專利名稱：：一種基因組重排木霉菌及其制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)纖維素酶髙及降解玉米秸稈效果好的木霉菌基因組重排菌株、重排菌株的制備方法、固體發(fā)酵產(chǎn)酶的條件優(yōu)化及該菌株降解玉米秸稈。
背景技術(shù)：
：纖維素(cellulose)是自然界中存在最廣泛的一類碳水化合物。同時(shí)，它也是地球上最豐富、最廉價(jià)的再生資源，纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，約占植物干重的三分之--至二分之一，廣泛而大量地存在于自然界中，是地球上最為豐富的可再生的生物聚合物之一。有資料表明，全世界每年的植物體生成量達(dá)1500億噸千物質(zhì)，其中纖維素及半纖維素的總量為850億噸。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究，人們發(fā)現(xiàn)能夠降解和利用變性纖維素(如磷酸膨脹纖維素)，纖維素衍生物(如梭甲基纖維素)的微生物種類繁多，在真細(xì)菌、放線菌、部分酵母和高等真菌等很多主要的微生物類群中都有發(fā)現(xiàn)。但是，能合成組分齊全的纖維素酶體系，并向外分泌，水解天然纖維素材料的種類則相對(duì)有限，許多種細(xì)菌、放線菌以及擔(dān)子菌可在天然纖維素材料上生成，有很強(qiáng)的分解纖維素的能力，但胞外纖維素酶活往往很低，而多數(shù)纖維素降解真菌，特別是霉菌產(chǎn)生的纖維素酶都能分泌于體外。目前多數(shù)纖維素酶的研究都集中在胞外酶活較高的木霉屬(Trichoderma)的幾個(gè)種粉狀側(cè)孢(Sporitrichumpalverulentum)，腐皮鐮孢(Fusariumsolani)，繩狀青霉(Pencilliumfuniculosum)，曲霉屬(/1we/^i7:丄"s)，青霉屬(尸朋i'c"""/7)和枝頂孢霉(力ci"e卿/i'，)等霉菌和木腐菌菌株上。其中尤以木霉屬的產(chǎn)量居多，木霉(7>i'c/00^7^)屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、粘孢菌類，是一類普遍存在的絲狀真菌。霉菌是線狀的，對(duì)纖維素纖維的降解集中在纖維的端部，并不斷生長(zhǎng)，由內(nèi)向外消化纖維素，使其逐漸被分解破壞。里氏木霧(7>ic/70ofe/777ai-ee5e/)、康氏木霄(7>/c/oc/e/m3/rcw//g7'/)禾口纟錄色木霄(rr/c/wtfermflw'/7'ofe)等是木霉屬中產(chǎn)纖維素酶活性較高的菌種，特別是綠色木霉(7Wc/wt/e/77ia"r"d及其近緣的菌株，能產(chǎn)生三類纖維素酶，所產(chǎn)生的纖維素酶能分泌到菌體外，一般不聚集形成多酶復(fù)合體，但相互發(fā)生強(qiáng)烈的協(xié)同作用，破壞植物細(xì)胞壁，將植物纖維素分解為葡萄糖。Genomeshuffling技術(shù)是在傳統(tǒng)誘變基礎(chǔ)上，通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)，對(duì)誘變后的微生物細(xì)胞進(jìn)行基因組重組，從而使具有正向突變的菌株將其優(yōu)點(diǎn)結(jié)合在一起，進(jìn)而提高微生物細(xì)胞的正向突變頻率及正向突變速度。隨著DNA改組等定向進(jìn)化技術(shù)的發(fā)展，在90年代初美國(guó)加州的Maxgen公司Ste國(guó)er等人提出的Genomeshuffling技術(shù)的概念，這種技術(shù)是分子定向進(jìn)化在全基因組水平上的延伸.它將重組的對(duì)象從單個(gè)基因擴(kuò)展到整個(gè)基因組，因此，可以在更為廣泛的范圍內(nèi)對(duì)菌種的目的性狀進(jìn)行優(yōu)化組合.進(jìn)行基因組重排首先需要有一個(gè)含有各種不同正突變的基因組庫(kù)(例如通過(guò)經(jīng)典的誘變育種得到目的性狀發(fā)生改進(jìn)的不同的正突變菌株就構(gòu)成了所需的基因組庫(kù)).隨后通過(guò)原生質(zhì)體融合將這些正突變菌株的全基因組進(jìn)行隨機(jī)重組，并篩選目的性狀得到進(jìn)一歩改進(jìn)的菌株來(lái)進(jìn)行下----輪基因組重排，這樣，通過(guò)循環(huán)多輪的隨機(jī)重組可以快速、高效地選育出表型得到較大改進(jìn)的雜交菌種.其具體操作過(guò)程是通過(guò)對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行誘變，然后在模擬DNA重組的條件下對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行遞推式多次融合(recursiveprotoplast),最后篩選出具有多重正向進(jìn)化標(biāo)記的目標(biāo)菌株。具體做法如下在采用遞推式原生質(zhì)體融合對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行融合的過(guò)程中，誘變，首先要進(jìn)行原生質(zhì)體的制備，然后模擬DNA改組的反應(yīng)溫度條件對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行融合，然后在非選擇條件下再生；再生原生質(zhì)體菌絲混合就構(gòu)成了FL;Fl長(zhǎng)成菌落，長(zhǎng)出的菌落再被制備成為原生質(zhì)體，同時(shí)用同樣的方法再進(jìn)行融合再生，這一過(guò)程重復(fù)三、四次得到后代菌落；與對(duì)照相比，融合后代有效率達(dá)到60%、17%、2.5%,較之未融合前增加了40-105倍。這一過(guò)程中操作的方法與原生質(zhì)體融合技術(shù)基本相同。例如，在Ying-XinZhang等人的研究中，以四株?duì)I養(yǎng)缺陷型的弗氏鏈霉菌為模型進(jìn)行鏈霉菌之間的重組，實(shí)驗(yàn)表明采用的原生質(zhì)體融合是實(shí)現(xiàn)基因組重組的十分有效的辦法，重組有效率超過(guò)20%。檢測(cè)四株經(jīng)多營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鏈霉菌的原生質(zhì)體重組的后代發(fā)現(xiàn)，重組中含有兩個(gè)標(biāo)記的重組后代為3%,含有三個(gè)標(biāo)記的為0.04%,四個(gè)標(biāo)記為0.00005%。在這一過(guò)程中，我們可以看到，后代中帶有多重正向進(jìn)化標(biāo)記重組子出現(xiàn)的幾率是采用原始誘變育種方法的40-105倍。這一結(jié)果將為多基因重組提供有效依據(jù)，使得我們可以通過(guò)DNA改組，，獲得含有多個(gè)親本遺傳信息的更有意義的子代。采用表型的篩選法，可以直接對(duì)已知或未知的代謝途徑進(jìn)行快速優(yōu)化、構(gòu)建新的代謝途徑用于合成新化合物或降解毒害物質(zhì)，極大地促進(jìn)了代謝工程的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用。其優(yōu)化范圍從單個(gè)蛋白，整個(gè)代謝途徑或前體供應(yīng)途徑，到整個(gè)基因組。Genomeshuffling可以利用重組DNA技術(shù)對(duì)細(xì)胞的多種不同基因組進(jìn)行定點(diǎn)改造和修飾，增加多基因重組的幾率，可以得到各種改造后的細(xì)胞組成多樣性的基因組庫(kù)，然后通過(guò)循環(huán)的基因組重排，篩選集多個(gè)改造基因于一體的細(xì)胞，這樣可以極大地加快工程菌株的構(gòu)建進(jìn)程，減少對(duì)菌株進(jìn)行多個(gè)基因改造和組合的困難，并明確重組優(yōu)化的原因或本質(zhì)?；蚪M重排已經(jīng)被證明是一種有效的、新穎的全細(xì)胞的進(jìn)化方式，可以快速提高工業(yè)微生物的表型。這是在傳統(tǒng)育種、原生質(zhì)體融合育種以及基因工程育種的基礎(chǔ)上對(duì)微生物育種技術(shù)的一次革命性的改進(jìn)。原始菌株一綠色木霉和康寧木霉購(gòu)自中科院微生物研究所，可以發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，但是這兩種木霉菌產(chǎn)酶能力有限，還不能達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的要求，通過(guò)傳統(tǒng)的誘變方法提高產(chǎn)酶能力的幅度不大，而基因工程的方法又不能克隆齊全的纖維素酶系。
發(fā)明內(nèi)容-本發(fā)明提供一種基因組重排木霉菌及其制備及其應(yīng)用。通過(guò)基因組重排技術(shù)手段，以解決原始菌株一綠色木霉產(chǎn)酶能力有限、不能達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)要求的問(wèn)題。在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCCNu.2360。保藏H期2008丄24,分類命名木霉。本發(fā)明所提供一種上述基因組重排木霉菌的制備方法包括下列歩驟(一)將原始菌株綠色木霉AS3.3711和康寧木霉，分別采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行純化，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，挑取生長(zhǎng)較旺盛的菌落進(jìn)行剛果紅培養(yǎng)基平板及固體發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定纖維素酶活；(二)基因組重排-(1)原生質(zhì)體制備與再生將純化后生長(zhǎng)最旺盛產(chǎn)酶最高的綠色木霉AS3.3711和康寧木霉的孢子在水中稀釋至呈淺綠色，為(1~5)Xi0'個(gè)孢子，mr，將孢子懸浮液lml加入到盛有10Gml液體菌絲培養(yǎng)基的三角瓶中，瓶放到搖床中，振蕩培養(yǎng)，條件為28-30'C,200r/min，20-24h,在無(wú)菌條件下，將無(wú)菌條件下培養(yǎng)的菌絲經(jīng)4層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾，用無(wú)菌水沖洗兩次，再用高滲緩沖液清洗兩次，稱重后加入到50mL離心管中，將新配制好的酶液加入到50ml離心管中，加入量為菌絲重的2倍，29-32。C下振蕩培養(yǎng)180r/min，2-5h，用4層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾除去菌絲碎片，收集濾液置于離心管中，3000r/肌n離心lOnun收集原生質(zhì)體，重新用該高滲緩沖液反復(fù)洗滌23次，用血球計(jì)數(shù)法確定原生質(zhì)體溶液的濃度，并調(diào)至107個(gè)/ml;(2)原生質(zhì)體初級(jí)誘變將步驟(1)制備的原生質(zhì)體分別采用紫外線UV和甲基磺酸乙酯EMS兩種誘變方法進(jìn)行誘變處理，涂布到再生培養(yǎng)基上再生，然后將再生菌株通過(guò)剛果紅培養(yǎng)基平板和固體發(fā)酵試驗(yàn)，分別篩選得到經(jīng)紫外線誘變的產(chǎn)纖維素酶比原始菌株增加1%以上的多株突變菌株--Tv-UV及Tk-UV和經(jīng)甲基磺酸乙酯誘變的產(chǎn)纖維素酶比原始菌株增加1%以上的多株突變菌株一Tv-EMS及Tk-EMS;(3)多母本遞進(jìn)式原生質(zhì)體融合即基因組重排將步驟(2)得到的紫外線-UV和甲基磺酸乙酯-EMS誘變菌株按照步驟(1)分別制備原生質(zhì)，并把各原生質(zhì)體等體積混合后均分為兩組，一組置于功率15W的紫外燈下處理5-20min，另一組置于60。C水浴中處理30-120min完全滅活后，混合后3000rpm離心5min，棄上清，加入30"C預(yù)熱的PEG融合液lml,30"C保溫20min，4000rpm離心，用液體高滲緩沖液離心洗漆3次，并作適當(dāng)稀釋，取200ul涂布于再生培養(yǎng)基上，29"C培養(yǎng)5-7天觀察長(zhǎng)出菌落。將菌落接種到剛果紅培養(yǎng)基平板培養(yǎng)測(cè)透明圏，挑取透明圈與菌落比較大的進(jìn)行固體發(fā)酵測(cè)定纖維素酶活。得到產(chǎn)酶量比原始菌株高2W的以上的突變菌株一T-Fl;將4個(gè)T-Fl菌株繼續(xù)步驟(3)進(jìn)行下一輪的原生質(zhì)體制備、滅活、融合與剛果紅培養(yǎng)基平板固體發(fā)酵試驗(yàn)篩選，測(cè)定纖維素酶活，得到產(chǎn)酶量比T-Fl突變菌株高2%以上的突變菌株一T-F2;對(duì)上述獲得的F2菌株進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)、產(chǎn)酶量性質(zhì)分析，獲得一株產(chǎn)纖維素酶最高的突變菌株T-F22,即本發(fā)明所述的基因組重排木霉菌菌株。本發(fā)明中平板篩選方法中包括纖維素剛果紅培養(yǎng)基K2HPO40.50g,MgSO4，0.25g，纖維素粉1.88g，剛果紅0.20g,瓊脂14.00g,明膠2.00g，加1。/。的微晶纖維素，蒸餾水1000ml,PH7.0。121。C滅菌20min，冷卻至50'C,倒平板。將重組菌點(diǎn)接種到纖維素剛果紅培養(yǎng)基平板中央，29。C培養(yǎng)3-5cl，測(cè)透明圈與菌落直徑并算出二者的比值；.固體發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)麩皮5.0g，K2HPO40.05g，硫酸銨0.125g，Tween-80O.lml蒸餾水12.5ml，pH5.5。28°C,150rpm進(jìn)行需氧發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵84h，取樣測(cè)纖維素酶活。本發(fā)明所使用的方法以羧甲基纖維素鈉為底物，利用3,5-二硝基水楊酸法(DNS)測(cè)定葡萄糖含量，從而測(cè)定纖維素酶活。本發(fā)明涉及一種固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的方法先將菌種活化，然后接種到種子培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，再按接種量為5%15%濃度，水料比為1.03.0，發(fā)酵培養(yǎng)基中包括碳源為1%秸稈+1%麩皮質(zhì)量濃度1.5%2%和氮源為硫酸鈸質(zhì)量濃度1.5%2%,發(fā)酵曲的初始pH值為4.57.0左右，發(fā)酵于26。C3rC，發(fā)酵72h84h。本發(fā)明在對(duì)基因組重排木霉菌T-F22在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化過(guò)程中，碳源為2%秸稈、2%麩皮、1%秸稈+1%麩皮、1%秸稈+0.5%麩皮+0.5%CMC-Na;氮源為硫酸銨、硝酸銨、蛋白胨、脲、酵母膏。進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，碳源為1%秸稈+1%麩皮；氮源為硫酸銨；本發(fā)明最佳實(shí)施方案中碳源為1%秸稈+1%麩皮；氮源為硫酸銨。進(jìn)一步，本發(fā)明采用響應(yīng)面分析方法，對(duì)本發(fā)明菌株木霉菌T-F22發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定培養(yǎng)基中成分最佳濃度。本發(fā)明基因組重排木霉菌T-F22接種量為2%20%濃度。進(jìn)一歩優(yōu)選實(shí)施方案中接種量為5%15%濃度；本發(fā)明最佳實(shí)施方案中接種量為10%。本發(fā)明基因組重排木霉菌T-F22初始pH值為4.57.0左右。進(jìn)一歩優(yōu)選實(shí)施方案中初始PH值為5.06.0左右；本發(fā)明最佳實(shí)施方案中初始pH值為5.5。本發(fā)明基因組重排木霉菌T-F22發(fā)酵溫度26'C3rC。進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中發(fā)酵溫度27'C30'C;本發(fā)明最佳實(shí)施方案中發(fā)酵溫度為28°C。本發(fā)明基因組重排木霉菌T-F22發(fā)酵時(shí)間24h108h，進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中發(fā)酵時(shí)間72h84h;本發(fā)明最佳實(shí)施方案中發(fā)酵時(shí)間為84h。本發(fā)明所提供一種基因組重排木霉菌高效降解玉米秸稈的應(yīng)用。本發(fā)明提供的基因組重排木霉菌T-F22菌株的特征如下分類命名為木霉亞種。特征描述為菌落在PDA平板上生長(zhǎng)較快，菌絲層比較薄，呈叢束狀，初期為白色，平坦，中期產(chǎn)生分生孢子呈大小不同零星狀，外部被白色菌絲包裹，后期大小不同零星狀產(chǎn)孢區(qū)部分呈深綠色。該菌種具有較高纖維素酶酶活，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化，優(yōu)化后的條件為接種量為10%濃度，發(fā)酵培養(yǎng)基中包括1%秸稈粉+1%麩皮的碳源和2%體積濃度的氮源，發(fā)酵曲的初始pH值為5.5左右，發(fā)酵于28'C29'C,發(fā)酵72h84h，其酶活是綠色木霉AS3.3711的1.5_2倍。在降解玉米秸稈的過(guò)程中，可將葉片的薄壁組織降解，使葉片分層并將細(xì)胞內(nèi)組分釋放出來(lái)，只剩下表皮部分。本發(fā)明對(duì)每一輪突變菌株進(jìn)行表型篩選(纖維素酶產(chǎn)量)，獲得多個(gè)親本突變株后進(jìn)行基因組重排(genomeshuffling),使菌株的正突變特性高度組合，選育高產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)良菌株。解決了原始菌株一綠色木霉產(chǎn)酶能力有限的問(wèn)題，能滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求。圖1為重排木霉菌T-F22經(jīng)10次傳代培養(yǎng)產(chǎn)酶量變化。圖2為重排木霉菌T-F22與原始菌株的形態(tài)比較。圖3為突變株與原始菌株的產(chǎn)酶能力的比較。圖4為重排木霉菌T-F22與原始菌株全細(xì)胞SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳比較。圖5為優(yōu)化發(fā)酵條件響應(yīng)面法立體分析圖。圖6為重排木霉菌T-F22降解玉米秸稈產(chǎn)還原糖含量曲線。圖7為重排木霉菌T-F22與原始菌株降解玉米秸稈效果。如圖1所示，其中重排木霉菌T-F22固體培養(yǎng)基發(fā)酵84h，測(cè)定纖維素酶活。橫坐標(biāo)表示重排木霉菌T-F22培養(yǎng)的次代數(shù)，縱坐標(biāo)表示每代發(fā)酵產(chǎn)酶。如圖2所示，A為綠色木霉AS3.3711菌落形態(tài)，B為重排菌株T-F22菌落形態(tài)，C為康寧木霉菌落形態(tài)。如圖3所示，突變株與原始菌株固體培養(yǎng)基發(fā)酵84h，測(cè)定纖維素酶活。Tv表示原始菌株綠色木霉AS3.3711;Tk表示原始菌株康寧木霉；Tv-UV表示經(jīng)紫外誘變的綠色木霉菌株；Tk-UV表示經(jīng)紫外誘變的康寧木霉菌株；Tv-EMS表示經(jīng)甲基磺酸乙酯誘變的綠色木霉菌株；Tk-EMS表示經(jīng)甲基磺酸乙酯誘變的康寧木霉菌株；T-Fll-14表示第一輪改組菌株；T-F21-23表示第二輪改組菌株。如圖4所示，重排木霉菌T-F22與原始菌株綠色木霉AS3.3711和康寧木霉進(jìn)行全細(xì)胞SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳比較，M表示蛋白質(zhì)marker;A表示重排木霉菌T-F22;B表示綠色木霉AS3.3711;C表示康寧木霉。綠色木霉AS3.3711和康寧木霉是同屬木霉屬，有很多相似條帶，重排木霉菌T-F22多數(shù)條帶與康寧木霉相同，也有3-4條特征帶只與綠色木霉AS3.3711相同，還有些條帶與綠色木霉AS3.3711亮度上也有差異。如圖5所示，從響應(yīng)面立體分析圖中可知，當(dāng)吐溫一80為0.3g和微晶纖維素為3.()g時(shí)，纖維素酶產(chǎn)量達(dá)到最大值127.496IU/ml。如圖6所示，重排木霉菌T-F22降解玉米秸稈產(chǎn)還原糖含量曲線，還原糖含量隨培養(yǎng)天數(shù)的變化而波動(dòng)，在第5天出現(xiàn)最低點(diǎn)。如圖7所示，A表示降解前的玉米秸稈;B表示綠色木霉AS3.3711降解后玉米秸稈;C重排木霉菌T-F22降解后玉米秸稈。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)施例l、基因組重排技術(shù)選育木霉菌株(一)原始菌株的純化和形態(tài)學(xué)研究及產(chǎn)酶特性分析將原始菌株綠色木霉AS3.3711和康寧木霉，分別采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行純化，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，挑取生長(zhǎng)較旺盛的菌落進(jìn)行剛果紅培養(yǎng)基平板及固體發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定纖維素酶活。纖維素剛果紅培養(yǎng)基K2HPO40.50g，MgS04，0.25g，纖維素粉1.88g，剛果紅0.20g，瓊脂14.00g,明膠2.OOg，加1。/。的微晶纖維素，蒸餾水1000ml，PH7.0。12rC滅菌20nun，冷卻至50'C，倒平板。將重組菌點(diǎn)接種到纖維素剛果紅培養(yǎng)基平板中央，29'C培養(yǎng)3-5d，測(cè)透明圈與菌落直徑并算出二者的比值；.固體發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn):麩皮5.0g，K2HPO40.05g，硫酸銨0.125g，Tween-80O.lml蒸餾水12.5ml，pH5.5。28'C，150rpm進(jìn)行需氧發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵84h，取樣測(cè)纖維素酶活。本發(fā)明所使用的方法以羧甲基纖維素鈉為底物，利用3,5-二硝基水楊酸法(DNS)測(cè)定葡萄糖含量，從而測(cè)定纖維素酶活。(二)基因組重排(1).原生質(zhì)體制備與再生將純化后生長(zhǎng)最旺盛產(chǎn)酶最高的綠色木霉AS3.3711和康寧木霉的孢子在水中稀釋至呈淺綠色，為(1~5)X10'個(gè)孢子'mr。將孢子懸浮液lmL加入到盛有100mL液體菌絲培養(yǎng)基的三角瓶中，瓶放到搖床中，振蕩培養(yǎng)，條件為28-3CTC,200r/min，20-24h，在無(wú)菌條件下，將無(wú)菌條件下培養(yǎng)的菌絲經(jīng)4層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾，用無(wú)菌水沖洗兩次，再用高滲緩液清洗兩次，該高滲緩沖液為0.6M的山梨糖醇，O.OlMTris-HC1PH值7.5,麵CaCl—,;稱重后加入到50mL離心管中，將新配制好的酶液加入到50mL離心管中，該酶液為0.5%溶壁酶+O.3%蝸牛酶+0.3%纖維素酶，加入量為菌絲重的2倍，29-32。C下振蕩培養(yǎng)180r/min,2-5h，用4層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾除去菌絲碎片，收集濾液置于離心管中，3()00r/阻n離心l()m':n收集原生質(zhì)體，重新用高滲緩沖液反復(fù)洗滌23次，用血球計(jì)數(shù)法確定原生質(zhì)體溶液的濃度，并調(diào)至10'個(gè)/ml。(2).原生質(zhì)體初級(jí)誘變紫外線UV誘變:將步驟(1)制備好的原生質(zhì)體調(diào)整濃度為107cfu/ml，取10ml原生質(zhì)體置于滅過(guò)菌的帶磁力棒的培養(yǎng)皿(直徑90國(guó))中，培養(yǎng)皿放置在磁力攪拌器載物臺(tái)上，開(kāi)啟攪拌器，在預(yù)熱20min的紫外燈下(距離為30cm)邊照射邊攪拌，并計(jì)時(shí)。分別于2min，5min，10min,15min和20min各取2ml原生質(zhì)體溶液，進(jìn)行倍數(shù)稀釋后涂布于再生培養(yǎng)基上再生，29'C,培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)，5天后觀察結(jié)果。將再生平板上長(zhǎng)出的菌落點(diǎn)接種到纖維素剛果紅平板上，29'C，培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)3d,挑取透明圈與菌落直徑比值較大的進(jìn)行固體發(fā)酵，3d測(cè)定纖維素酶產(chǎn)量。獲得兩株產(chǎn)酶量較高的菌株--Tv-UVl和Tk-UVl。其中再生培養(yǎng)基為葡萄糖20.0g,蔗糖200g,瓊脂4.0g,(NH山SO,1.4g，KH2P042.Og,K3P044.Og,MgS047H200.3g，NaCl17.5g，CaCl20.3g，吐溫-800.lg，再加入礦質(zhì)元素(mg/L).FeS047H205.Omg'MnS041.6mg,ZnS04.7H201.4mg,CoCl2HU2.0mg,定容至1000ml。甲基磺酸乙酯(EMS)誘變將步驟A制備好的原生質(zhì)體調(diào)整濃度為i07cfu/ml，取10ml原生質(zhì)體,向其中加入甲基磺酸乙酯使終濃度為1.0mol/L，分別于2min,5nun,l()min，15min和20min各取2ml原生質(zhì)體溶液，3000r/min離心10min收集原生質(zhì)體，重新用高滲緩沖液反復(fù)洗滌23次，倍數(shù)稀釋后涂布于原生質(zhì)體再平板上，29'C,培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)，5天后觀察結(jié)果。按紫外線誘變后篩選方法進(jìn)行篩選，獲得兩株產(chǎn)酶量較高的菌株--Tv-EMS2和Tk-EMS2。(3).多母本遞進(jìn)式原生質(zhì)體融合即基因組重排將步驟(2)得到的4株紫外線-UV和甲基磺酸乙酯-EMS誘變菌株按照歩驟(1)分別制備原生質(zhì)，并把各原生質(zhì)體等體積混合后均分為兩組，一組置于功率15W的紫外燈下處理5-20min，另一組置于60。C水浴中處理30-120min完全滅活后，混合后3000rpm離心5min，棄上清，加入30T預(yù)熱的PEG融合液lml，該P(yáng)EG制備方法是:70gPEG-4000溶于100mLddH2O中,1.034X105Pa滅菌20min，4'C保存，30"C保溫20min，4000rpm離心，用液體高滲緩沖液離心洗滌3次，并作適當(dāng)稀釋，取2ml涂布于再生培養(yǎng)基上，29T培養(yǎng)7天觀察長(zhǎng)出菌落。將菌落接種到剛果紅培養(yǎng)基平板培養(yǎng)測(cè)透明圈，挑取透明圈與菌落比較大的進(jìn)行固體發(fā)酵測(cè)定纖維素酶活。獲得4株產(chǎn)酶量較高的菌株T-FllT-F12T-F13T-F14;將所得的4株F1菌株按同樣策略進(jìn)行培養(yǎng)，原生質(zhì)體制備，融合，再生后將菌落接種到剛果紅培養(yǎng)基平板培養(yǎng)測(cè)透明圈，挑取透明圈與菌落比較大的進(jìn)行固體發(fā)酵測(cè)定纖維素酶活，獲得3株產(chǎn)酶量較高的F2菌株T-F21，T-F22，T-F23。(三)突變菌株的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)將第二輪重排菌株分別進(jìn)行PDA培養(yǎng)基傳代10次，對(duì)每一代菌株進(jìn)行固體發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)，測(cè)定纖維素酶活(圖l)?；蚪M重排木霉菌T-F22經(jīng)10次傳代培養(yǎng)，每一代菌株固體發(fā)酵產(chǎn)酶量沒(méi)有發(fā)生顯著變化，說(shuō)明突變菌株具有很好的遺傳穩(wěn)定性。實(shí)施例2:突變株與原始菌株的比較(1)突變株與原始菌株的形態(tài)的比較將重排菌株T-F22與原始菌株綠色木霉AS3.3711和康寧木霉點(diǎn)接種到PDA上(圖2)，由圖可知，T-F22的生長(zhǎng)速度介于原始菌株綠色木霉AS3.3711和康寧木霉生長(zhǎng)速度中間，且形態(tài)上處于零星分布，與原始菌株不同，大部分顏色與綠色木霉3.3711相似，零星的成熟部分與康寧木霉形態(tài)相似。(2)突變株與原始菌株的產(chǎn)酶能力的比較將經(jīng)紫外線(Tv-UV1和Tk-UV1)，甲基磺酸乙酯(Tv-EMS2和Tk-EMS2)誘變的和第-輪重排，第二輪重排菌株與原始菌株分別經(jīng)固體發(fā)酵，進(jìn)行纖維素酶活測(cè)定(圖3)。比較產(chǎn)纖維素酶能力，經(jīng)紫外線，甲基磺酸乙酯誘變的菌株產(chǎn)酶量較原始菌株區(qū)別不顯著；而重排菌株(T-Fll-14，T-F21-23)產(chǎn)酶能力較原始菌株有明顯提高。第二輪重排菌株提高更顯著。(3)第二輪重排菌株與原始菌株全細(xì)胞SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳比較將第二輪重排菌株與原始菌株進(jìn)行全細(xì)胞SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(圖4)。由圖可見(jiàn)，重排菌株T-F22與原始菌株綠色木霉AS3.3711和康寧木霉大多數(shù)蛋白電泳條帶在相同位置，也有個(gè)別條帶或與綠色木霉AS3.3711相同位置，或與康寧木霉相同位置。實(shí)施例3:固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的方法先將菌種活化，然后接種到種子培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，再按接種量為5%15%濃度，水料比為1.03.0,發(fā)酵培養(yǎng)基中包括碳源為1%秸稈+1%麩皮質(zhì)量濃度1.5%2%和氮源為硫酸銨質(zhì)量濃度1.5%2%,發(fā)酵曲的初始pH值為4.57.0左右，發(fā)酵于26'C3rC,發(fā)酵72h84h。在對(duì)基因組重排木霉菌T-F22在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化過(guò)程中，碳源為2%秸稈、2%麩皮、1%秸稈+1%麩皮、1%秸稈+0.5%麩皮+0.5%CMC-Na;氮源為硫酸銨、硝酸銨、蛋白胨、脲、酵母膏。進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，碳源為1%秸稈+1%麩皮；氮源為硫酸鉸；本發(fā)明最佳實(shí)施方案中碳源為1%秸稈+1%麩皮氮源為硫酸銨。進(jìn)一步，本發(fā)明采用響應(yīng)面分析方法，對(duì)本發(fā)明菌株木霉菌T-F22發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定培養(yǎng)基中成分最佳濃度?；蚪M重排木霉菌T-F22接種量為2%20%濃度。進(jìn)一歩優(yōu)選實(shí)施方案中接種量為5%15%濃度；本發(fā)明最佳實(shí)施方案中接種量為10%?；蚪M重排木霉菌T-F22初始pH值為4.57.0左右。進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中初始pH值為5.06.0左右；本發(fā)明最佳實(shí)施方案中初始pH值為5.5。基因組重排木霉菌T-F22發(fā)酵溫度26'C3rC。進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中發(fā)酵溫度27'C3(TC;本發(fā)明最佳實(shí)施方案中發(fā)酵溫度為28。C。基因組重排木霉菌T-F22發(fā)酵時(shí)間24h108h,進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中發(fā)酵時(shí)間72h84h;本發(fā)明最佳實(shí)施方案中發(fā)酵時(shí)間為84h。培養(yǎng)基條件的優(yōu)化在纖維素酶固體發(fā)酵中，培養(yǎng)基成分是重要的影響因素，特別是一些產(chǎn)酶促進(jìn)劑對(duì)纖維素酶的產(chǎn)量起到很大的作用。因此，我們采用Placket-Burman設(shè)計(jì)(本領(lǐng)域常用的---種統(tǒng)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)法)方法對(duì)％1秸稈+1%麩皮、硫酸銨、大豆粉、吐溫一80、微晶纖維素、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鎂等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化，從而獲得產(chǎn)酶高的發(fā)酵培養(yǎng)基。(1)二水平試驗(yàn)對(duì)基因組重排菌株T-F22,采用Placket-Burman設(shè)計(jì)(表l)表l.Placket-Burman設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>對(duì)％1秸稈+1%麩皮、硫酸銨、大豆粉、吐溫一80、微晶纖維素、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鎂等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化，考察各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)的一級(jí)作用(表2)。利用SAS軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明吐溫一80、微晶纖維素對(duì)基因組重排菌株T-F22產(chǎn)酶有顯著影響。表2Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>(2)最陡爬坡試驗(yàn)由回歸分析結(jié)果可知，％1秸稈+1%麩皮、(隨J大豆粉、CaCl2、Mg2S(V7H2O對(duì)產(chǎn)酶影響不顯著，按照SAS給定的最優(yōu)水平配比。而吐溫一8()和微晶纖維素的濃度對(duì)基因組重組菌T-F22產(chǎn)纖維素酶影響顯著，且X4和X5的系數(shù)均為正數(shù)，說(shuō)明同時(shí)升高吐溫一80和微晶纖維素的濃度對(duì)基因組重組菌T-F22產(chǎn)纖維素酶有積極的影響。以吐溫一80(XI)每次增加O.lg和微晶纖維素(X2)每次增加lg基本步長(zhǎng)(Z),則最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，處理3的吐溫一80和微晶纖維素的濃度己在最優(yōu)點(diǎn)附近，可以此濃度為中心點(diǎn)采用中心組合設(shè)計(jì)來(lái)對(duì)培養(yǎng)基作進(jìn)一歩的優(yōu)化(表3)。表3最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>(3)中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析根據(jù)爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)，對(duì)吐溫一80和微晶纖維素進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)(表4和表5)。分析結(jié)果表明(表6)，模型極顯著(PO.l)，并且有很好的確定系數(shù)，RSq=0.9157這表明基因組重排木霉T-F22產(chǎn)纖維素酶量91.57%的可靠性可由模型來(lái)預(yù)測(cè)。并通過(guò)SAS9.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得二次方程為Yl=127.48+0.374637*X1+0.090538*X2-2.340004*X1*X1-2.275*X1*X2-2.065003*X2*X2由于方程的二次系數(shù)為負(fù)值，方程所代表的拋物面幵口向下，因而該方程有極大值。給出了模型的二維響應(yīng)面(圖5)，證實(shí)了擬合面具有最大值。表4中心組合設(shè)計(jì)各因子及其編碼值<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表5中心組合設(shè)計(jì)及其結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注各因子代碼中心化Xl-(Xl—O.1)/0.1x2=(X2-3)/l表6中心組合設(shè)計(jì)(CCD)回歸分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>用Mathematica對(duì)方程進(jìn)行求導(dǎo)，可以得到模型的最大值，即最大纖維素酶產(chǎn)量。當(dāng)吐溫一80為0.328g和微晶纖維素為2.91g時(shí)，纖維素酶產(chǎn)量達(dá)到127.496IU/ml。為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在優(yōu)化的培養(yǎng)基條件下進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，得到纖維素酶平均產(chǎn)量為127.01IU/ml，這證明實(shí)驗(yàn)值和實(shí)際值之間具有良好的擬合性，優(yōu)化模型可靠。實(shí)施例4:基因組重排木霉菌T-F22降解玉米秸稈利用基因組重排木霉菌T-F22降解玉米秸稈，液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基蛋白胨3.0g，酵母膏0.5g，麩皮5.0g，硫酸銨2.0g，磷酸二氫鉀4.0g，氯化鈣0.3g，硫酸鎂0.3g,Tween-800.2ml,蒸餾水定容1000ml。200ml培養(yǎng)基中加入2.Og玉米秸稈，并加入2ml經(jīng)種子培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)的重排木霉菌T-F22,28°C,150rpm培養(yǎng)，每隔24h測(cè)定還原糖含量(圖6),并設(shè)定對(duì)照。結(jié)果表明，培養(yǎng)基還原糖含量有變化，開(kāi)始還原糖含量減少，說(shuō)明菌體生長(zhǎng)消耗還原糖；一段時(shí)間還原糖含量趨于不變，說(shuō)明木霉菌T-F22降解玉米秸稈產(chǎn)生還原糖與菌體生長(zhǎng)消耗還原糖的量持平，后幾天還原糖含量有所增加，說(shuō)明菌體生長(zhǎng)減慢，并伴有菌體自溶，需糖量減少，降解玉米秸稈產(chǎn)生還原糖增加，培養(yǎng)基的總還原糖量增加。9天后產(chǎn)看降解效果(圖7)，木霉菌T-F22降解后玉米秸稈，邊緣呈透明狀，相間部分呈鋸齒型。而原菌株綠色木霉AS3.3711降解后玉米秸稈無(wú)如此大的變化，木霉菌T-F22在降解玉米秸稈的過(guò)程中，可將葉片的薄壁組織降解，使葉片分層并將細(xì)胞內(nèi)組分釋放出來(lái)，只剩下表皮部分。權(quán)利要求1.一種基因組重排木霉菌，其在中國(guó)微生物菌種保臧管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCCNo.2360。2、一種制備權(quán)利要求l所述基因組重排木霉菌株的方法，其包括如下步驟(一)將原始菌株綠色木霉AS3.3711和康寧木霉，分別采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行純化，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，挑取生長(zhǎng)較旺盛的菌落進(jìn)行剛果紅培養(yǎng)基平板及固體發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定纖維素酶活；(二)基因組重排(1)原生質(zhì)體制備與再生將純化后生長(zhǎng)最旺盛產(chǎn)酶最高的綠色木霉AS3.3711和康寧木霉的孢子在水中稀釋至呈淺綠色，為(1~5)乂107個(gè)孢子，ml—'，將孢子懸浮液lml加入到盛有100ml液體菌絲培養(yǎng)基的三角瓶中，瓶放到搖床中，振蕩培養(yǎng)，條件為28-30°C，200r/min，20-24h,在無(wú)菌條件下，將無(wú)菌條件下培養(yǎng)的菌絲經(jīng)4層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾，用無(wú)菌水沖洗兩次，再用高滲緩沖液清洗兩次，稱重后加入到50mL離心管中，將新配制好的酶液加入到50ml離心管中，加入量為菌絲重的2倍，29-32。C下振蕩培養(yǎng)180r/min，2-5h，用4層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾除去菌絲碎片，收集濾液置于離心管中，3000r/min離心10min收集原生質(zhì)體，重新用該高滲緩沖液反復(fù)洗滌23次，用血球計(jì)數(shù)法確定原生質(zhì)體溶液的濃度，并調(diào)至10'個(gè)/ml;(2)原生質(zhì)體初級(jí)誘變將步驟(1)制備的原生質(zhì)體分別采用紫外線UV和甲基磺酸乙酯EMS兩種誘變方法進(jìn)行誘變處理，涂布到再生培養(yǎng)基上再生，然后將再生菌株通過(guò)剛果紅培養(yǎng)基平板和固體發(fā)酵試驗(yàn)，分別篩選得到經(jīng)紫外線誘變的產(chǎn)纖維素酶比原始菌株增加1%以上的多株突變菌株--Tv-UV及Tk-UV和經(jīng)甲基磺酸乙酯誘變的產(chǎn)纖維素酶比原始菌株增加W以上的多株突變菌株一Tv-EMS及Tk-EMS:(3)多母本遞進(jìn)式原生質(zhì)體融合即基因組重排將步驟(2)得到的紫外線-UV和甲基磺酸乙酯-EMS誘變菌株按照歩驟(1)分別制備原生質(zhì)，并把各原生質(zhì)體等體積混合后均分為兩組，一組置于功率15W的紫外燈下處理5-20min,另一組置于60。C水浴中處理30-120min完全滅活后，混合后3000rpm離心5min,棄上清，加入30"C預(yù)熱的PEG融合液lml，30"C保溫20min，4000rpm離心，用液體高滲緩沖液離心洗滌3次，并作適當(dāng)稀釋，取200ul涂布于再生培養(yǎng)基上，29"C培養(yǎng)5-7天觀察長(zhǎng)出菌落。將菌落接種到剛果紅培養(yǎng)基平板培養(yǎng)測(cè)透明圈，挑取透明圈與菌落比較大的進(jìn)行固體發(fā)酵測(cè)定纖維素酶活。得到產(chǎn)酶量比原始菌株高2先的以上的突變菌株一T-Fl;將4個(gè)T-Fl菌株繼續(xù)步驟(3)進(jìn)行下一輪的原生質(zhì)體制備、滅活、融合與剛果紅培養(yǎng)基平板固體發(fā)酵試驗(yàn)篩選，測(cè)定纖維素酶活，得到產(chǎn)酶量比T-F1突變菌株高2%以上的突變菌株一T-F2;對(duì)上述獲得的F2菌株進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)、產(chǎn)酶量性質(zhì)分析，獲得一株產(chǎn)纖維素酶最高的突變菌株T-F22。3、如權(quán)利要求1所述的基因組重排木霉菌在固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因組重排木霉菌在固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用，其發(fā)酵過(guò)程為接種量為5%15%濃度，水料比為1.03.0，發(fā)酵培養(yǎng)基中包括1.5%2%質(zhì)量濃度的碳源和1.5%2%質(zhì)量濃度的氮源，發(fā)酵曲的初始pH值為4.57.0左右，發(fā)酵于26'C3rC條件下進(jìn)行需氧發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵72h84h。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因組重排木霉菌在固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用，其特征在于碳源為2%秸稈、2%麩皮、1%秸稈+1%麩皮、1%秸稈+0.5%麩皮+0.5%CMC-Na;氮源為硫酸鉸、硝酸銨、蛋白胨、脲、酵母膏。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因組重排木霉菌在固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用，其特征在于碳源為1%秸稈+1%麩皮；氮源為硫酸銨。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因組重排木霉菌在固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用，其特征在于接種量為5%15%濃度，水料比為1.03.0,發(fā)酵培養(yǎng)基中包括碳源為1%秸稈+1%麩皮質(zhì)量濃度1.5%2%和氮源為硫酸銨質(zhì)量濃度1.5%2%，發(fā)酵曲的初始pH值為4.57.0左右，發(fā)酵于26'C3rC條件下進(jìn)行需氧發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵72h84h。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的基因組重排木霉菌在固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用，其特征在于接種量為10%濃度，水料比為2.5，發(fā)酵培養(yǎng)基中包括碳源為1%秸稈+1%麩皮質(zhì)量濃度2%和氮源為硫酸銨質(zhì)量濃度2%，發(fā)酵曲的初始pH值為5.5，發(fā)酵于28'C條件下進(jìn)行需氧發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵84h。9、權(quán)利要求1所述的基因組重排木霉菌在降解玉米秸稈中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種基因組重排木霉菌及其制備及其應(yīng)用。其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCCNo.2360。該菌株可用于固體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，對(duì)其固態(tài)發(fā)酵過(guò)程為接種量為5％～15％濃度，水料比為1.0～3.0，發(fā)酵培養(yǎng)基中包括1.5％～2％質(zhì)量濃度的碳源和1.5％～2％質(zhì)量濃度的氮源，發(fā)酵曲的初始pH值為4.5～7.0左右，發(fā)酵于26℃～31℃條件下進(jìn)行需氧發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵72h～84h。在降解玉米秸稈的過(guò)程中，可葉片的薄壁組織降解，使葉片分層并將細(xì)胞內(nèi)組分釋放出來(lái)，只剩下表皮部分。文檔編號(hào)C12N9/42GK101260371SQ200810050619公開(kāi)日2008年9月10日申請(qǐng)日期2008年4月18日優(yōu)先權(quán)日2008年4月18日發(fā)明者付永平,張發(fā)福,王丕武申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)