專利名稱：一種酶法制備阿莫西林中殘留蛋白質的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及制藥領域，具體涉及ー種藥品質量的檢測方法，更具體涉及ー種測量酶法制備阿莫西林中殘留蛋白質的方法。
背景技術：
目前阿莫西林的合成有兩種方法，即化學半合成法(簡稱化學法)和酶半合成法(簡稱“酶法”)，化學法是在30多年前開發(fā)的，目前仍然在阿莫西林エ業(yè)生成中廣泛使用； 酶法是近年來研發(fā)的新型エ藝，其采用青霉素G?；D移酶與DHPG活性?；苌锺盥?lián)起來。與化學法相比，酶法エ藝步驟少，減少有機溶劑和化學制品的使用。但酶法合成阿莫西林的生產(chǎn)エ藝中，所使用的青霉素G?；D移酶(Novelpenicillin G Acylase NPGA)對人體而言,是ー種外源性蛋白質,如果在最終產(chǎn)品中存在，將對患者有可能導致過敏等不良反應。因此，為了更好地檢測阿莫西林藥品的質量，有必要提供一種測量方法，以檢測酶法制備的阿莫西林最終產(chǎn)品中是否有酶蛋白的殘留，從而保證用藥的安全性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供ー種酶法制備阿莫西林產(chǎn)品中殘留酶蛋白的檢測方法，本發(fā)明方法包括對照品溶液制備取青霉素G?；D移酶蛋白標準品，用pH值7. O的O. 05mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋得對照品溶液；供試品溶液的制備取供試品，精密稱定并置于量瓶中，加入pH值7.0的O. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，加入O. lmol/L氫氧化鈉溶液，使供試品完全溶解至溶液澄清，再用PH值7. O的O. 05mol/L磷酸鹽緩沖溶液稀釋得供試品溶液；分別精密量取上述溶液各100 μ L注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，以外標法測量殘留蛋白的含量；其中，所述高效液相色譜的條件為色譜柱TSKgel Octadecyl 4 PW(7)、4· 6 X 150mm ;色譜柱溫度30°C;流動相水-こ腈-三氟醋酸體系，線性梯度洗脫。作為實施方案之一，本發(fā)明標準品青霉素G?；D移酶溶液的濃度沒有特別的限定，可以為本領域常規(guī)的濃度，以便于檢測為原則，如配成O. 08mg/ml的濃度，或其他適宜的濃度范圍。青霉素G?；D移霉標準品可以由本領域技術人員結合現(xiàn)有技術進行制備獲得；也可以通過商業(yè)方法，如購買獲得，其來源不受任何的限制。作為實施方案之一，本發(fā)明供試品溶液的濃度同樣沒有特別的限定，可以為本領域常規(guī)濃度的溶液，以便于檢測為原則，如配成40mg/ml的濃度，或其他適宜的濃度范圍。
本發(fā)明中所述的色譜柱TSK gel Octadecyl 4 Pff (7)為硅膠基質反相色譜柱，其僅為本發(fā)明優(yōu)選的實施方案之一，本發(fā)明包括但不限于該色譜柱；本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明的記載并結合本領域常識，可以采用能夠達到同樣效果的其他類型的色譜柱來替換本發(fā)明所述的色譜柱。作為實施方案之一，本發(fā)明所述檢測方法中的流動相包括流動相A :水-こ臆-三氟醋酸的比為950 50 O. 5 ；作為實施方案之一，所述方法中的流動相進ー步還包括流動相B :水-こ臆-三氟醋酸的比為100 900 0.5。作為優(yōu)選實施方案之一，本發(fā)明所述檢測方法還包括流動相A與流動相B的梯度洗脫的時間表為
時間(min)%A%B
O6535
205050
305050
356535
406535 ο作為實施方案之一，本發(fā)明所述檢測方法中，所述方法中高效液相色譜的條件還包括進樣器溫度20°C，進樣量為lOOul。作為實施方案之一，本發(fā)明所述檢測方法中，所述方法中高效液相色譜的條件還包括雙波長紫外檢測器，檢測波長為280nm，200nm。作為實施方案之一，本發(fā)明所述檢測方法中，所述方法中高效液相色譜的條件還包括多波長熒光檢測器，激發(fā)波長為275nm。作為實施方案之一，本發(fā)明所述檢測方法中，高效液相色譜的條件還包括多波長突光檢測器，發(fā)射波長為345nm。作為實施方案之一，本發(fā)明所述檢測方法最佳為包括I.青霉素G?；D移酶蛋白標準品的含量確定青霉素G?；D移酶有兩個亞單元， 27Kda和65Kda，在此色譜條件下，得到了兩個主鋒，命名為A峰和B峰；根據(jù)青霉素G?；D移酶標準品的總蛋白含量9. Omg/g,以峰面積歸ー化法計算出含量若以A+B峰為O. 84% ;2不同供試品的測量對照品溶液制備取酶蛋白標準品約80mg，用pH值7. O的O. 05mol/L磷酸鹽緩沖液溶液并稀釋至100ml，取10. 0ml，用pH7. O的O. 05mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至IOOml,即 得;供試品溶液的制備分別取供試品I. Og，精密稱定，置25ml量瓶中，用pH值7. O的O. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，逐滴加入O. lmol/L氫氧化鈉溶液，邊滴加邊振搖，滴加至正好使供試品完全溶解至溶液澄清，用pH值7. O的O. 05mol/L磷酸鹽緩沖溶液稀釋至25ml，即得;精密量取上述溶液各100 μ L注入液相色譜儀，記錄峰面積，以外標法測量殘留蛋白的含量；其中高效液相的條件為Waters 1525 型 HPLC 泵數(shù)據(jù)處理軟件 Waters Empower ；Waters 717 Plus型自動進樣器，進樣器溫度20°C ，進樣量lOOul，檢測器Waters 2487 Dual λ Absorbance dectector雙波長紫外檢測器,檢測波長 280nm, 200nm ;Waters 2475 Multi λ Flurescence Dectector 多波長突光檢測器,激發(fā)波長275nm,發(fā)射波長345nm ；色譜柱TSKgel Octadecyl 4 PW (7) 4. 6 X 150mm Lot No. P0074 ;色譜柱溫度30 °C ；流動相A 7jC -こ腈-三氟醋酸(950 50 0. 5);流動相B冰_こ腈_三氟醋酸(100 900 0.5)線性梯度洗脫；其中流動相A與流動相B梯度洗脫的時間表為
時間(min)%A%B
O6535
205050
305050
356535
406535 ο本發(fā)明通過方法學驗證證明了本發(fā)明檢測方法的安全性、可靠性、可以有效地檢測出采用酶法制備的阿莫西林產(chǎn)品是否含有殘留的酶蛋白及其殘留量，通過本發(fā)明方法有效地檢測出阿莫西利產(chǎn)品的質量，提高了藥品的用藥安全。


圖I :青霉素G酰基轉移酶的HPLC譜圖；圖2 :蛋白標準品(青霉素G酸基轉移酶)溶液；圖3 :空白溶液的典型HPLC譜圖；圖4 :供試品溶液的典型HPLC色譜圖(批號CL021002001)；圖5 :供試品加樣回收率的HPLC色譜圖；圖6 :蛋白標準品溶液的線性關系；圖7 :標準品溶液的穩(wěn)定性；圖8 :供試品溶液(加樣回收樣品)的穩(wěn)定性。
具體實施例方式本發(fā)明通過以下實施例和實驗例進ー步闡述本發(fā)明，但本發(fā)明并不受限于此。
以下是實施例和實驗例中所采用的材料、試劑、儀器與HPLC色譜條件為I.儀器與HPLC色譜條件Lambda 35UV/VIS紫外分光光度計Waters I525 型 HPLC 泵數(shù)據(jù)處理軟件 Waters Empower ；Waters 717 Plus型自動進樣器，進樣器溫度20°C，進樣量lOOul，檢測器Waters 2487 Dual λ Absorbance dectector雙波長紫外檢測器,檢測波長 280nm, 200nm ;Waters 2475 Multi λ Flurescence Dectector 多波長突光檢測器,激發(fā)波長275nm,發(fā)射波長345nm。色譜柱TSKgel Octadecyl 4 PW (7) 4. 6 X 150mm Lot No. P0074 ;色譜柱溫度30 °C ；流動相A 7jC -こ腈-三氟醋酸(950 50 0. 5);流動相B冰_こ腈_三氟醋酸(100 900 0. 5)線性梯度洗脫(表I)表I阿莫西林中殘留蛋白測定的梯度時間表
權利要求
1.ー種酶法制備阿莫西林產(chǎn)品中殘留酶蛋白的檢測方法，其特征在于，所述方法包括 對照品溶液制備取青霉素G?；D移酶蛋白標準品，用pH值7. O的O. 05mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋得標準品溶液； 供試品溶液的制備取供試品，精密稱定并置于量瓶中，加入PH值7. O的O. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，加入O. lmol/L氫氧化鈉溶液，使供試品完全溶解至溶液澄清，再用pH值7. O的O. 05mol/L磷酸鹽緩沖溶液稀釋得供試品溶液； 分別精密量取上述溶液各100 μ L注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，以外標法測量殘留蛋白的含量； 其中，所述高效液相色譜的條件為色譜柱TSK gel Octadecyl 4 Pff (7) >4. 6 X 1 50mm ； 色譜柱溫度30°C ; 流動相水-こ腈-三氟醋酸體系，線性梯度洗脫。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法中的流動相包括流動相A:水-こ臆-三氟醋酸的比為950 50 0.5。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法中的流動相還包括流動相B:水-こ臆-三氟醋酸的比100 900 0.5。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法還包括流動相A與流動相B的梯度洗脫的時間表為時間(min)%A%B O6535 205050 305050 356535 406535ο
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法中高效液相色譜的條件還包括進樣器溫度為20°C，進樣量為IOOul。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法中高效液相色譜的條件還包括雙波長紫外檢測器，檢測波長280nm，200nm。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法中高效液相色譜的條件還包括多波長熒光檢測器，激發(fā)波長為275nm。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中高效液相色譜的條件還包括多波長突光檢測器，發(fā)射波長為345nm。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法中，所述青霉素G?；D移酶標準品溶液的濃度為O. 08mg/ml ;和/或所述供試品溶液的濃度為40mg/ml。
10.根據(jù)權利要求1-9任一所述方法，其特征在于，所述方法還包括 青霉素G?；D移酶蛋白標準品的含量確定青霉素G?；D移酶有兩個亞單元， 27Kda和65Kda，在此色譜條件下，得到了兩個主鋒，命名為A峰和B峰； 根據(jù)青霉素G?；D移酶標準品的總蛋白含量9. Omg/g,以峰面積歸ー化法計算出含量若以A+B峰為O. 84% ; 供試品的測量 對照品溶液制備取酶蛋白標準品約80mg，用pH值7. O的O. 05mol/L磷酸鹽緩沖液溶液并稀釋至100ml，取10. 0ml，用ρΗ7· O的O. 05mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至IOOml,即得；供試品溶液的制備分別取供試品I. Og，精密稱定，置25ml量瓶中，用pH值7. O的O. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，逐滴加入O. lmol/L氫氧化鈉溶液，邊滴加邊振搖，滴加至正好使供試品完全溶解至溶液澄清，用PH值7. O的O. 05mol/L磷酸鹽緩沖溶液稀釋至25ml，即得; 精密量取上述溶液各100 μ L注入液相色譜儀，記錄峰面積，以外標法測量殘留蛋白的含量; 其中高效液相的條件為 Waters 1525 型 HPLC 泵數(shù)據(jù)處理軟件 Waters Empower ； Waters 717 Plus型自動進樣器，進樣器溫度20°C，進樣量為lOOul， 檢測器Waters 2487 Dual λ Absorbance dectector雙波長紫外檢測器，檢測波長280nm, 200nm ；ffaters 2475 Multi λ Flurescence Dectector 多波長突光檢測器,激發(fā)波長275nm,發(fā)射波長345nm ；色譜柱TSK gel Octadecyl 4 PW (7) 4. 6 X 150mm Lot No. P0074 ;色譜柱溫度30°C ；流動相A:水-こ臆-三氟醋酸(950 50 0.5);流動相B:水-こ臆-三氟醋酸(100 900 0.5)線性梯度洗脫，其中，所述方法還包括流動相A與流動相B的梯度洗脫的時間表為時間(min)%A%B O6535 205050 305050 356535 406535ο
全文摘要
本發(fā)明涉及制藥領域，提供了酶法制備阿莫西林中殘留蛋白質的檢測方法，包括取青霉素G酰基轉移酶標準品，用pH值7.0的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋得標準品溶液；取供試品，精密稱定并置于量瓶中，加入pH值7.0的0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液，加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液至供試品溶解至溶液澄清，再用pH值7.0的0.05mol/L磷酸鹽緩沖溶液稀釋得供試品溶液；分別精密量取上述溶液各100μL注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，以外標法測量殘留蛋白的含量。本發(fā)明方法可以有效地檢測阿莫西林產(chǎn)品中殘留蛋白的含量，從而可以有效地檢測出產(chǎn)品的質量，提高了藥品的用藥安全。
文檔編號G01N30/88GK102645503SQ20121013532
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月4日 優(yōu)先權日2012年5月4日
發(fā)明者梁國艷 申請人:聯(lián)邦制藥(內(nèi)蒙古)有限公司