(jìn)行個(gè)性化治療，并對(duì)腫瘤患者進(jìn)行管理和隨訪。
[0003] GPC1是一種細(xì)胞膜卯定蛋白，大量研究表明，GPC1在胰腺癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、 卵巢癌、結(jié)腸癌等實(shí)體瘤組織中呈高表達(dá)。血清中的外泌體是由正常細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞分 泌的微囊泡，對(duì)微環(huán)境的變化很穩(wěn)定。外泌體中含有蛋白質(zhì)、核酸等多種小分子物質(zhì)，可反 映機(jī)體的疾病狀態(tài)。
[0004] 發(fā)表在2015年nature上的一篇文章發(fā)現(xiàn)在胰腺癌患者的血清外泌體中明顯高表 達(dá)GPC1，而相比之下胰腺炎、良性胰腺病變和正常對(duì)照組中的血清外泌體GPC1的表達(dá)水平 較低，提示GPC1可能作為胰腺癌早期診斷的腫瘤標(biāo)志物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供GPC1蛋白的新用途。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0007] GPC1蛋白作為腫瘤診斷標(biāo)志物在制備消化系統(tǒng)惡性腫瘤診斷試劑或試劑盒中的 用途。
[0008] 優(yōu)選地，所述的消化系統(tǒng)惡性腫瘤為肝癌、胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌中的 至少一種。
[0009] 優(yōu)選地，所述的消化系統(tǒng)惡性腫瘤診斷試劑包括抗GPC1蛋白的抗體。
[0010] 優(yōu)選地，所述的GPC1蛋白為外泌體膜上卯定的GPC1蛋白。
[0011] -種消化系統(tǒng)惡性腫瘤診斷試劑盒，其特征在于，包括抗GPC1蛋白的抗體、帶熒光 的二抗，和可吸附外泌體并被流式細(xì)胞儀所檢測(cè)到的磁珠。
[0012]本發(fā)明通過納入64例胰腺癌、61例食管癌、54例胃腺癌、42例結(jié)直腸癌、30例肝癌， 并用30例正常對(duì)照、30例胃腸息肉、7例胰腺炎作對(duì)照，發(fā)現(xiàn)GPC1可作為消化系統(tǒng)惡性腫瘤 的診斷標(biāo)志物，且具有較高的敏感性和特異性。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0014] 1、本發(fā)明申請(qǐng)的腫瘤標(biāo)志物GPC1，目前在小規(guī)模臨床樣本中即可證實(shí)適合作為消 化系統(tǒng)腫瘤的診斷標(biāo)志物，較傳統(tǒng)AFP、CEA、CA199等均具有更好的敏感性和特異性，可作為 人群普查的腫瘤標(biāo)志物。
[0015] 2、目前大部分血清腫瘤標(biāo)志物采用ELISA或電化學(xué)發(fā)光的方法，檢測(cè)血清中的腫 瘤相關(guān)蛋白，有如下問題：1)如果該腫瘤相關(guān)蛋白不是膜蛋白，則部分血清中的腫瘤蛋白被 外泌體包被起來，ELISA無法檢測(cè)到，僅能夠檢測(cè)血清中游離的腫瘤蛋白，從而產(chǎn)生誤差。2) 血清中游離的腫瘤蛋白受保存條件和檢測(cè)時(shí)間影響易降解或變性，都會(huì)使檢測(cè)結(jié)果受到影 響。3)血清中游離的腫瘤蛋白不同于外泌體所包含蛋白，大部分由細(xì)胞崩解所被動(dòng)產(chǎn)生，因 此易受炎癥和藥物等影響，對(duì)于腫瘤的診斷敏感性和特異性較低。
[0016] 3、血清中的外泌體對(duì)保存環(huán)境和檢測(cè)時(shí)間都很穩(wěn)定，不易被降解，且外泌體內(nèi)的 蛋白、核酸等均為細(xì)胞主動(dòng)或被動(dòng)分泌，為功能性的，更具診斷價(jià)值。而本發(fā)明通過提取血 清中的外泌體，檢測(cè)外泌體表面的膜鉚釘?shù)鞍譍PC1，可保證結(jié)果的穩(wěn)定和可靠。
【附圖說明】
[0017] 圖1各組血清外泌體GPC1陽性率柱狀圖，可見肝癌、胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌、胰腺 癌中血清外泌體GPC1陽性率明顯高于胃腸息肉、胰腺炎和正常組，P值〈0.01。
[0018] 圖2為R0C曲線圖，如圖2所示，外泌體GPC1陽性率可診斷肝癌、胃癌、食管癌、結(jié)直 腸癌、胰腺癌，且相比于傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物CA199、AFP、CEA具有較高的敏感性和特異性。圖 中，A為GPC1和CA199對(duì)胰腺癌診斷的R0C曲線，B為GPC1和AFP對(duì)肝癌診斷的R0C曲線，C為 GPC1和CEA對(duì)胃癌診斷的R0C曲線，D為GPC1對(duì)食管鱗癌診斷的R0C曲線，E為GPC1和CEA對(duì)胰 腺癌診斷的R0C曲線。
[0019] 圖3為胰腺癌患者術(shù)前和術(shù)后(術(shù)后5天)血清中GPCl+crExos的表達(dá)水平圖，如圖3 所示，胰腺癌患者術(shù)后5天血清外泌體GPC1陽性率明顯低于術(shù)前。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0021] 實(shí)施例
[0022] 1、實(shí)驗(yàn)方法：
[0023] (1)病人和樣本納入：
[0024]在本實(shí)驗(yàn)中，共納入了64個(gè)胰腺癌患者，61個(gè)食管鱗癌患者，54個(gè)胃腺癌患者，42 個(gè)結(jié)直腸癌患者，30例肝癌患者，30個(gè)胃腸息肉患者，7個(gè)胰腺炎患者，和30個(gè)正常人對(duì)照。
[0025] 腫瘤患者的入選和排除標(biāo)準(zhǔn)包括：1)有明確的病理診斷確診為相應(yīng)腫瘤;2)初診 腫瘤，之前沒有進(jìn)行過任何抗癌治療;3)沒有其他急性疾病或者系統(tǒng)性疾病例如自身免疫 性疾病、糖尿病、冠心病等。
[0026] 對(duì)照組的患者要求沒有急性疾病或者系統(tǒng)性疾病。
[0027] (2)樣品收集
[0028]血樣采集后置于黃頭促凝管中，在4°C下以離心力2500g離心10分鐘，吸取上層淡 黃色血清之后存儲(chǔ)于-80°C冰箱中。
[0029] 外泌體的提取借助Invitrogen公司Total Exosome Isolation試劑盒，提取方法 如下：20yl提取試劑加入100ul血清中，4°C孵育30分鐘，之后在室溫以離心力10,000g離心 10分鐘，棄去上清，沉淀溶于40ul 1 X PBS中，即為外泌體。
[0030] (3)流式分析外泌體包被磁珠
[0031 ] 取100ul血清中所提的外泌體中加入5ul 4-ym aldehyde/sulphate latex磁珠 (Invitrogen)室溫顛倒翻轉(zhuǎn)15分鐘混勾，之后加入lml PBS繼續(xù)室溫顛倒旋轉(zhuǎn)30分鐘。加入 0.5ml 100mM glycine(甘氨酸)和2%BSA(牛血清白蛋白）室溫顛倒旋轉(zhuǎn)30分鐘。以離心力 14，800g離心1分鐘后沉淀為外泌體包被磁珠，用2 %BSA清洗并再次離心，沉淀用10 %BSA終 止反應(yīng)。再次用2%BSA清洗磁珠后用GPC1-抗（Invitrogen，濃度為3yl抗體加入20yl 2% BSA中）室溫孵育30分鐘。清洗后用Alexa-488標(biāo)記的熒光二抗（Invitrogen，濃度為3yl抗體 加入20yl 2%BSA中）4°C孵育半小時(shí)。之后用2%BSA反復(fù)清洗并離心2次。沉淀用100ul 2% BSA溶解并避光保存。僅用二抗孵育的樣品作為陰性對(duì)照并設(shè)門。樣品用流式細(xì)胞儀檢測(cè) GPC1+的外泌體包被磁珠，100，000個(gè)磁珠中GPC1陽性率作為每個(gè)樣品的最終指標(biāo)。
[0032] (4)統(tǒng)計(jì)方法
[0033]統(tǒng)計(jì)米用SPSS 19.0for Windows(SPSS Inc.，Chicago，USA)軟件進(jìn)行。
[0034] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0035] (1)、如圖1所示，腫瘤患者血清中GPC1+外泌體(GPCl+crExos)水平明顯增高：
[0036] 正常人GPCl+crExos平均值為0 ? 67 ± 0 ? 12 % (范圍從0 ? 12到2 ? 29 % )
[0037] 胃腸息肉1.12±0.36%(范圍從0.006到10.4%)
[0038] 胰腺炎0 ? 69 ±0 ? 22% (范圍從0 ? 24到 1 ? 87 % )
[0039] 肝癌 10.20± 1.44% (范圍從0.76到32%)
[0040] 胃腺癌29 ? 96±3 ? 64% (范圍從2 ? 68到99 ? 5% )
[0041 ]食管鱗癌30.91 ±3.01 % (范圍從 1.18到97.9%)
[0042] 結(jié)直腸癌33.18±3.05% (范圍從5.65到81.7%)
[0043] 胰腺癌 34.34±3.01%(范圍從 3.44 到 99 ? 8 % )
[0044] P<〇.〇〇〇1〇
[0045] (2)、GPCl+crEX〇S可作為胃腸系統(tǒng)腫瘤的診斷標(biāo)志物(表1，圖2)
[0046] 采用R0C曲線圖計(jì)算相應(yīng)的腫瘤蛋白在診斷腫瘤時(shí)工作曲線下面積和診斷的精確 性、敏感性，從而得到表1和圖2。傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物采用Roche cobas e411全自動(dòng)電化學(xué)免疫 發(fā)光分析儀和配套試劑檢測(cè)獲得。
[0047]表1 GPC1陽性的外泌體水平和傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物診斷效率
[0048]

[0050] 縮寫:AUC代表曲線下面積，ROC代表工作曲線特性;95 % CI代表95 %可信區(qū)間；
[0051 ]如圖2所示，外泌體GPC1陽性率可診斷肝癌、胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌，且相 比于傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物CA199、AFP、CEA具有較高的敏感性和特異性。
[0052]從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，陽性率達(dá)到2.035%以上有腫瘤風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng)陽性率成倍增長 時(shí)提示腫瘤風(fēng)險(xiǎn)大，需進(jìn)一步行影像學(xué)或胃腸鏡檢查。
[0053] (3)、GPCl+crExos水平和臨床特點(diǎn)間的關(guān)系
[0054]選取的病人和樣本的臨床特點(diǎn)如表2、3所示：
[0055]表2納入病人臨床資料：
[0056]

[0058]表3 GPC1陽性外泌體水平和患者臨床特性之間的關(guān)系：

[0061 ] 通過上述軟件分析得到GPCl+crExos水平和胰腺腫瘤侵犯深度(P = 0.042)、食管 鱗癌17#分期相關(guān)(P = 0.019)，另外在胰腺癌患者中男性患者血清GPCl+crExos水平更高(P =0.002)。因此，GPC1蛋白在胰腺腫瘤中侵犯越深則表達(dá)水平越高，在食管鱗癌TM1分期越 晚期則表達(dá)水平越高。
[0062] (4)、GPC1與患者預(yù)后復(fù)發(fā)相關(guān)
[0063]在上述的64個(gè)胰腺癌患者中，選取12例胰腺癌患者，采用上述實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)12例 胰腺癌患者術(shù)前和術(shù)后(術(shù)后5天)血清中GPCl+crExos的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)11個(gè)患者術(shù)后GPC1 +crExos的表達(dá)水平發(fā)生明顯下降(P = 0.020，如圖3所示）。由于術(shù)后GPCl+crExos的表達(dá)水 平明顯下降，提示其表達(dá)與腫瘤負(fù)荷相關(guān)。因此在復(fù)發(fā)情況下可能再次升高。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. GPC1蛋白作為腫瘤診斷標(biāo)志物在制備消化系統(tǒng)惡性腫瘤診斷試劑或試劑盒中的用 途。2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的消化系統(tǒng)惡性腫瘤為肝癌、胃癌、食管 癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌中的至少一種。3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的消化系統(tǒng)惡性腫瘤診斷試劑包括抗 GPC1蛋白的抗體。4. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的GPC1蛋白為外泌體膜上卯定的GPC1蛋 白。5. -種消化系統(tǒng)惡性腫瘤診斷試劑盒，其特征在于，包括抗GPC1蛋白的抗體、帶熒光的 二抗，和可吸附外泌體并被流式細(xì)胞儀所檢測(cè)到的磁珠。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK106053815SQ201610513757
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月1日
【發(fā)明人】沈錫中, 陳妍潔, 吳昊, 劉韜韜, 董玲
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院