一種酶法合成制備海藻糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種酶法合成制備海藻糖的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]海藻糖工業(yè)化生產(chǎn)過程中多為酶法合成，酶法合成過程中最為直接的工藝是利用通透性海藻糖合酶細胞或是海藻糖合酶與底物麥芽糖進行反應(yīng)，然后進行結(jié)晶分離制備；現(xiàn)有工藝受酶轉(zhuǎn)化平衡關(guān)系的限制，反應(yīng)體系中未轉(zhuǎn)化的底物麥芽糖，一般在20%?30%，由于麥芽糖和海藻糖為同分異構(gòu)體，化學(xué)性質(zhì)相似，給分離帶來困難，導(dǎo)致海藻糖的生成成本偏高，影響其生成和應(yīng)用。
[0003]專利CN103146779B公開了一種利用固定化重組大腸桿菌細胞合成海藻糖的方法，該方法轉(zhuǎn)化率可達到50% -60%，該酶法合成即受限于轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中副產(chǎn)物含量較高，使得終產(chǎn)物海藻糖轉(zhuǎn)化率不高。專利CN101230407A公開了一種提高海藻糖提取收率的方法，該專利提到酶法合成海藻糖糖的終產(chǎn)物中，副產(chǎn)物麥芽糖醇、山梨醇和麥芽三糖醇，以及底物麥芽糖，大大增加了提取成本，不利于工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖。
[0004]目前海藻糖合酶制備工藝相對成熟，無論是通透性含酶細胞還是經(jīng)純化制備酶液均可以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，但是受酶促反應(yīng)平衡的制約，終產(chǎn)物中底物及副產(chǎn)物的存在給海藻糖的提純增加了難度，關(guān)于如何提高海藻糖酶促反應(yīng)效率的技術(shù)發(fā)明還沒有提及。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有的規(guī)?；Ｔ逄巧a(chǎn)工藝不足，海藻糖合成過程底物麥芽糖利用率低，提取純化存在難度，本發(fā)明所要解決技術(shù)問題是提供一種酶合反應(yīng)工藝，利用流加方式控制酶液和底物的比例，使其充分混合，最大程度合成海藻糖，減少副產(chǎn)物的生成，解決生產(chǎn)過程中的問題，提高底物利用率，并進一步降低海藻糖的純化難度，減少生產(chǎn)成本。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0007]一種酶法合成制備海藻糖的方法，將海藻糖合酶酶液和麥芽糖分別通過流加方式在反應(yīng)釜中進行充分混合，控制溫度和流加速度，反應(yīng)15?20h后終止酶反應(yīng)，將產(chǎn)物提純得到海藻糖。其特征在于:利用流加酶和底物的方式合成海藻糖。
[0008]本發(fā)明所述的方法，實施過程的步驟為
[0009](I)海藻糖合酶酶液，酶活為1500?2000U/ml ；
[0010]酶活檢測:將ImL酶液加入到lmL10%麥芽糖磷酸溶液中，混勻后，將該混合物溶液于25°C保溫60min，然后于100°C加熱1min中止酶反應(yīng)；反應(yīng)混合物冷卻后，5000r/min離心lOmin，取上清液，用高效液相色譜法測定生成的海藻糖含量(色譜柱:Hypersil NH2,4.6mmX 250mm，填料粒徑5um ;檢測器:示差折光檢測器；流動相:乙腈/水=75/25 (V/V)；柱溫:室溫；進樣量:20uL ;流速:1.0mL/min)。
[0011](2)用磷酸緩沖液配制質(zhì)量濃度10%的麥芽糖溶液，調(diào)節(jié)pH7.8，制得麥芽糖底物溶液；
[0012](3)向30L反應(yīng)釜中加入2L酶液，8L麥芽糖溶液，轉(zhuǎn)速150rpm，溫度25°C，然后通過蠕動泵分別向反應(yīng)釜中流加海藻糖合酶酶液和麥芽糖底物溶液，控制兩者比例1: 3(初始控制酶液流加速度為6ml/min，麥芽糖流加速度為20ml/min)，轉(zhuǎn)速150rpm，溫度25°C，反應(yīng)4h后，取樣檢測反應(yīng)液中相關(guān)成分含量，其中海藻糖?60 %，麥芽糖為?30 %，此時改變酶液流加速度為2ml/min，繼續(xù)流加至12h，取樣檢測，海藻糖70%?75%，停止流加；
[0013](4)反應(yīng)20h，取樣檢測，海藻糖> 80%，麥芽糖< 20%，葡萄糖< 5% ;此時終止反應(yīng)，所得反應(yīng)液約25L，分離純化海藻糖轉(zhuǎn)化率達到70%以上.
[0014]本發(fā)明所述的方法中，海藻糖合酶酶液可以是經(jīng)純化得到的海藻糖合酶溶液，也可以是含海藻糖合酶的通透性細胞。
[0015]本發(fā)明所述的方法中，流加海藻糖合酶酶液和麥芽糖底物溶液，控制兩者比例I: 2.5 ?4。
[0016]本發(fā)明的有益效果在于:
[0017]1.本發(fā)明通過采用流加酶液和底物的工藝，通過控制酶和底物的流加速度，使酶液和底物得到充分接觸，進而使酶合反應(yīng)始終向著終產(chǎn)物海藻糖的方向進行，從而進一步提高了轉(zhuǎn)化率，使轉(zhuǎn)化率可達到70 %以上。
[0018]2.由于本發(fā)明制得的酶反應(yīng)體系中，終產(chǎn)物海藻糖含量提高，底物麥芽糖得到充分利用，同時副產(chǎn)物麥芽糖醇、麥芽三糖醇等基本沒有，因此可以減少了純化海藻糖的難度，方法簡單、大大降低了分離成本，對規(guī)模化生產(chǎn)具有可觀的經(jīng)濟效益。
[0019]3.本發(fā)明的海藻糖合成工藝中，酶液的流加速度在反應(yīng)后期減半，實際上是對反應(yīng)體系中酶液的充分利用，達到反復(fù)利用的效果。
[0020]4.本發(fā)明的海藻糖合成工藝中，酶液還可以利用通透性海藻糖合酶細胞進行反應(yīng)，因此應(yīng)用廣泛，于實際生產(chǎn)應(yīng)用性強。
【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明酶法合成海藻糖的工藝進行詳細說明:
[0022]檢測方法:
[0023]海藻糖含量檢測方法按GB/T23529-2009，海藻糖國標中的高效液相色譜法檢測；
[0024]轉(zhuǎn)化率為終產(chǎn)物海藻糖的終產(chǎn)量與底物麥芽糖含量的比值，轉(zhuǎn)化率的水平高低直接翻譯產(chǎn)生海藻糖的效果。
[0025]酶活定義:在一定反應(yīng)條件下，每分鐘形成Iumol海藻糖所需的酶量為I個酶活力單位⑶。
[0026]酶活檢測:將ImL酶液加入到ImLlO %麥芽糖磷酸溶液中，混勻后，將該混合物溶液25°C保溫60min，然后于100°C加熱1min中止酶反應(yīng)；反應(yīng)混合物冷卻后，5000r/min離心lOmin，取上清液，用高效液相色譜法測定生成的海藻糖含量(色譜柱:Hypersil NH2,
4.6mmX 250mm，填料粒徑5um ;檢測器:示差折光檢測器；流動相:乙腈/水=75/25 (V/V)；柱溫:室溫；進樣量:20uL ;流速:1.0mL/min)。
[0027]實施例1
[0028]本實例說明了利用流加海藻糖合酶和麥芽糖的方式進行酶促反應(yīng)的步驟和效果:
[0029](I)將酶活為1600U/ml的海藻糖合酶酶液轉(zhuǎn)入已滅菌的補料瓶中。
[0030](2)使用45mmol/L磷酸鹽緩沖液配制質(zhì)量濃度10%的麥芽糖溶液，調(diào)節(jié)pH7.8，轉(zhuǎn)入已滅菌的補料瓶中。
[0031](3)向30L反應(yīng)釜中加入2L酶液，8L麥芽糖溶液，轉(zhuǎn)速150rpm，溫度25°C，然后通過蠕動泵分別向反應(yīng)釜中流加海藻糖合酶酶液和麥芽糖底物溶液，控制兩者比例1: 3(初始控制酶液流加速度為6ml/min，麥芽糖流加速度為20ml/min)。
[0032](4)反應(yīng)4h時，取樣檢測反應(yīng)液中相關(guān)成分含量，其中海藻糖61%，麥芽糖為28%，此時改變酶液流加速度為2ml/min ;繼續(xù)流加至12