易變鏈霉菌海藻糖合成酶基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程和現(xiàn)代酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種來(lái)自于易變鏈霉菌的 海藻糖合成酶基因，該基因表達(dá)的海藻糖合成酶可W顯著提高宿主的耐鹽能力。
【背景技術(shù)】
[0002] 海藻糖在基因工程方面的研究已經(jīng)獲得了一些成就：一是利用海藻糖基因構(gòu)建特 種作物提高了作物的抗逆性能力，二是利用工程微生物的構(gòu)建和酶工程的合理運(yùn)用，改進(jìn) 原有的海藻糖的生產(chǎn)方式，提升效率，降低成本。目前很多研究者已經(jīng)成功將海藻糖基因?qū)?入經(jīng)濟(jì)作物，使植物作為海藻糖的生物反應(yīng)器，并大量積累海藻糖。但是現(xiàn)有對(duì)于產(chǎn)海藻糖 合酶的基因工程菌的研究很少。近年來(lái)通過(guò)基因工程技術(shù)克隆和表達(dá)海藻糖合成相關(guān)的酶 已成為許多科學(xué)家研究的方向，而通過(guò)基因工程菌生產(chǎn)海藻糖合成相關(guān)的酶，并W此作為 酶法生產(chǎn)海藻糖的催化物，是生產(chǎn)海藻糖的相對(duì)高效的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題有Ξ:-是提供一種攜帶海藻糖合成酶基因的新的放 線菌菌株，具體而言是易變鏈霉菌Streptomycesmut油ilisTRM45540;二是提供該菌株中 海藻糖合成酶基因的核巧酸序列及氨基酸序列；Ξ是異源表達(dá)海藻糖合成酶基因，包括純 化該蛋白，并檢測(cè)海藻糖合成酶的酶學(xué)特征；四是通過(guò)構(gòu)建基因工程菌，驗(yàn)證海藻糖合成酶 基因能夠顯著提高宿主菌的耐鹽能力及工業(yè)應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案：1.易變鏈霉菌（Str巧tomycesmut油ilis)TRM45540,該 菌株的保藏編號(hào)為CCTCCN0:M2015657。2.易變鏈霉菌TRM45540海藻糖合成酶基因，其 核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示。3.如2所述的易變鏈霉菌TRM45540海藻糖合成酶基 因所編碼的海藻糖合成酶，其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示。4.如1所述的易變鏈霉菌 TRM45540在工業(yè)中的應(yīng)用。 陽(yáng)0化]有益效果：1、克隆獲得易變鏈霉菌中的海藻糖合成酶基因 (1)生長(zhǎng)培養(yǎng)基 ISP4 培養(yǎng)基：可溶性淀粉 10.Og·L1，（NH4)2S04 2.Og·L1，Μ拆〇41.Og·L1，K2HPO4 1.0g.Li，CaC〇3 2.Og.Li，化Cl5g.Li，F(xiàn)eS〇4.7H2〇 0. 001g.Li，MnCl2.7H2〇 0.OOlg.Li。 28°C培養(yǎng) 7d。
[0006] 似活化 YEME培養(yǎng)基：玉米粉16.Og·L1，蛋白腺5.Og·L1，葡萄糖20g·L1，化Cl20g·L1，CaC〇3 1.Og.Li，F(xiàn)eS〇4.7&0 0.OOlg.L1。最佳發(fā)酵條件為：轉(zhuǎn)速 180巧m，初始抑 7. 2-7. 4， 接種量8 %，裝液量80血/250血，發(fā)酵溫度28 °C。
[0007] 做操作流程 將放線菌（易變鏈霉菌Streptomycesmut油ilisTRM45540)菌株接種到生長(zhǎng)培養(yǎng)基 中28°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d待生長(zhǎng)出豐富的新鮮菌絲體。收集菌絲于20%甘油混勻制成菌懸 液，放-20°C保存；按照1 %的接種量將菌懸液接種到裝有YEME(終濃度0. 5%甘油）培養(yǎng) 基的Ξ角瓶中，28°C搖床培養(yǎng)36-4化得到新鮮菌液，抽提菌株的總DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得海 藻糖合成酶基因的片段，通過(guò)TA克隆得到攜帶有該基因的克隆子pl8T-TreA，并送克隆子 測(cè)序明確該基因的序列。
[0008] 2、異源表達(dá)海藻糖合成酶 (1) 將克隆子pl8T-TreApl8T-TreA的載體替換成祀T28a 抽提克隆子pl8T-TreA和祀T28a的質(zhì)粒DNA，選用BamHI和Hindlll兩種酶對(duì)ρ18Τ-化eA和祀T28a的質(zhì)粒DNA在37°C水浴酶切地。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，回收相應(yīng)的 片段。pl8T-TreA回收1143bp的片段，pET28a回收5. 3化的片段。將回收的兩個(gè)片段在 T4DNA連接酶的作用下連接，轉(zhuǎn)化化21，獲得祀T28a-TreA克隆子 (2) 表達(dá)純化TreA蛋白 接種祀T28a-TreA克隆子于LB培養(yǎng)基中活化，然后1/100轉(zhuǎn)接于新的LB培養(yǎng)基中培 養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)地，收集菌體，使用His標(biāo)簽-Ni柱純化 TreA蛋白，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)TreA蛋白的表達(dá)。
[0009] 做酶活測(cè)定 利用高效液相色譜儀（HPLC)來(lái)分析海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化麥芽糖后的產(chǎn)物分析，分析條 件為色譜柱為：AlltimaAmino100A加柱（4. 6mmX250mm);檢測(cè)器：Alltech2000ES型蒸 發(fā)光散射檢測(cè)器；流動(dòng)相：70%乙臘/30%肥0 ;流速：lmL/min;柱溫：35°C。分析酶活的最 適抑值（4、5、6、7、8)、最適溫度（4°(：、10°(：、28°(：、37°(：、45°(：、60°(：)、金屬離子狂112\〔曰2\ Mg2\Mn2+和Co2+)對(duì)酶活的影響。
[0010] 3、通過(guò)構(gòu)建基因工程菌，海藻糖合成酶基因能夠顯著提高宿主菌的耐鹽能力W PUC19/D冊(cè)α和祀T28a/BL21作為陰性對(duì)照，WTRM45540野生菌株作為陽(yáng)性對(duì)照，將重組菌 株和對(duì)照菌株分別接種于0 %、1 %、3 %、5 %的平板上，檢測(cè)菌株的耐鹽性。 陽(yáng)0川 菌種保藏說(shuō)明：菌種名稱：易變鏈霉菌TRM45540 ;拉下學(xué)名：Streptomyces mut油ilis;保藏編號(hào)：CCTCCNO:M2015657 ;保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、；地址： 中國(guó)武漢武漢大學(xué)，郵編：430072,電話：(027)68754052,傳真：(027)68754833,E-mail: cctccOwhu.edu.cn;保藏日期：2015 年 11 月 2 日。
【附圖說(shuō)明】 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0013] 圖1易變鏈霉菌TRM45540海藻糖合成酶基因的克??； 圖2易變鏈霉菌TRM45540的海藻糖合成酶基因的異源表達(dá)； 圖3 :易變鏈霉菌TRM45540的海藻糖合成酶最佳底物濃度； 圖4易變鏈霉菌TRM45540的海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化麥芽糖的產(chǎn)物分析； 圖5抑對(duì)酶活影響的曲線圖； 圖6溫度對(duì)酶活影響的曲線圖； 圖7金屬離子對(duì)酶活影響的曲線圖； 圖8攜帶海藻糖合酶基因的重組菌的耐鹽能力分析。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】的詳細(xì)描述來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是對(duì)本發(fā)明的限 審IJ，僅僅作示例說(shuō)明。
[0015] 實(shí)施例1、易變鏈霉菌TRM45540海藻糖合成酶基因的克隆 1、 易變鏈霉菌TRM45540的來(lái)源與分離培養(yǎng) 從新疆樓蘭古城（海拔1400m，東徑89。22' 22"，北締40。29' 55" )0-30畑1±壤 樣品中，采用涂布平板法，用含5%、10%、15%、20 %和25%氯化鋼的8種培養(yǎng)基，28 °C恒溫 培養(yǎng)，共分離出7個(gè)屬的放線菌35株，通過(guò)平板對(duì)時(shí)法初篩和管碟法復(fù)篩，最終分離和篩選 出了抑菌效果好且具有一定耐鹽能力的生防菌TRM45540,通過(guò)分子鑒定及形態(tài)學(xué)觀察命名 為易變鏈霉菌（Str巧tomycesmut油ilis)。 分離培養(yǎng)基為無(wú)機(jī)鹽淀粉瓊脂（ISP4)培養(yǎng)基：淀粉lOg·L1，（NH4)2S04 4g·L1，Μ拆〇42g·L1，Κ2ΗΡΟ42g·L1，CaC〇3Ig·L1，NaCl40g·L1，瓊月旨 18g·L1，pH7. 2-7. 4。 2、 提取菌株TRM45540的總DM 接種TRM45540菌株于ISP4培養(yǎng)基巧％ ^C1濃度）中于28°C培養(yǎng)7d，待菌株生長(zhǎng)出 豐富的抱子后將抱子轉(zhuǎn)接于YEME培養(yǎng)基巧％ ^Cl濃度）中生長(zhǎng)36-4化后，收集菌體提取 菌株的總DNA; ISP4培養(yǎng)基配方：淀粉：10g · L 1，（NH4)2S〇4:4g · L 1，Μ拆〇4:2g · L 1，K2HP〇4:2g · L 1，CaC〇3 Ig · L1，化Cl40g · L1，瓊脂：18g · L1，pH 7. 2-7. 4 ; YEME培養(yǎng)基配方：薦糖：340g·Li，葡萄糖：10g·Li，麥芽膏：3g·Li，細(xì)菌蛋白腺： 5g·L1，酵母膏：3g·L1，加蒸饋水至IL，115°C滅菌20min; 提取鏈霉菌TRM45540總DNA的方法：收集菌體放入無(wú)菌EP管中，加入480μL的 1XTE，加入20μΙ的溶菌酶巧0mg，mLi)。放入37°C搖床中，200r/min振蕩過(guò)夜。每管加入 50μΙ20%的SDS，加入5μΙ20mg.血1的蛋白酶K，放入60°C水浴鍋中溫育1~2h。加入 550μL的酪：氯仿：異戊醇（25:24:1)，120001·.min1離屯、lOmin，取上清移入另一離屯、管 中，反復(fù)抽提2~3次。取上清，加入800μL的無(wú)水乙醇，加入80μL的乙酸鋼（3mol'Ll)， 放入4°C冰箱中沉淀DNA約比。12000r.min1離屯、lOmin，棄上清。加入300μL的70%乙 醇清洗離屯、產(chǎn)物1~2次，12000Γ·min1離屯、5min，棄上清，將乙醇揮發(fā)完全。加入50μL 無(wú)菌超純水充分底部的DNA，電泳檢測(cè)DM提取質(zhì)量，放入-20°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?克隆海藻糖合成酶基因：WTRM45540菌株的總DNA為模板，WTreAF:CGC GGATCCGTGCGCAAGACCTTGATC，TreAR:CCCAAGCTTTCACAGCAGCGCCTTCAG為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C:5min;94°C:30s，52°C:30s，72°C:1.SminCM巧cles) ;72°C:10min，反應(yīng) 完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)； 通過(guò)TA克隆得到攜帶有該基因的克隆子pl