一種哈茨木霉菌菌株抗菌肽的制備方法及在防治月季黑斑病中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明一種哈茨木霉菌抗菌肽的制備方法，將1×106CFU/mL哈茨木霉菌孢子懸液接種于液體培養(yǎng)基中，哈茨木霉菌菌株選自菌株編號(hào)為CGMCC 3.5488、CGMCC3.6635、或者CGMCC 3.5492中的任意一種；置于搖床中培養(yǎng)48~96h；將菌液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)6~8天；將發(fā)酵液過濾后，以甲醇?水作流動(dòng)相，采用大孔吸附樹脂柱進(jìn)行粗分離，然后將粗分離產(chǎn)物以甲醇做流動(dòng)相經(jīng)葡聚糖凝膠柱純化，純化產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥得到哈茨木霉菌抗菌肽。還提供了采用上述制備的哈茨木霉菌抗菌肽粉劑在防治月季黑斑病中的應(yīng)用。本發(fā)明制備的哈茨木霉菌抗菌肽純度高，對(duì)月季黑斑病有很高對(duì)防治效果。
【專利說明】
一種哈茨木霉菌菌株抗菌肽的制備方法及在防治月季黑斑病中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種月季，具體來說是一種哈茨木霉菌菌株抗菌肽的制備方法及在防治月季黑斑病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]月季(7?osa cA1efisis Jacp.)，又稱月月紅，四季紅等，花色秀美，四季常開，素有“花中皇后”之美譽(yù)，是世界上重要的觀賞花卉。目前全國有38個(gè)城市把月季作為市花。月季及其姊妹花玫瑰都可提取精油，廣泛應(yīng)用于化妝品和食品行業(yè)，價(jià)值高于黃金。但是月季在種植過程中常發(fā)生一些病害而影響到其觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值，月季黑斑病就是其中最常見最具有毀滅性的一種病害。月季黑斑病傳染性強(qiáng)且防治難。月季黑斑病的病原菌是薔薇盤二孢、Marssonina rosae (Lib.) Died.]，發(fā)病部位主要在葉片，病斑圓形，邊緣放射狀，病斑周圍葉肉變黃，病葉易脫落。嚴(yán)重時(shí)往往幾個(gè)病斑相連，周圍大面積發(fā)黃，甚至植株中下部葉片全部枯黃脫落，僅留下頂端幾片新葉，呈光桿狀。黑斑病使植株生長勢(shì)減弱，重者引起死亡，對(duì)月季的生長和外觀造成了嚴(yán)重影響，因此降低了月季觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。迄今為止，我國大部分的月季種植區(qū)都會(huì)有該病害的發(fā)生，破壞性極強(qiáng)。
[0003]化學(xué)殺菌劑對(duì)生態(tài)環(huán)境、生物及人體具有較大影響，并且植物病原菌的抗藥性日益增加，因此可以利用生物防治菌作為生物殺菌劑來防治花卉病害，以減輕化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境污染。木霉菌(spp)自被發(fā)現(xiàn)對(duì)植物病原菌有抑制作用以來，一直作為重要的植物病害生物防治因子而倍受關(guān)注。木霉是一種重寄生菌，其菌絲常常通過與寄主菌絲平行生長、趨向生長、識(shí)別、接觸、纏繞、附著、穿透及伸入寄主菌絲內(nèi)等方式寄生，直接從寄主菌絲內(nèi)吸取營養(yǎng)，從而破壞寄主的生長發(fā)育，使寄主菌絲失去其原生質(zhì)體的整體性而斷裂或僅剩下空殼，直至死亡。利用木霉菌進(jìn)行生物防治早有應(yīng)用，但都是直接用木霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物直接噴灑的方式來防治植物病害。由于木霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物成分復(fù)雜，對(duì)其防治植物病害的機(jī)理并不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種哈茨木霉菌抗菌肽的制備方法及在防治月季黑斑病中的應(yīng)用，所述的這種哈茨木霉菌抗菌肽的制備方法及在防治月季黑斑病中的應(yīng)用要解決現(xiàn)有技術(shù)中用木霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物防治月季黑斑病的效果不佳的技術(shù)問題。
[0005]本發(fā)明提供了一種哈茨木霉菌抗菌肽的制備方法，包括如下步驟:
I)將I X 106CFU/mL哈茨木霉菌孢子懸液接種于液體培養(yǎng)基中，所述的哈茨木霉菌菌株來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心，選自菌株編號(hào)為CGMCC 3.5488、CGMCC3.6635、或者CGMCC 3.5492中的任意一種，所述的哈茨木霉菌孢子懸液和液體培養(yǎng)基的體積比為Iml: 80?120ml;所述的液體培養(yǎng)基由水、土豆和葡萄糖組成，每升液體培養(yǎng)基中，所述的土豆為180?220 g，所述的葡萄糖為18?22g，余量為水，置于25?30°C、150?200r/min的搖床中培養(yǎng)48?96h;
2)將菌液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐中，于25?30°C、攪拌速率150?200r/min的條件下發(fā)酵培養(yǎng)6?8天，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基由土豆、蔗糖、葡萄糖、無水乙酸鈉、七水硫酸鎂、蛋白胨、氯化錳、消泡劑和水組成，上述物質(zhì)的濃度為:土豆200 g/L，鹿糖10 g/L，葡萄糖10 g/L，無水乙酸鈉1.66 g/L，七水硫酸鎂5.29 g/L，蛋白胨0.5 g/L，氯化錳0.15 g/L，消泡劑0.05g/L，余量為水；
3)將步驟2)的發(fā)酵液過濾后，以甲醇-水作流動(dòng)相，采用大孔吸附樹脂柱進(jìn)行粗分離，然后將粗分離產(chǎn)物以甲醇做流動(dòng)相經(jīng)葡聚糖凝膠柱純化，純化產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥得到哈茨木霉菌抗菌肽。
[0006]進(jìn)一步的，所述的消泡劑為聚氧丙烯甘油醚或聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚。
[0007]本發(fā)明還提供了上述的方法制備的哈茨木霉菌抗菌肽在防治月季黑斑病中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明還提供了一種防治月季黑斑病的方法，包括如下步驟:
1)一個(gè)處理土壤的步驟;將通過上述步驟制備的哈茨木霉菌抗菌肽和育苗基質(zhì)以1:500的比例充分混合；
2)—個(gè)根部處理的步驟，在種苗移栽前，將通過上述步驟制備的哈茨木霉菌抗菌肽稀釋400?600倍后浸根20?40分鐘，然后定植;移栽后，將通過上述步驟制備的哈茨木霉菌抗菌肽稀釋400?600倍后灌根；
3)—個(gè)噴霧的步驟;將通過上述步驟制備的哈茨木霉菌抗菌肽稀釋600?800倍后進(jìn)行噴霧。
[0009]進(jìn)一步的，在步驟I)中，將通過上述制備的哈茨木霉菌抗菌肽和育苗基質(zhì)以1:10的比例充分混合后，撒入苗床，每公斤處理苗床10—15平方米。
[0010]哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)是木霉菌屬中一種重要的防治植物病原菌的真菌。哈茨木霉菌發(fā)酵液可用于多種植物真菌病害的防治。其中起主要作的為木霉菌抗菌肽。本發(fā)明選擇的哈茨木霉菌來自中國普通微生物菌種保藏管理中心(www.cgmcc.net)，菌株編號(hào)為CGMCC 3.5488、CGMCC3.6635、CGMCC 3.5492，根據(jù)該網(wǎng)站和管理中心的公告，任何人均可以購買上述的三種菌株。
[0011]哈茨木霉菌抗菌肽具有廣泛的抗真菌、抗革蘭陽性細(xì)菌的生物活性，其具有的細(xì)胞膜修飾功能，在自然和人工雙層膜中形成電壓依賴性或獨(dú)立的離子通道或孔隙、增加雙分子層脂質(zhì)膜的通透性等，以殺死植物病原菌。木霉菌抗菌肽與木霉屬真菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶聯(lián)合作用對(duì)植物病原真菌具有協(xié)同抑制作用效果。
[0012]本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)效果是積極和明顯的。本發(fā)明制備的哈茨木霉菌抗菌肽純度高，對(duì)月季黑斑病有很高對(duì)防治效果。本發(fā)明制備的哈茨木霉菌抗菌肽是微生物制劑，對(duì)環(huán)境友好，對(duì)人體無害，而且使用方便，可以減輕月季黑斑病的發(fā)病，降低病情指數(shù)，防病效果在90%以上，對(duì)月季黑斑病有顯著抑制作用。
【附圖說明】
[0013]圖1為‘普拉米斯’月季品種使用前的照片。
[0014]圖2為‘普拉米斯’月季品種噴施后照片。
[0015]圖3為‘杜克薩’月季品種使用前的照片。
[0016]圖4為‘杜克薩’月季品種噴施后的照片。
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)地闡述。以下實(shí)施例僅僅用于說明和解釋本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的限制。
[0018]實(shí)施例1哈茨木霉菌抗菌肽樣品制備
1.將ImLIXlO6CFlVmL 哈茨木霉菌CGMCC 3.5488或CGMCC 3.6635或CGMCC 3.5492孢子懸液接種于100 mL液體培養(yǎng)基(土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L)中，置于28°C、180 r/min搖床培養(yǎng)72 h；
2.然后將菌液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐中(7L)，于28 °C、攪拌速率180 r/min、發(fā)酵培養(yǎng)7d。發(fā)酵培養(yǎng)基為土豆200 g/L，鹿糖10 g/L，葡萄糖10 g/L，無水乙酸鈉1.66 g/L，七水硫酸鎂5.29 g/L，蛋白胨0.5 g/L，氯化錳0.15 g/L，消泡劑0.05 g/L;
3.1 L發(fā)酵液經(jīng)紗布過濾后，用于干物質(zhì)稱量，4 L發(fā)酵液以甲醇-水作流動(dòng)相用XAD-2大孔吸附樹脂柱進(jìn)行粗分離，然后將目標(biāo)產(chǎn)物以甲醇做流動(dòng)相經(jīng)LH-20葡聚糖凝膠柱純化，純化產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥得到哈茨木霉菌抗菌肽粉劑制品。
[0019]實(shí)施例2哈茨木霉菌抗菌肽制劑對(duì)月季黑斑病的防治方法
1)處理土壤
播種或扦插用基質(zhì)可將制備的哈茨木霉菌抗菌肽粉劑和育苗基質(zhì)以質(zhì)量比1:500的比例充分混合后直接使用;若直接處理苗床，可按質(zhì)量比1:10的比例與育苗基質(zhì)混勻后，撒入苗床，每公斤處理苗床10—15平方；
2)根部處理
種苗移栽前，以哈茨木霉菌抗菌肽的500倍液(哈茨木霉菌抗菌肽的質(zhì)量百分比濃度為0.2%)浸根30分鐘，然后定植;移栽后，可用500倍液(哈茨木霉菌抗菌肽的質(zhì)量百分比濃度為0.2%)灌根。
[0020]3)噴霧
以哈茨木霉菌抗菌肽的800倍液(將哈茨木霉菌抗菌肽稀釋800倍)進(jìn)行噴霧，每年的3-4月，每個(gè)禮拜噴施I次，發(fā)病前或初期使用效果更佳。
[0021]在世博館月季黑斑病預(yù)防中的初步試驗(yàn)使用效果對(duì)比，由圖1、圖2、圖3和圖4可知，經(jīng)過哈茨木霉菌抗菌肽的預(yù)防，統(tǒng)計(jì)可知，感染黑斑病的葉片比率下降80%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種哈茨木霉菌抗菌肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟: 1)將IX 106CFU/mL哈茨木霉菌孢子懸液接種于液體培養(yǎng)基中，所述的哈茨木霉菌菌株來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心，選自菌株編號(hào)為CGMCC 3.5488、CGMCC3.6635、或者CGMCC 3.5492中的任意一種，所述的哈茨木霉菌孢子懸液和液體培養(yǎng)基的體積比為Iml: 80?120ml;所述的液體培養(yǎng)基由水、土豆和葡萄糖組成，每升液體培養(yǎng)基中，所述的土豆為180?220 g，所述的葡萄糖為18?22 g，余量為水，置于25?30°C、150?200r/min的搖床中培養(yǎng)48?96h; 2)將菌液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐中，于25?30°C、攪拌速率150?200r/min的條件下發(fā)酵培養(yǎng)6?8天，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基由土豆、蔗糖、葡萄糖、無水乙酸鈉、七水硫酸鎂、蛋白胨、氯化錳、消泡劑和水組成，上述物質(zhì)的濃度為:土豆200 g/L，鹿糖10 g/L，葡萄糖10 g/L，無水乙酸鈉1.66 g/L，七水硫酸鎂5.29 g/L，蛋白胨0.5 g/L，氯化錳0.15 g/L，消泡劑0.05g/L，余量為水； 3)將步驟2)的發(fā)酵液過濾后，以甲醇-水作流動(dòng)相，采用大孔吸附樹脂柱進(jìn)行粗分離，然后將粗分離產(chǎn)物以甲醇做流動(dòng)相經(jīng)葡聚糖凝膠柱純化，純化產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥得到哈茨木霉菌抗菌肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種哈茨木霉菌抗菌肽的制備方法，其特征在于:所述的消泡劑為聚氧丙烯甘油醚或聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚。3.通過權(quán)利要求1所述的方法制備的哈茨木霉菌抗菌肽在防治月季黑斑病中的應(yīng)用。4.一種防治月季黑斑病的方法，其特征在于包括如下步驟: 1)一個(gè)處理土壤的步驟;將權(quán)利要求1制備的哈茨木霉菌抗菌肽和育苗基質(zhì)以質(zhì)量比為1:500的比例充分混合； 2)—個(gè)根部處理的步驟，在種苗移栽前，將權(quán)利要求1制備的哈茨木霉菌抗菌肽稀釋400?600倍后浸根20?40分鐘，然后定植;移栽后，將權(quán)利要求1制備的哈茨木霉菌抗菌肽稀釋400?600倍后灌根； 3)—個(gè)噴霧的步驟;將權(quán)利要求1制備的哈茨木霉菌抗菌肽稀釋600?800倍后進(jìn)行噴霧。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種防治月季黑斑病的方法，其特征在于:在步驟I)中，將權(quán)利要求I制備的哈茨木霉菌抗菌肽和育苗基質(zhì)以1:1O的比例充分混合后，撒入苗床，每公斤處理苗床10—15平方米。
【文檔編號(hào)】A01N63/04GK105969828SQ201610363304
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】張冬梅, 高紅亮, 羅玉蘭, 張愛明, 尹麗娟, 有祥亮, 侯霄帆
【申請(qǐng)人】上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院