本發(fā)明涉及植物抗病性鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于甘薯黑斑病抗性鑒定中的黑斑病菌培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

甘薯是世界上重要的糧食、飼料和工業(yè)原料用作物，甘薯黑斑病(sweetpotato black rot)是危害甘薯最普遍的儲(chǔ)藏期病害，我國(guó)每年由甘薯黑斑病造成的甘薯損失約10％左右，它是由甘薯長(zhǎng)喙殼菌(Ceratocystis fimbriata Ellis etHalsted)侵染引起的，是甘薯生產(chǎn)上一種重要病害，在我國(guó)各甘薯產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。該病能造成甘薯儲(chǔ)藏時(shí)爛窖，育苗時(shí)爛床和死苗，對(duì)甘薯生產(chǎn)影響極大。且病薯毒害較大，如用病薯喂養(yǎng)牲畜，會(huì)發(fā)生氣喘病而死亡；用病薯釀酒，則發(fā)酵遲緩并降低酒精的產(chǎn)量與質(zhì)量，嚴(yán)重制約甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。甘薯黑斑病可通過種薯、薯苗及土壤等多種途徑傳播，很難徹底根除，由于甘薯黑斑病是一種傳播途徑較多的頑固性病害，目前大多采用綜合防治的方法加以控制，其中選育抗黑斑病甘薯品種是防治黑斑病的重要途徑之一。而黑斑病抗性鑒定是甘薯抗病育種的基礎(chǔ)，然而目前生產(chǎn)上采用的甘薯黑斑病抗性鑒定方法仍有不足，尤其是病原菌的擴(kuò)大培養(yǎng)，通常采用薯片法獲得孢子懸浮液，不僅薯片易腐爛，也容易混入雜菌、耗時(shí)較長(zhǎng)，因此無法科學(xué)高效地對(duì)甘薯品種黑斑病的抗性做出評(píng)價(jià)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)狀，本發(fā)明提供了一種用于甘薯黑斑病抗性鑒定中的黑斑病菌培養(yǎng)方法，該方法科學(xué)高效、操作簡(jiǎn)單，縮短黑斑病菌孢子懸浮液制備時(shí)間的同時(shí)，減少雜菌的污染，在甘薯黑斑病抗性鑒定中能夠精確全面反映甘薯品種對(duì)黑斑病的抗性水平。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種用于甘薯黑斑病抗性鑒定中的黑斑病菌培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括如下步驟：

(1)病原菌分離和純化：從田間采集黑斑病發(fā)病薯塊，通過組織分離法分離黑斑病菌，分離時(shí)洗去薯塊表面泥土，并用75％酒精進(jìn)行表面消毒，在超凈工作臺(tái)上將病斑表皮去除，取病斑部并切成小塊接種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)分離純化和柯赫氏法驗(yàn)證確定為黑斑病菌；

(2)甘薯液體培養(yǎng)基制備：將2g薯塊(薯塊顏色為白色最佳)，加水煮沸并攪拌，使薯塊徹底勻漿在溶液中，紗布過濾，將濾液高壓滅菌；

(3)黑斑病菌的培養(yǎng)和孢子懸浮液制備：將分離純化的黑斑病菌接入甘薯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24h，紗布過濾去除菌絲后，在轉(zhuǎn)速為4000-6000rpm的離心機(jī)中離心5min，之后用無菌水懸浮獲得孢子懸浮液，并將其OD₆₀₀調(diào)至1.0。

本發(fā)明的有益效果是：

1、利用甘薯液體培養(yǎng)基對(duì)分離純化的甘薯黑斑病菌進(jìn)行活化、擴(kuò)大培養(yǎng)，極大地縮短了黑斑病菌的增殖時(shí)間，且不易污染。

2、該鑒定方法科學(xué)，結(jié)果準(zhǔn)確，過程簡(jiǎn)單易于操作。

附圖說明

圖1是本發(fā)明利用薯片培養(yǎng)黑斑病菌分生孢子示意圖；

圖2是本發(fā)明黑斑病菌孢子懸浮液的制備過程示意圖；

具體實(shí)施方式

下面將描述本發(fā)明的具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，可以以各種形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明而不應(yīng)被這里闡述的實(shí)施例所限制。相反，提供這些實(shí)施例是為了能夠更透徹地理解本發(fā)明，并且能夠?qū)⒈景l(fā)明的范圍完整的傳達(dá)給本領(lǐng)域的技術(shù)人員。

如在通篇說明書及權(quán)利要求當(dāng)中所提及的“包含”或“包括”為一開放式用語，故應(yīng)解釋成“包含但不限定于”。說明書后續(xù)描述為實(shí)施本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，然所述描述乃以說明書的一般原則為目的，并非用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視所附權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。

申請(qǐng)人通過本發(fā)明方法和傳統(tǒng)的薯片法培養(yǎng)黑斑病菌進(jìn)行對(duì)比，來說明本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。具體如下：

實(shí)施例

實(shí)施例中對(duì)照組是采用薯片法培養(yǎng)黑斑病菌，實(shí)驗(yàn)組采用本發(fā)明方法培養(yǎng)黑斑病菌。具體實(shí)驗(yàn)過程如下：

(1)病原菌分離和純化：從田間采集黑斑病發(fā)病薯塊，通過組織分離法分離黑斑病菌。分離時(shí)洗去薯塊表面泥土，并用75％酒精進(jìn)行表面消毒，在超凈工作臺(tái)上將病斑表皮去除，取病斑部并切成小塊。

A:對(duì)照組將病斑部放入容器內(nèi)搗碎，加適量水兌成黑斑病孢子懸浮溶液。

B:實(shí)驗(yàn)組將病斑部接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板上培養(yǎng)，經(jīng)分離純化和柯赫氏法則驗(yàn)證確定是黑斑病菌。

(2)黑斑病菌的培養(yǎng)和孢子懸浮液制備：

A:對(duì)照組選擇無病斑薯塊洗凈切成厚約1cm的薯片，大小以薯塊大小定，把切好的薯片放入配好的孢子懸浮液內(nèi)浸一下，取出薯片晾干表面水分，再放入準(zhǔn)備好的經(jīng)消毒過的10cm直徑的培養(yǎng)皿內(nèi)(培養(yǎng)皿內(nèi)墊有保濕紙)，蓋上培養(yǎng)皿，在25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保持相對(duì)濕度95％以上培養(yǎng)至薯片表面長(zhǎng)滿淺灰色的分生孢子，約5-6d(見圖1)。待薯片長(zhǎng)滿灰白色的分生孢子后，用無菌水沖洗，配成濃孢子懸浮液備用。將濃孢子懸浮液稀釋為1×10⁷個(gè)孢子/ml(或顯微鏡160倍下每視野40-60個(gè)孢子)的懸浮液備用。

B:實(shí)驗(yàn)組取2g薯塊(薯塊顏色白色為宜)，加水煮沸并攪拌，使薯塊徹底勻漿在溶液中，紗布過濾，將濾液高壓滅菌制備甘薯液體培養(yǎng)基。將分離純化的黑斑病菌接入甘薯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24h，紗布過濾去除菌絲后，6000rpm離心5分鐘，之后用無菌水懸浮獲得孢子懸浮液(見圖2)，并將其OD₆₀₀調(diào)至1.0。

(3)參試薯塊準(zhǔn)備：以徐薯18為對(duì)照品種，寧6-10、寧29-8、寧28-4、寧6-8、寧104-2、寧26-2、徐紫薯5號(hào)和徐薯33為實(shí)驗(yàn)品種(系)，各選取3塊中等大小、表面光滑、無傷爛的薯塊，清洗晾干后75％酒精消毒晾干，編號(hào)待用。

(4)病原菌接種與薯塊處理：采用針刺接種法接種，用醫(yī)用注射針頭蘸取配好的菌液，穿刺測(cè)試的薯塊進(jìn)行接種，每個(gè)薯塊接種15個(gè)點(diǎn)(注意：每針刺1次，針頭需蘸取菌液)，深度0.5cm。接種后的薯塊裝入消毒的塑料箱中，加蓋消毒紗布，置于25-28℃的恒溫室中，每天上午、下午各用溫水澆濕覆蓋紗布一次進(jìn)行保濕。

(5)發(fā)病情況調(diào)查：接種10d后，切開薯塊測(cè)量病斑直徑和深度，計(jì)算平均病斑直徑和平均深度，與對(duì)照品種相比判定抗性(注意：與本箱對(duì)照相比)?？共”憩F(xiàn)百分率按以下公式計(jì)算：

抗病表現(xiàn)百分率單位為％，精確到0.1％。

根據(jù)抗病表現(xiàn)百分率將甘薯黑斑病抗性分為五級(jí)，具體見表1。

表1 抗病性分級(jí)情況

選用不同的甘薯品種(系)進(jìn)行對(duì)比，對(duì)比結(jié)果見表2。對(duì)表2的對(duì)比結(jié)果可以看出，本發(fā)明培養(yǎng)方法使用本發(fā)明方法培養(yǎng)黑斑病菌與薯片法培養(yǎng)黑斑病菌在甘薯黑斑病抗性鑒定結(jié)果上基本一致，但使用本發(fā)明方法培養(yǎng)黑斑病菌過程更簡(jiǎn)單、易于操作，能極大地縮短黑斑病菌的增殖時(shí)間，并且病原菌不易被污染，可以有效避免因薯片法病原菌培養(yǎng)的薯片易腐爛、雜菌多、時(shí)間長(zhǎng)等引起的誤差，使甘薯黑斑病抗性鑒定更為精準(zhǔn)高效。

以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。