專利名稱：蛋白質(zhì)復(fù)合物及其在腫瘤診斷和/或預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了蛋白質(zhì)復(fù)合物，還提供了所述蛋白質(zhì)復(fù)合物在制備用于診斷和/或預(yù)后評(píng)估癌癥的試劑中的用途，及利用所述蛋白質(zhì)復(fù)合物的相關(guān)信息診斷和/或預(yù)后評(píng)估哺乳動(dòng)物包括人的癌癥的方法。本發(fā)明通過(guò)分析血清中蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在形式和定量分析，可以對(duì)肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌和甲狀腺癌等及其它慢性疾病進(jìn)行輔助診斷和/或預(yù)后評(píng)估。
背景技術(shù)：
目前使用的癌癥標(biāo)志物主要指癌細(xì)胞分泌或脫落到體液或組織中的物質(zhì)，或是宿主對(duì)體內(nèi)新生物反應(yīng)而產(chǎn)生并進(jìn)入到體液或組織中的物質(zhì)。臨床上常用的癌癥標(biāo)志物有前列腺特異性抗原(PSA，可輔助診斷前列腺癌)；甲胎蛋白(AFP，可輔助診斷急慢性肝炎、 原發(fā)性肝癌等)；癌胚抗原(CEA，在結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌、肺癌和乳腺癌中有較高的表達(dá))；糖蛋白抗原CA125(可輔助診斷卵巢癌)；CA19-9(在胰腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、胃癌、膽囊癌、肺癌和乳腺癌等中均有高表達(dá))；鱗狀細(xì)胞相關(guān)抗原(SCC，可輔助診斷鱗狀上皮癌)；細(xì)胞角蛋白19 (與CEA聯(lián)合應(yīng)用可輔助診斷肺癌)。這些標(biāo)志物都是單一肽鏈蛋白，其檢測(cè)方法是利用免疫發(fā)光法檢測(cè)，其操作復(fù)雜，費(fèi)用較高，敏感性或特異性不高(Sturgeon，C.M. etal.Serumtumour markers how to order and interpret them. BMJ. 2009,339 :852-858.Hartwell, L et al.Cancer biomarkers a systems approach. Nat Biotechnol.2006，24(8) :905-908.)。這些標(biāo)志物有的不存在于正常人體內(nèi)，有的在癌癥病人體內(nèi)含量超過(guò)健康人體內(nèi)含量。通過(guò)測(cè)定其存在或含量可輔助診斷腫瘤、分析病程、指導(dǎo)治療、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、判斷預(yù)后。一般認(rèn)為好的癌癥標(biāo)志物應(yīng)具有下列特點(diǎn)(I)敏感性高，能早期測(cè)出癌癥患者；(2)特異性好；(3)有器官特異性，能對(duì)癌癥定位；(4)血清中濃度與瘤體大小、臨床分期相關(guān)，可用以判斷預(yù)后；(5)半衰期短，能反映癌癥的動(dòng)態(tài)變化，監(jiān)測(cè)治療效果、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；(6)測(cè)定方法準(zhǔn)確性高，操作簡(jiǎn)便，價(jià)廉。但至今為止，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這類癌癥標(biāo)志物。蛋白質(zhì)復(fù)合物(protein complex)是指具有兩個(gè)或兩個(gè)以上多肽鏈非共價(jià)鍵相互作用所形成的復(fù)合物。一般蛋白質(zhì)復(fù)合物可分為結(jié)構(gòu)型蛋白質(zhì)復(fù)合物和功能型蛋白質(zhì)復(fù)合物。蛋白質(zhì)復(fù)合物在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。這種相互作用存在于機(jī)體細(xì)胞的生命活動(dòng)過(guò)程中，參與代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)移、信息傳遞等，不同的蛋白質(zhì)復(fù)合物具有不同的生物學(xué)功倉(cāng)泛(Babusiak, M. , et al. Native proteomic analysis of protein complexesin murine intestinalbrush border membranes. Proteomics. 2007, 7(I) :121-129.)。血液中蛋白質(zhì)復(fù)合物在調(diào)節(jié)凝血過(guò)程、疾病發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，例如甲胎蛋白-IgM的復(fù)合物在原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者血清中含量升高，利用免疫學(xué)方法檢測(cè)此復(fù)合物可診斷原發(fā)性肝細(xì)胞癌，其靈敏性和特異性優(yōu)于單獨(dú)使用甲胎蛋白(Jingting，J.，et al. Clinical evaluation of serumalpha—fetoprotein—IgM immune complexes onthe diagnosis of primary hepatocellular carcinoma. JClin Lab Anal. 2009，23 (4)213-218.)。因此，如果能發(fā)現(xiàn)新的可用于診斷惡性疾病，特別是腫瘤的蛋白質(zhì)復(fù)合物及利用所述蛋白質(zhì)復(fù)合物簡(jiǎn)便地診斷和/或輔助診斷或預(yù)后評(píng)估惡性疾病，特別是腫瘤的方法將具有重要的經(jīng)濟(jì)、健康和社會(huì)效益
發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的技術(shù)目的在于發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)復(fù)合物及其在慢性疾病，特別是腫瘤診斷和/或預(yù)后評(píng)估中的用途。因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，其具有通式I :[ (HPT) nl (CFH) n2 (C3) n3 (C4A) n4 (C5) n5 (C7) n6 (IgGl)n7 (ApoA-I) n8 (IgAl)n9],其中，HPT代表觸珠蛋白，Apo A-I代表載脂蛋白A_I，CFH代表補(bǔ)體H，C3代表補(bǔ)體3，C4A代表補(bǔ)體4A，C5代表補(bǔ)體5，Cl代表補(bǔ)體7，IgGl代表免疫球蛋白Gl, IgAl代表免疫球蛋白Al ；其中，nl= 1、2、3、4 或 5, n2 = 0 或 I, n3 = 0 或 I, n4 = 0 或 I, n5 = 0 或 I, n6=0或1,117 = 0、1、2、3、4或5,118 = 0或1,119 = 0或1;且其中該蛋白質(zhì)復(fù)合物的分子量范圍為140 1400kDa。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)復(fù)合物具有選自通式II至VII的通式，其中通式II [ (HPT)nl (CFH)n2(C3)n3(C4A)n4 (IgGl)n7 (IgAl)n9],其中 nl = 1、2 或 3，n2 = l，n3 =1，n4 = 1，n7 = 1，n9 = I ；通式III [ (HPT)nl(C3)n3(C4A)n4 (IgGl)n7 (Apo A_I)n8 (IgAl)n9]，其中 nl = 1、2 或 3，n3 = 1，n4 = 1，n7 = 1，n8 = 1，n9 = I ；通式IV :[ (HPT)nl (C3)n3(C4A)n4 (IgGl)n7 (IgAl)n9],其中 nl = 1、2 或 3，n3 = 1，n4 = 1，n7=1，n9 = I ;通式V:[ (HPT)nl (C3)n3(C4A)n4(C5)n5(C7)n6 (IgGl)n7 (IgAl)n9]，其中 nl = 1、2 或 3，n3= 1，n4 = 1，n5 = 1，n6 = 1，n7 = 1，n9 = I ；通式VI [ (HPT)nl (C3)n3(Apo A_I)n8(IgAl)n9]，其中 nl = 1、2 或 3,n3 = I, n8 = I, n9 = I或通式VII:[ (HPT)nl (CFH)n2(C3)n3 (IgGl)n7 (IgAl)n9L 其中 nl = 1、2、3、4 或 5，n2 = l，n3 = 1，n7 = 1、2、3、4 或 5，n9 = I。本發(fā)明的第二方面涉及上述的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其用于制備診斷和/或預(yù)后評(píng)估哺乳動(dòng)物包括人癌癥的試劑，優(yōu)選地，所述癌癥選自肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、胃癌或甲狀腺癌。本發(fā)明的第三方面涉及上述的蛋白質(zhì)復(fù)合物在制備診斷和/或預(yù)后評(píng)估哺乳動(dòng)物包括人癌癥的試劑中的用途，優(yōu)選地，所述癌癥選自肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、胃癌或甲狀腺癌。本發(fā)明的第四方面涉及一種診斷和/或預(yù)后評(píng)估哺乳動(dòng)物包括人癌癥的方法，其包括以下步驟A)獲取患者或健康狀況未知的哺乳動(dòng)物包括人血液，經(jīng)離心后得到血清或血漿，作為樣本；B)分別取0. 5 100 ii L樣本和等體積的0. 5 100 U L外參照血清，進(jìn)行native-PAGE電泳,所述外參照血清為混合的健康人血清,其中native-PAGE電泳的條件按本領(lǐng)域的常規(guī)條件進(jìn)行，分離膠的濃度為4% -10%質(zhì)量體積比；C)電泳完畢后，用本領(lǐng)域已知的凝膠染色方法將凝膠染色，然后掃描凝膠，獲得凝膠電泳圖，優(yōu)選地，所述凝膠染色方法為銀染或考馬斯亮藍(lán)染色；D)根據(jù)上述步驟C)電泳圖中的凝膠條帶，對(duì)照說(shuō)明書附圖
I中的條帶類型，將樣本血清歸類，其中標(biāo)記凝膠條帶時(shí)按條帶分子量從大到小的順序從I開始進(jìn)行；E)利用Quantity One軟件分析上述步驟C)凝膠電泳圖中樣本和對(duì)照的目標(biāo)條帶，以代表轉(zhuǎn)鐵蛋白相關(guān)復(fù)合物的第19個(gè)凝膠條帶為內(nèi)參照，將其含量歸一化，利用軟件，輸出歸一化后每個(gè)凝膠條帶的光密度值，記為NQn，其中n為凝膠條帶的標(biāo)記；F)利用下面的公式依次計(jì)算樣本中每個(gè)凝膠條帶的相對(duì)表達(dá)量，記為ratio，
ration = [NQn]樣本/[NQn]外參照,其中n為凝膠條帶的標(biāo)記；G)根據(jù)上述步驟D)中樣本血清的類型，選擇相應(yīng)的相對(duì)表達(dá)量值帶入到回歸方程，計(jì)算分值，記為score，然后對(duì)比下表中癌癥的閾值，判斷樣本是否為癌癥或其它慢性疾病，
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，其具有通式I: [(HPT) nl (CFH) n2 (C3) n3 (C4A) n4 (C5) n5 (C7) n6 (IgGl)n7 (ApoA-I) n8 (IgAl)n9], 其中，HPT代表觸珠蛋白，Apo A-I代表載脂蛋白A-I，CFH代表補(bǔ)體H，C3代表補(bǔ)體3，C4A代表補(bǔ)體4A，C5代表補(bǔ)體5，C7代表補(bǔ)體7，IgGl代表免疫球蛋白Gl，IgAl代表免疫球蛋白Al ； 其中，nl = 1、2、3、4或5,112 = 0或1,113 = 0或1,114 = 0或1,115 = 0或1,116 = 0或 l,n7 = 0、1、2、3、4 或 5,n8 = 0 或 l,n9 = 0 或 I ; 且其中該蛋白質(zhì)復(fù)合物的分子量范圍為140 1400kDa。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其特征在于所述蛋白質(zhì)復(fù)合物具有選自下述通式II至通式VII的通式，其中 通式II [(HPT)nl (CFH)n2(C3)n3(C4A)n4 (IgGl)n7 (IgAl)n9],其中 nl = 1、2 或 3，n2 = 1，n3 = 1，n4 = I, n7 = I, n9 = I ； 通式III [(HPT)nl (C3)n3 (C4A)n4 (IgGl)n7 (Apo A_I)n8 (IgAl)n9]，其中 nl = 1、2 或 3，n3 = l，n4 =I, n7 = I, n8 = I, n9 = I ； 通式IV [(HPT)nl (C3)n3(C4A)n4 (IgGl)n7 (IgAl)n9],其中 nl = 1、2 或 3，n3 = l，n4 = l，n7 = 1，n9 = I ； 通式V [(HPT)nl (C3)n3 (C4A)n4 (C5)n5 (C7)n6 (IgGl)n7 (IgAl)n9]，其中 nl = I、2 或 3，n3 = I，n4 =I, n5 = I, n6 = I, n7 = I, n9 = I ； 通式VI [(HPT)nl (C3)nS (Apo A-I)n8 (IgAl)n9],其中 nl = 1、2 或 3, n3 = I, n8 = I, n9 = I 或 通式VII [(HPT)nl (CFH)n2(C3)n3 (IgGl)n7 (IgAl)n9L 其中 nl = 1、2、3、4 或 5，n2 = 1，n3 = 1，n7=1、2、3、4 或 5,n9 = I。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其用于制備診斷和/或預(yù)后評(píng)估哺乳動(dòng)物包括人癌癥的試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其特征在于所述癌癥選自肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、胃癌或甲狀腺癌。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物在制備診斷和/或預(yù)后評(píng)估哺乳動(dòng)物包括人癌癥的試劑中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述癌癥選自肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、胃癌或甲狀腺癌。
7.—種診斷和/或預(yù)后評(píng)估哺乳動(dòng)物包括人癌癥的方法，其包括以下步驟 A)獲取患者或健康狀況未知的哺乳動(dòng)物包括人血液，經(jīng)離心后得到血清和血漿，作為樣本； B)分別取0.5 100 ii L樣本和等體積的0. 5 100 ii L外參照血清，進(jìn)行native-PAGE電泳，所述外參照血清為混合的健康人血清，其中native-PAGE電泳的條件按本領(lǐng)域的常規(guī)條件進(jìn)行，分離膠的濃度為4% -10%質(zhì)量體積比； C)電泳完畢后，用本領(lǐng)域已知的凝膠染色方法將凝膠染色，然后掃描凝膠，獲得凝膠電泳圖，優(yōu)選地，所述凝膠染色方法為銀染或考馬斯亮藍(lán)染色； D)根據(jù)上述步驟C)電泳圖中的凝膠條帶，對(duì)照說(shuō)明書附圖I中的條帶類型，將樣本血清歸類，其中標(biāo)記凝膠條帶時(shí)按條帶分子量從大到小的順序從I開始進(jìn)行； E)利用QuantityOne軟件分析上述步驟C)凝膠電泳圖中樣本和對(duì)照的目標(biāo)條帶，以代表轉(zhuǎn)鐵蛋白相關(guān)復(fù)合物的第19個(gè)凝膠條帶為內(nèi)參照，將其含量歸一化，利用軟件，輸出歸一化后每個(gè)凝膠條帶的光密度值，記為NQn，其中n為凝膠條帶的標(biāo)記； F)利用下面的公式依次計(jì)算樣本中每個(gè)凝膠條帶的相對(duì)表達(dá)量，記為ratio， ration = [NQJ樣本/[NQn]外參照,其中n為凝膠條帶的標(biāo)記； G)根據(jù)上述步驟D)中樣本血清的類型，選擇相應(yīng)的相對(duì)表達(dá)量值帶入到回歸方程，計(jì)算分值，記為score，然后對(duì)比下表中癌癥的閾值，判斷樣本是否為癌癥或其它慢性疾病
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的診斷和/或預(yù)后評(píng)估哺乳動(dòng)物包括人癌癥的方法，其特征在于所述癌癥選自肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、胃癌或甲狀腺癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)復(fù)合物及其在腫瘤診斷和/或預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)復(fù)合物、用于制備診斷和/或預(yù)后評(píng)估哺乳動(dòng)物包括人癌癥的試劑的蛋白質(zhì)復(fù)合物、診斷哺乳動(dòng)物包括人癌癥的方法。本發(fā)明利用積累的資料總結(jié)出了人類血清或血漿在非變性PAGE電泳上蛋白質(zhì)復(fù)合物的主要類型及主要蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成并建立了蛋白質(zhì)復(fù)合物含量與腫瘤間的關(guān)系，為腫瘤及其它慢性疾病的診斷和/或預(yù)后評(píng)估提供一種新的方法。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102633882SQ20111003763
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2011年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月14日
發(fā)明者李智立, 王彥英 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所