一種提高酶法制備β-環(huán)糊精得率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高酶法制備環(huán)糊精得率的方法，屬于環(huán)糊精生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)糊精是由D-吡喃葡萄糖通過a-1，4_糖苷鍵連接而成的環(huán)狀化合物，其中以6、 7和8個(gè)葡萄糖單元所構(gòu)成的a-、f3-和Y-環(huán)糊精最為常見。環(huán)糊精能與許多疏水性分 子形成包合物，從而改變它們的理化性質(zhì)，因此，在食品、醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中有著廣 泛的應(yīng)用。a、0和Y三種環(huán)糊精均為白色晶體粉末，其中環(huán)糊精的水溶解度最低， 因此它易于結(jié)晶和提純，因此目前工業(yè)上生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用的是0 _環(huán)糊精。
[0003] 環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)主要采用酶法工藝，即在環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶催化作用下 通過環(huán)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化淀粉所合成，一般采用兩種方式：非控制過程和控制過程。這兩種工藝的 主要區(qū)別是，非控制過程的酶反應(yīng)體系中不添加有機(jī)溶劑作為復(fù)合劑，而控制過程的反應(yīng) 體系中添加有機(jī)溶劑作為復(fù)合劑。有機(jī)溶劑的添加雖可降低產(chǎn)物抑制，增加環(huán)糊精得率，但 由于其具有毒性和危險(xiǎn)性，在一定程度上限制了環(huán)糊精的工業(yè)應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明在反應(yīng)體系中添加酵母，在酵母生長過程可以利用酶反應(yīng)所產(chǎn)生的葡萄 糖，并產(chǎn)生乙醇，反應(yīng)體系中葡萄糖含量的減少可以在一定程度上抑制環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn) 移酶的偶合反應(yīng)，乙醇的產(chǎn)生能促進(jìn)其環(huán)化反應(yīng)，從而提高0 -環(huán)糊精的得率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種提尚酶法制備0 _環(huán)糊精得率的方法，是在0 _環(huán)糊精的 制備過程中添加活性酵母和氮源，本發(fā)明工藝流程簡單，不額外添加任何有機(jī)溶劑作為復(fù) 合劑，所添加的活性酵母和氮源安全無污染。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案在于配制10?30%的淀粉乳或麥芽糊精溶液作為酶反應(yīng) 底物，經(jīng)適當(dāng)預(yù)處理后，調(diào)節(jié)pH值為4?7,加入環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，并添加活性酵母和 氮源，控制反應(yīng)溫度為30?37°C，充分反應(yīng)12?24h。
[0007] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述酶反應(yīng)底物主要為玉米淀粉、蠟質(zhì)玉米淀粉、木 薯淀粉、馬鈴薯淀粉、大米淀粉或小麥淀粉中的一種或它們的組合，或是上述淀粉來源的DE 值為2?30的麥芽糊精。
[0008] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以淀粉為底物時(shí)，所述預(yù)處理是用a-淀粉酶或CGT 酶在80?100°C下液化30?60min，120°C過熱蒸汽使酶失活。a-淀粉酶用量1?12U/g 干淀粉，CGT酶用量為1?10U/g干淀粉。
[0009] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所用的底物為麥芽糊精時(shí)，所述預(yù)處理是在80? 100°C下加熱 15 ?30min。
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述活性酵母為釀酒酵母，接種量為0.5-3% (v/v) 〇
[0011] 所述釀酒酵母在加入到反應(yīng)體系前經(jīng)過活化。所述活化所使用的活化培養(yǎng)基配方 可以是：葡萄糖 20g/L、蛋白胨 5g/L、酵母粉 3g/L、KH2P04lg/L、MgS04 *7H20 0? 5g/L，將lg待 活化的干酵母加入到19ml上述已滅菌的培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min的搖床內(nèi)活化30? 45min〇
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，加入反應(yīng)體系中的氮源為尿素、蛋白胨、玉米漿、酵 母粉、硝酸鹽、銨鹽中的一種或它們的組合。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，氮源添加量為5-10g/L。
[0014] 本發(fā)明中所用的CGT酶為主產(chǎn)環(huán)糊精的0-CGT酶，用量為1?10U/g干淀粉。
[0015] 本發(fā)明中所用反應(yīng)體系的pH值控制在4?7,由于pH對(duì)CGT酶催化活力的影響較 大，所以反應(yīng)pH值與酶最適pH值接近，同時(shí)要考慮酵母的生長。
[0016] 本發(fā)明通過添加釀酒酵母明顯提高環(huán)糊精的得率，與現(xiàn)有技術(shù)相比，不額外添加 有機(jī)溶劑，反應(yīng)過程無毒害無污染，無有毒試劑殘留，且操作簡單，生產(chǎn)成本低。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 環(huán)糊精得率的測定及計(jì)算方法：將反應(yīng)液煮沸滅酶lOmin，加入10yL糖化酶 (100U/mL)糖化30min，煮沸滅酶。將反應(yīng)液10000r/min離心并取上清液，經(jīng)0. 45ym超濾 膜過濾后經(jīng)高效液相色譜法（HPLC)測定環(huán)糊精的濃度。HPLC測定條件為：Waters600高 效液相色譜儀（配示差折光檢測器），色譜柱LichrosorbNH2 (4. 6mmX150mm)，流動(dòng)相采用 68 %的乙腈水溶液，柱溫為30 °C，流速為lmL/min。環(huán)糊精得率為實(shí)際環(huán)糊精濃度與理論最 大環(huán)糊精濃度的比值。
[0018] 實(shí)施例1未添加酵母的生產(chǎn)方法和添加酵母及尿素后的0 -環(huán)糊精得率的比較。
[0019] CGT酶環(huán)化活力的測定方法：取適當(dāng)稀釋的酶液0.lmL，加入裝有0. 9mL預(yù)先用 10mM磷酸緩沖液（pH6. 5)配制的1% (w/v)麥芽糊精（DE= 5)溶液的試管中，在50°C下 反應(yīng) 10min后，加入 3. 5mL30mMNaOH和 0? 5mL由 5mMNa2C03溶液配制的 0? 02% (w/v)酚 酞溶液反應(yīng)，在室溫下保溫15min，在550nm下測定吸光度。以失活的酶作為空白。一個(gè)酶 活單位定義為在上述條件下每分鐘生成1ymol|3 -環(huán)糊精所需的酶量。
[0020] 酵母活化方法：將lg待活化的干酵母加入到19ml已滅菌的培養(yǎng)基（葡萄糖，20g/ L;蛋白胨，5g/L;酵母粉，3g/L;KH2P04,lg/L;MgS04.71120,0. 5g/L)中，在 37°C、200r/min的 搖床內(nèi)活化30min。
[0021] 未添加酵母的生產(chǎn)方法，其具體過程為：調(diào)制15%的麥芽糊精（DE5)溶液， 在沸水浴中加熱15min，冷卻至室溫后，按照lU/ml的加酶量添加來源于環(huán)狀芽孢桿菌 (Bacilluscirculans)STB01 的 0-CGT酶，調(diào)節(jié)pH至 6.0,在溫度為 37°C下充分反應(yīng) 24h〇
[0022] 添加酵母的生產(chǎn)方法，其具體過程為：調(diào)制15%的麥芽糊精（DE5)溶液，在沸水 浴中加熱15min，冷卻至室溫后，按照lU/ml的加酶量添加上述CGT酶，再添加10y1/ml酵 母和5mg/ml尿素。調(diào)節(jié)pH至6. 0，在溫度為37 °C下充分反應(yīng)24h。
[0023] 結(jié)果見表1，相比于不添加酵母的生產(chǎn)工藝，添加酵母能明顯增加環(huán)糊精得 率，提高比例達(dá)到88%。
[0024] 表1:兩種生產(chǎn)方法0_環(huán)糊精得率的比較
[0025]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提高酶法制備e -環(huán)糊精得率的方法，其特征在于，配制10?30%的淀粉乳或 麥芽糊精溶液作為酶反應(yīng)底物，預(yù)處理后，調(diào)節(jié)pH值為4?7,加入環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶， 并添加活性酵母和氮源，控制反應(yīng)溫度為30?37°C，反應(yīng)12?24h。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶反應(yīng)底物淀粉為玉米淀粉、蠟質(zhì)玉 米淀粉、木薯淀粉、馬鈴薯淀粉、大米淀粉或小麥淀粉中的一種或它們的組合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述麥芽糊精是來源于玉米淀粉、蠟質(zhì)玉 米淀粉、木薯淀粉、馬鈴薯淀粉、大米淀粉或小麥淀粉中的一種或它們的組合的DE值為2? 30的麥芽糊精。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述預(yù)處理為對(duì)底物進(jìn)行液化處理。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于，所用的底物為淀粉時(shí)，所述預(yù)處理是 用a -淀粉酶或CGT酶在80?100°C下液化處理30?60min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于，所用的底物為麥芽糊精時(shí)，所述預(yù)處 理是在80?100°C下加熱15?30min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的添加量為1? l〇U/g干淀粉或麥芽糊精。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述活性酵母是釀酒酵母，接種量為 0? 5-3%〇
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述氮源為尿素、蛋白胨、玉米漿、酵母 粉、硝酸鹽、銨鹽中的一種或它們的組合。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的方法，其特征在于，所述氮源的添加量為5-10g/L。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高酶法制備β-環(huán)糊精得率的方法，屬于環(huán)糊精生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明配制10～30％的淀粉乳或麥芽糊精溶液作為酶反應(yīng)底物，經(jīng)適當(dāng)預(yù)處理后，調(diào)節(jié)pH值為4～7，加入環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，并添加活性酵母和氮源，控制反應(yīng)溫度為30～37℃，充分反應(yīng)12～24h。相比于不加酵母的生產(chǎn)方法，本發(fā)明通過添加酵母大幅度提高了β-環(huán)糊精的得率。本發(fā)明不額外添加有機(jī)溶劑，反應(yīng)過程無毒害無污染，無有毒試劑殘留，且操作簡單，生產(chǎn)成本低。
【IPC分類】C12P19-18, C12P19-04, C12R1-865
【公開號(hào)】CN104593453
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510062265
【發(fā)明人】李兆豐, 顧正彪, 李才明, 程力, 洪雁
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2015年2月5日