專利名稱：一種大白菜種質(zhì)抗黑斑病的快速鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為園藝作物抗病育種領(lǐng)域，具體涉及一種大白菜種質(zhì)抗黑斑病的快速鑒定方法。
背景技術(shù)：
大白菜黑斑病由鏈格孢屬真菌引起，包括蕓薹鏈格孢Alternaria brassicae，甘藍鏈格孢A.brassicicola和蘿卜鏈格孢A. japonica 3個種。大白菜黑斑病是經(jīng)常發(fā)生的一種病害，分布普遍，在我國和世界范圍內(nèi)都有發(fā)生。早在上世紀40年代，白菜黑斑病在我國分布已較普遍，但對生長影響不大，70年代后期在我國該病的發(fā)生開始日趨嚴重，已成為大白菜主要病害之一，在流行年可造成20% 40%的減產(chǎn)，武漢是受其危害較重的地區(qū)。 而生態(tài)防治與化學(xué)防治效果并不理想，培育抗病品種才是防治大白菜黑斑病的最安全、經(jīng)濟、有效的途徑。我國對大白菜黑斑病做了比較多的研究，李柱剛等Q000)對大白菜黑斑病的鑒別寄主進行了篩選研究，篩選出了 5個鑒別寄主，崔崇士等0000)將黑斑病劃分為5個致病型，楊廣東等(2000)、劉煥然等(1998)、張鳳蘭(1997)對大白菜黑斑病的抗性遺傳規(guī)律作了研究，認為大白菜對黑斑病的抗性為顯性，并受單個基因控制。人們對大白菜的黑斑病的室內(nèi)離體接種鑒定技術(shù)也進行了研究，室內(nèi)接種技術(shù)一般利用黑斑病孢子懸浮液對離體材料進行接種，有噴霧法和點滴法兩種。一般認為點滴法的適合接種濃度為1200個抱子/ ml (李明遠，1998)，噴霧法的適合接種濃度要高一些。接種方法采用點滴孢子懸浮液法有以下缺點一株株手工點滴接種，費工、效率低；由于是根據(jù)單斑進行鑒定，因而鑒定結(jié)果不夠準確；水珠容易滾落，不能保證較高的發(fā)病率。采用噴霧接種法接種的優(yōu)點是由于成片噴霧接種，因而快速、省工、簡便易行；根據(jù)多斑進行鑒定，提高了鑒定結(jié)果的可靠性； 噴霧均勻，可達到很高的發(fā)病率。本研究未進行接種方法鑒定，直接采用孢子懸浮液噴霧接種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種大白菜種質(zhì)抗黑斑病的快速鑒定方法，與大田成株期接種相比， 避免了氣候條件不適宜、環(huán)境中病蟲害等因素的影響，苗期在室內(nèi)進行抗病性篩選則條件較易控制，鑒定周期短、速度快，能節(jié)省大量人力物力；確定了適宜的黑斑病懸浮液濃度、大白菜抗病性篩選苗齡。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是(1)供試材料準備供試的黑斑病菌種為蕓薹鏈格孢Alternaria brassicae，菌種接種前用碳源減半 PDA培養(yǎng)基加入過濾滅菌后的白菜汁進行產(chǎn)孢培養(yǎng)備用；將供試的大白菜種子播種在裝有滅菌基質(zhì)的花盆(8cm*8cm)內(nèi)，出苗后每盆留1_3株；(2)接種
用孢子懸浮液噴霧接種，接種后將供試植株放入塑料盒內(nèi)，用保鮮膜保濕Mh。 每供試材料設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)30株苗，以清水為對照，設(shè)置1. OX 103、1. OX 104、 1.0X105、l. OX Kfpfu/mL四種接種濃度的孢子懸浮液和3-4、5_6、7_8葉期三種苗齡，在 25-30°C條件下誘導(dǎo)發(fā)病，置于光照培養(yǎng)室中，接種后第7d、第IOd與第14d調(diào)查病情指數(shù)；(3)病情指數(shù)分級病情指數(shù)分級以葉片為單位，按0-9級標準進行發(fā)病程度調(diào)查。病情分級標準0 級無癥；1級接種葉生褐色小點，無退綠斑；3級接種葉生2mm以下的退綠斑，無霉層；5 級接種葉生2mm以上的退綠斑，有極少霉層，病斑不連成片；7級接種葉生4mm以上的退綠斑，有較多的霉層，病斑連成片以下；9級接種葉病斑連成片，大面積枯死，霉層明顯。所述的光照培養(yǎng)室內(nèi)溫度優(yōu)化為；所述的黑斑病孢子懸浮液濃度優(yōu)選為 1.0X104pfu/mL或者1. OX l(fpfU/mL ；所述的黑斑病孢子懸浮液噴霧接種于大白菜為5 6葉期幼苗，10天后調(diào)查病情。本發(fā)明取得的有益效果1、按步驟進行鑒定的方法與大田成株期接種相比，避免了氣候條件不適宜、環(huán)境中病蟲害等因素的影響，苗期在室內(nèi)進行抗病性篩選則條件較易控制，鑒定周期短、速度快，能節(jié)省大量人力物力。2、確定了適宜的黑斑病懸浮液濃度，該方法確定1. OX lOYfu/mL或者 1.0X105pfu/mL的黑斑病孢子懸浮液最為適宜。3、確定了適宜的大白菜抗病性篩選苗齡，該方法確定5 6葉期進行抗病性篩選最為適宜。


圖1為不同接種濃度對抗病性的影響示意2不同接種苗齡對抗病性的影響示意圖下面對本發(fā)明作一詳細說明
實施例1.1供試材料供試的黑斑病菌種為蕓薹鏈格孢Alternaria brassicae，菌種接種前用碳源減半 PDA培養(yǎng)基加入過濾滅菌后的白菜汁進行產(chǎn)孢培養(yǎng)備用；將供試的大白菜種子播種在裝有滅菌基質(zhì)的花盆(8cm*8cm)內(nèi)，出苗后每盆留1_3株；1.2接種方法采用孢子懸浮液噴霧接種，接種后將供試植株放入塑料盒內(nèi)，用保鮮膜保濕Mh。 每供試材料設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)30株苗，以清水為對照，設(shè)置1. OX 103、1. OX 104、 1.0X105、l. OX Kfpfu/mL四種接種濃度的孢子懸浮液和3-4、5_6、7_8葉期三種苗齡，在 25-30°C條件下誘導(dǎo)發(fā)病，置于光照培養(yǎng)室中，接種后第7d、第IOd與第14d調(diào)查病情指數(shù)。1. 3病情指數(shù)分級病情指數(shù)分級以葉片為單位，按0-9級標準進行發(fā)病程度調(diào)查。病情分級標準0 級無癥；1級接種葉生褐色小點，無退綠斑；3級接種葉生2mm以下的退綠斑，無霉層；5 級接種葉生2mm以上的退綠斑，有極少霉層，病斑不連成片；7級接種葉生4mm以上的退綠斑，有較多的霉層，病斑連成片以下；9級接種葉病斑連成片，大面積枯死，霉層明顯。1. 4數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSSl 1. 5 (LSD，ρ < 0. 05)進行統(tǒng)計分析處理，采用Microsoft Office Excel 2003 進行制圖。2結(jié)果與分析2. 1不同接種濃度對抗病性的影響從圖1可以看出，以1.0Xl(fpfu/mL接種，由于接種濃度低感病材料發(fā)病重、 抗病材料發(fā)病輕，1. 0X104pfu/mL和1. 0X 105pfu/mL接種，六個材料發(fā)病均有差異；以 1.0X Kfpfu/mL接種時，六個材料發(fā)病無差異，且濃度高發(fā)病快，第10天調(diào)查已經(jīng)發(fā)病很重了。2. 2不同接種苗齡對抗病性的影響如圖2所示，3 4葉期苗齡時，四種材料發(fā)病程度都比較重，病情指數(shù)值高。5 6葉期苗齡時，六個材料發(fā)病均有差異；苗齡大后抗性較好，7 8葉期六個材料間發(fā)病無差已升。3、結(jié)論研究結(jié)果表明，在光照培養(yǎng)室內(nèi)(25 30°C)，選擇濃度為l.OXlOYfu/mL或者 1.0X105pfu/mL的黑斑病孢子懸浮液噴霧接種于大白菜5 6葉期幼苗，保濕Mh，10天后調(diào)查病情，可準確評價大白菜種植資源材料對黑斑病的抗性。
權(quán)利要求
1.一種大白菜種質(zhì)抗黑斑病的快速鑒定方法，其特征在于按以下步驟依次組成(1)供試材料準備供試的黑斑病菌種為蕓薹鏈格孢Alternaria brassicae,菌種接種前用碳源減半PDA 培養(yǎng)基加入過濾滅菌后的白菜汁進行產(chǎn)孢培養(yǎng)備用；將供試的大白菜種子播種在裝有滅菌基質(zhì)的花盆(8cm*8cm)內(nèi)，出苗后每盆留1_3株；(2)接種用孢子懸浮液噴霧接種，接種后將供試植株放入塑料盒內(nèi)，用保鮮膜保濕Mh。每供試材料設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)30株苗，以清水為對照，設(shè)置1. OX 103、1. OX 104、1. OX 105、 1. OX Kfpfu/mL四種接種濃度的孢子懸浮液和3-4、5-6、7-8葉期三種苗齡，在25_30°C條件下誘導(dǎo)發(fā)病，置于光照培養(yǎng)室中，接種后第7d、第IOd與第14d調(diào)查病情指數(shù)；(3)病情指數(shù)分級病情指數(shù)分級以葉片為單位，按0-9級標準進行發(fā)病程度調(diào)查。病情分級標準0級無癥；1級接種葉生褐色小點，無退綠斑；3級接種葉生2mm以下的退綠斑，無霉層；5級接種葉生2mm以上的退綠斑，有極少霉層，病斑不連成片；7級接種葉生4mm以上的退綠斑， 有較多的霉層，病斑連成片以下；9級接種葉病斑連成片，大面積枯死，霉層明顯。
2.如權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于所述的光照培養(yǎng)室內(nèi)溫度優(yōu)化為大概 26-28 0C ；
3.如權(quán)利要求1或2所述的鑒定方法，其特征在于所述的黑斑病孢子懸浮液濃度優(yōu)選為 1. OX l(^pfu/mL 或者 1. OX 105pfu/mL ；
4.如權(quán)利要求1或2所述的鑒定方法，其特征在于所述的黑斑病孢子懸浮液噴霧接種于大白菜為5 6葉期幼苗，約10天后調(diào)查病情。
全文摘要
本發(fā)明提供一種大白菜種質(zhì)抗黑斑病的快速鑒定方法，其特征在于按以下步驟依次組成(1)供試材料準備、(2)接種和(3)病情指數(shù)分級，確定了適宜的黑斑病懸浮液濃度、大白菜抗病性篩選苗齡，與大田成株期接種相比，避免了氣候條件不適宜、環(huán)境中病蟲害等因素的影響，苗期在室內(nèi)進行抗病性篩選則條件較易控制，鑒定周期短、速度快，能節(jié)省大量人力物力。
文檔編號A01G7/06GK102239779SQ20111006543
公開日2011年11月16日 申請日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者丁自立, 何云啟, 崔磊, 張興中, 梅時勇, 梅雪飛, 王晴芳, 甘彩霞, 高翔, 黃來春 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所