冷休克蛋白質(zhì)組合物和用于其用途的方法以及試劑盒的制作方法
【專利說明】冷休克蛋白質(zhì)組合物和用于其用途的方法以及試劑盒
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年3月2日、申請(qǐng)?zhí)枮?00980106857. 9、發(fā)明名稱為"冷 休克蛋白質(zhì)組合物和用于其用途的方法以及試劑盒"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 優(yōu)先權(quán)聲明
[0003] 本申請(qǐng)要求提交于2008年2月29日的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/067, 596,提交于2008 年10月9日的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/195, 747,以及提交于2008年5月16日的日本申請(qǐng)?zhí)?2008-129745的優(yōu)先權(quán)，這些公開的內(nèi)容在此處全部并入本文作為參考。
[0004] 序列列表
[0005] 隨本文一并提交書寫形式的及計(jì)算機(jī)可讀形式的序列列表。計(jì)算機(jī)可讀形式記錄 的信息與書寫形式的序列列表是相同的。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 在研究領(lǐng)域，將DNA的合成用于多種目的。其中，除了化學(xué)合成短鏈DNA如寡聚核 苷酸之外，通過使用了DNA聚合酶的酶促方法進(jìn)行DNA合成中的大部分。PCR可在體外容易 地?cái)U(kuò)增所需要的核酸片段，有極高的價(jià)值，并已經(jīng)成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和其他領(lǐng)域中不 可缺少的工具。在由PCR擴(kuò)增DNA的過程中，許多情況下都要求反應(yīng)的高特異性。盡管開 發(fā)了新型DNA聚合酶，也優(yōu)化了反應(yīng)混合物的組成以減少非-特異性擴(kuò)增，但是仍然需要對(duì) PCR擴(kuò)增特異性的改進(jìn)。
[0008] 除了使用DNA作為模板材料的傳統(tǒng)PCR方法之外，還可使用RNA-依賴的DNA聚合 酶逆轉(zhuǎn)錄酶實(shí)現(xiàn)DNA的合成。在研究領(lǐng)域中，常常有必要分析衍生自多種基因的mRNA分 子。逆轉(zhuǎn)錄酶使得用RNA作為模板合成cDNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成為可能，并且因此，已經(jīng)在對(duì) mRNA分子的分析上實(shí)現(xiàn)了卓越的進(jìn)步。通過在克隆技術(shù)和PCR技術(shù)的應(yīng)用，其中使用了逆 轉(zhuǎn)錄酶的mRNA分子的分析現(xiàn)在在遺傳學(xué)研究中是不可缺少的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，并且已經(jīng)成為多 種領(lǐng)域如生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)中絕對(duì)必要的技術(shù)。
[0009] 迄今已經(jīng)產(chǎn)生了一些手段以改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)性，例如，已經(jīng)研究了在高溫 下進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程；在其中使用了逆轉(zhuǎn)錄酶以及具有3' -5'外切核酸酶活性的酶的 cDNA合成過程（JP專利號(hào)3910015);其中使用了核酸-結(jié)合蛋白質(zhì)如Ncp7、reCA、SSB及 T4gp32的過程（W0 00/55307);等等。盡管有一些對(duì)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)性的改進(jìn)，然而可能 無法合成全長的cDNA，并且甚至在如今，有些情況下所合成的cDNA的量可能不足。因此，對(duì) 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)性的改進(jìn)仍然是正進(jìn)行的大事，必須要進(jìn)一步改進(jìn)。
[0010] 除了對(duì)上文描述的兩種DNA合成方法的改進(jìn)之外，在科學(xué)領(lǐng)域還需要可以確定內(nèi) 切核糖核酸酶的切割位點(diǎn)特異性的技術(shù)。例如，mRNA干擾酶為存在于廣泛的細(xì)菌基因組中 的毒素_抗毒素系統(tǒng)編碼的序列-特異性內(nèi)切核糖核酸酶。這些內(nèi)切核糖核酸酶通常具有 單鏈RNA內(nèi)的特異性切割位點(diǎn)：大腸桿菌（E.coli)MazF在ACA序列處特異性切割，ChpBK 在ACY序列處（Y為U、A或G)特異性切割，來自質(zhì)粒R100的PemK在UAH序列處（其中H 為C、A或U)特異性切割，來自結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis)的MazF-mtl和MazF_mt6 分別在UAC和U富含區(qū)域特異性切割。最近，有發(fā)現(xiàn)來自金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的MazF同源物在VUUV'處進(jìn)行切割（其中V和V'為A、C或G，且可以相同或不相 同）。然而確定分支結(jié)核桿菌的一些MazF同源物的切割特異性的之前嘗試卻失敗了。尤其 是對(duì)于確定其中識(shí)別長于三個(gè)堿基的特異性序列的切割特異性，使用足夠長以覆蓋所有可 能的靶標(biāo)序列的RNA底物是至關(guān)重要的。使用長RNA作為底物的一個(gè)主要問題在于盡管其 為單鏈RNA，卻形成非常穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。為了使用這種或任何其他長RNA作為內(nèi)切核糖 核酸酶的底物，必須解折疊其二級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，還有對(duì)開發(fā)用以確定內(nèi)切核糖核酸酶如mRNA 干擾酶的切割-位點(diǎn)特異性的新技術(shù)的需要。
[0011] 在多種微生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有冷休克蛋白質(zhì)，人們認(rèn)為其在對(duì)生長溫度下移的適 應(yīng)中起到一些作用。其中，已經(jīng)鑒定CspA為一種主要的冷休克蛋白質(zhì)。從大腸桿菌 (Escherichiacoli)中分離出編碼CspA的基因，并使用其基因產(chǎn)生了重組CspA(見TO 90/09444)。然而，冷休克蛋白質(zhì)的常規(guī)提出的應(yīng)用限于其作為冷凍保護(hù)蛋白質(zhì)的用途，其 保護(hù)農(nóng)田中不受冷凍或霜凍損害。
[0012] 本發(fā)明提供了用于改進(jìn)的DNA合成反應(yīng)（具有改進(jìn)的反應(yīng)性）的包含冷休克蛋白 質(zhì)的組合物，使用這些組合物用于合成DNA的方法，在這些方法中使用的試劑盒，以及通過 這些方法產(chǎn)生的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于鑒定內(nèi)切核糖核酸酶切割位點(diǎn)的包含冷休 克蛋白質(zhì)的組合物，使用這些組合物用于鑒定內(nèi)切核糖核酸酶切割位點(diǎn)的方法，以及在這 些方法中使用的試劑盒。
[0013] 發(fā)明概述
[0014] 根據(jù)本發(fā)明，提供了使用DNA聚合酶用于DNA合成的組合物，使用這種組合物用于 合成DNA的方法，用于這種DNA合成方法的試劑盒，以及根據(jù)所提供這種方法合成的DNA組 合物。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是使得使用DNA聚合酶進(jìn)行DNA合成成為可能，其中反應(yīng)的反應(yīng) 性得到改進(jìn)。
[0015] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及用于DNA合成的組合物，其包含冷休克蛋白質(zhì)和DNA 聚合酶。在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，作為此冷休克蛋白質(zhì)的示例為CspA或其同源物，優(yōu) 選地，為衍生自大腸桿菌的CspA或其同源物。組合物可包含超過0. 5yg的CspA每25yL 組合物。根據(jù)這種實(shí)施方式的組合物可包含兩種或多種DNA聚合酶。進(jìn)一步地，根據(jù)這種 實(shí)施方式的組合物可包含至少一種引物和至少一種脫氧核苷酸。這種組合物可進(jìn)一步包 括液體媒介物，如反應(yīng)緩沖溶液。
[0016] 本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式包含A)冷休克蛋白質(zhì)；B)至少一種選自DNA聚 合酶、引物、脫氧核苷酸、和DNA的組分；以及C)液體媒介物。
[0017] 本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式涉及合成DNA的方法，其包括步驟:A)制備包含 冷休克蛋白質(zhì)、DNA聚合酶、至少一種引物、至少一種脫氧核苷三磷酸、和DNA的混合物；以 及B)孵育步驟A)中制備的混合物。
[0018] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及用于DNA合成的試劑盒，其包含冷休克蛋白質(zhì)和 DNA聚合酶。根據(jù)這種實(shí)施方式的試劑盒可進(jìn)一步包含液體媒介物或關(guān)于如何使用試劑盒 的紙質(zhì)或電子形式的說明書。這種試劑盒的組分可單獨(dú)地或分開地存在。
[0019] 本發(fā)明還涉及由包括以下步驟的方法合成的DNA組合物：A)制備包含冷休克蛋白 質(zhì)、DNA聚合酶、至少一種引物、至少一種脫氧核苷的混合物、和DNA;以及B)孵育步驟A)中 制備的混合物。
[0020] 本發(fā)明還涉及有利地用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的組合物，使用所述組合物的CDNA合成方 法，有利地用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的試劑盒，以及由此方法合成的cDNA組合物。根據(jù)本發(fā)明，可實(shí) 現(xiàn)這種令人滿意的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其在特異性、合成鏈的長度、合成量等等方面是出眾的。 [0021] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的組合物，其包含冷休克蛋白質(zhì)或其 同源物；和逆轉(zhuǎn)錄酶。在根據(jù)本發(fā)明的這種實(shí)施方式中，冷休克蛋白質(zhì)的實(shí)例是CspA或其 同源物，CspA的一個(gè)實(shí)例為衍生自大腸桿菌的CspA。在一些實(shí)施方式中，CspA可以從大約 0. 5yg-大約20ygCspA每20yL的組合物的量存在。逆轉(zhuǎn)錄酶的實(shí)例為衍生自莫洛尼鼠 類白血病病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶和/或衍生自禽成髓細(xì)胞瘤病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶和/或 其組合。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的此實(shí)施方式中的組合物可進(jìn)一步包含至少一種引物和至 少一種脫氧核苷酸。組合物的進(jìn)一步的實(shí)施方式包含液體媒介物，如反應(yīng)緩沖溶液。其他 實(shí)施方式包含寡聚（dT)引物或具有隨機(jī)序列的寡聚核苷酸引物或其組合。
[0022] 本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式包含用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的組合物，其包含：A)冷休 克蛋白質(zhì)；B)至少一種選自逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、脫氧核苷酸、和RNA的組分；以及C)液體媒介 物。
[0023] 本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式涉及用于合成cDNA的方法，包括:A)制備包含冷 休克蛋白質(zhì)、逆轉(zhuǎn)錄酶、至少一種引物、至少一種脫氧核苷、和RNA的混合物；以及B)孵育步 驟A)中制備的混合物。
[0024] 本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式包含用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的試劑盒，包含：A)冷休克 蛋白質(zhì)；B)至少一種選自逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、脫氧核苷酸、和RNA的組分；以及C)液體媒介物。 根據(jù)這個(gè)實(shí)施方式的試劑盒可進(jìn)一步包含液體媒介物或關(guān)于如何使用試劑盒的紙質(zhì)或電 子形式的說明書。這種試劑盒的組分可單獨(dú)地或分開地存在。這個(gè)實(shí)施方式的試劑盒可進(jìn) 一步包含用于進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)的試劑。
[0025] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及由包括以下步驟的方法合成的cDNA組合物：A)制備包含冷休 克蛋白質(zhì)、逆轉(zhuǎn)錄酶、至少一種引物、至少一種脫氧核苷、和RNA的溶液；以及B)孵育步驟 A)中制備的溶液。
[0026] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于鑒定內(nèi)切核糖核酸酶切割位點(diǎn)的組合物，使用這些組合物 用于鑒定內(nèi)切核糖核酸酶切割位點(diǎn)的方法以及用于這些方法的試劑盒。
[0027] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及用于鑒定內(nèi)切核糖核酸酶切割位點(diǎn)的組合物，A)冷休 克蛋白質(zhì)；以及B)至少一種選自RNA底物和內(nèi)切核糖核酸酶的組分。在根據(jù)本發(fā)明的這種 實(shí)施方式中，冷休克蛋白質(zhì)的實(shí)例為CspA或其同源物，CspA的一個(gè)實(shí)例是衍生自大腸桿菌 的CspA。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，RNA底物長于1024個(gè)堿基并含有大約相等數(shù)量的每種堿 基。這種RNA底物的一個(gè)實(shí)例為細(xì)菌噬菌體MS2RNA。這種實(shí)施方式的組合物可進(jìn)一步包含 液體媒介物。
[0028] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及用于確定內(nèi)切核糖核酸酶切割位點(diǎn)的方法，其包括 步驟:A)制備包含冷休克蛋白質(zhì)、RNA底物、和內(nèi)切核糖核酸酶的混合物；以及B)孵育步 驟A)中制備的混合物。這種方法可進(jìn)一步包括通過電泳分析混合物。
[0029] 本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式涉及用于確定內(nèi)切核糖核酸酶切割位點(diǎn)的試劑 盒，其包含冷休克蛋白質(zhì)和RNA底物。此實(shí)施方式的試劑盒可進(jìn)一步包含液體媒介物，如反 應(yīng)緩沖溶液。
[0030] 此實(shí)施方式可進(jìn)一步包含關(guān)于如何使用試劑盒的紙質(zhì)或電子形式的說明書。在這 種實(shí)施方式中，冷休克蛋白質(zhì)和RNA底物可單獨(dú)或組合存在。
[0031] 如本文使用的，冷休克蛋白質(zhì)為那些在暴露于生長溫度下移引起的冷休克時(shí)在生 物體，尤其是微生物體中表達(dá)的蛋白質(zhì)的集體名稱。當(dāng)大腸桿菌的孵育溫度從37°C降低到 15°C時(shí)，會(huì)高水平地瞬時(shí)表達(dá)叫做CspA的冷休克蛋白質(zhì)。已知大腸桿菌有八種不同的蛋 白質(zhì)，CspB-CspI，其與CspA具有高的氨基酸序列同一性。在這些蛋白質(zhì)中，CspB、CspG和 CspI為冷休克蛋白質(zhì)。進(jìn)一步地，通常已知這些冷休克蛋白質(zhì)的同源物存在于其他微生物 如枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis)(CspB)、熱溶芽抱桿菌（Bacilluscaldolyticus) (CspB)、海棲熱袍菌（Thermotogamaritima) (CspB，CspL)和胚芽乳桿菌（Lactobacillus plantarum) (CspL)。在本發(fā)明中，CspA的同源物指的是具有顯示與衍生自大腸桿菌的CspA 的氨基酸序列至少50%的序列同一性的氨基酸序列的冷休克蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，可使用 這些冷休克蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中使用的冷休克蛋白質(zhì)的實(shí)例優(yōu)選地為CspA，更優(yōu)選地是衍 生自革蘭氏-陰性細(xì)菌的CspA，甚至更優(yōu)選地是衍生自大腸桿菌的CspA?？赏ㄟ^重組DNA 技術(shù)或從微生物體中分離而制備本發(fā)明中使用的CspA。
[0032] 同源物指的是與目標(biāo)蛋白質(zhì)具有序列同源性的實(shí)體，優(yōu)選地顯示與另一種多肽的 氨基酸序列有至少50%的序列同一性，并且在結(jié)構(gòu)特征或生物學(xué)功能上具有相似性。
[0033] 如本文使用的，脫氧核苷酸指的是通過磷酯鍵鍵合于脫氧核糖的磷酸基團(tuán)，所述 脫氧核糖鍵合于有機(jī)堿基。天然DNA包括四種不同的核苷酸。這些核苷酸分別由可在天 然DNA中找到的腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶堿基構(gòu)成。腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸 腺嘧啶堿基分別縮寫為A、G、C和T。脫氧核苷酸包括游離的單磷酸、二磷酸和三磷酸（更 具體地，磷酸基團(tuán)的每種包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)磷酸部分）。因此，脫氧核苷酸包括脫氧核 苷酸三磷酸（例如，dATP、dCTP、dITP、dGTP和dTTP)及其衍生物。脫氧核苷酸衍生物包括 [aS]dATP、7-deaza-dGTP、7-deaza-dATP以及顯示出針對(duì)核酸分解的抗性的脫氧核苷酸衍 生物。脫氧核苷酸衍生物包括例如，以這樣的方式標(biāo)記的脫氧核苷