一株具有乙酸乙酯降解能力的綠色木霉菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株具有乙酸乙酯降解能力 的綠色木霉菌（Trichoderma viride)LW_l，及其在降解乙酸乙醋、苯、甲苯、氯苯、α-薇稀 或二氯甲烷中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙酸乙酯（分子式：CH3CO2CH2CH 3)是一種常見的有機溶劑，在印刷、膠粘劑等生產(chǎn) 企業(yè)和工業(yè)過程中廣泛使用。乙酸乙酯揮發(fā)性強，對眼睛、皮膚、粘膜和上呼吸道有刺激性， 長時間接觸對人有麻醉作用，可致頭暈和頭痛。因此尋找有效防治乙酸乙酯污染的對策刻 不容緩，對人類健康和環(huán)境保護具有重大意義。
[0003] 生物法處理乙酸乙酯污染以其簡單高效、能耗低、費用低、無二次污染等特點越來 越受到重視。與以細菌為核心的生物工藝相比，絲狀真菌由于所產(chǎn)生的菌絲體容易捕捉氣 相中的疏水性污染物，同時又具備耐低PH值和適應(yīng)干燥環(huán)境等特性，日益成為VOCs生物過 濾技術(shù)中新的研宄熱點。大量研宄表明從環(huán)境中分離篩選高效降解乙酸乙酯等VOCs的真 菌，仍然是消除環(huán)境中該類污染物的重要方法之一。
[0004] 木霉菌屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目，粘孢菌類，是一類普遍存在的真菌。綠色 木霉在自然界分布廣泛，常腐生于木材、種子及植物殘體上。綠色木霉能產(chǎn)生多種具有生物 活性的酶系，如：纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、木聚糖酶等，目前主要用于植物病理生物防治中。
[0005] 專利號為200810027399. 7,專利名稱為"綠色木霉Hl在降解甲醛中的應(yīng)用"的中 國專利中公開了一種綠色木霉Hl在降解甲醛中的應(yīng)用同時提供了綠色木霉Hl在降解甲醛 的應(yīng)用中的相關(guān)數(shù)據(jù)。但在該專利中報道了該綠色木霉只能降解甲醛或者在其他常見碳源 (葡萄糖、蔗糖等）存在的條件下降解甲醛，對于其他工業(yè)常見的污染物是否具有降解能力 并未提及。本發(fā)明提及的乙酸乙酯和甲醛屬于兩類物質(zhì)，結(jié)構(gòu)迥異，降解甲醛的綠色木霉無 法降解乙酸乙酯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足而提供一種高效、耐受能力 強的具有乙酸乙酯降解能力的綠色木霉菌及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是：該具有乙酸乙酯降解能力的綠色木 霉菌（Trichoderma viride)LW-l，其保藏編號為CCTCC N0:M2014176。保藏于中國典型培 養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學，430072,保藏日期：2014年5月3日。
[0008] 本發(fā)明所述的具有乙酸乙醋降解能力的綠色木霉菌（Trichoderma viride)LW_l， 其菌落特征為子座為半球形、扁碟狀或盾狀，直徑1. 5-7_，表面綠色，內(nèi)部近白色。
[0009] 本發(fā)明所述的具有乙酸乙醋降解能力的綠色木霉菌（Trichoderma viride)LW_l 在降解乙酸乙酯、苯、甲苯、氯苯、α-蒎烯或二氯甲烷中的應(yīng)用。該菌株LW-I能降解初始 濃度0?600mg/L的乙酸乙酯，最終降解產(chǎn)物為C0 2、H2O和細胞生物量，其去除率大約為 100%，即可以完全降解乙酸乙酯。該降解菌的發(fā)現(xiàn)對工業(yè)廢氣中乙酸乙酯的高效凈化具有 重要意義。該菌株LW-I還可降解其他工業(yè)常見有機污染物，尤其是苯、甲苯、1-氯苯、二氯 甲燒等。
[0010] 本發(fā)明所述的對工業(yè)常見有機污染物的降解優(yōu)選在30°C、pH = 4. 87條件下進行。 上述條件下降解的好處是綠色木霉活性較大，能在較短時間內(nèi)完全利用乙酸乙酯等工業(yè)常 見的污染物。
[0011] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：本發(fā)明中的綠色木霉（Trichoderma viride)LW-I取自廢水處理單元，對于VOCs類有機污染物，尤其是乙酸乙酯具有較好地降 解效果，可以較為完全地把乙酸乙酯轉(zhuǎn)化為C0 2、H20、細胞生物量等無害物質(zhì)；同時，該菌株 也能不同程度地降解苯、甲苯、氯苯等工業(yè)常見的污染物，因而在工業(yè)廢氣廢水的生物凈化 中具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0012] 本發(fā)明所述的綠色木霉能將乙酸乙酯完全降解為無機物（H20和C02)和細胞生物 質(zhì)，實現(xiàn)完全礦化，且對于乙酸乙酯的耐受濃度高達600mg/L。因此，該綠色木霉對于工業(yè)常 見污染物（如乙酸乙酯等）具有高效的降解能力，且能承受較高濃度的污染物。
【附圖說明】
[0013] 圖1為綠色木霉（Trichoderma viride) LW-I的乳酸酷棉蘭染色照片。
[0014] 圖2為綠色木霉（Trichoderma viride) LW-I在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)照片。
[0015] 圖3為綠色木霉（Trichoderma viride)LW-I的系統(tǒng)發(fā)育樹圖。
[0016] 圖4為綠色木霉（Trichoderma viride)LW-I在不同初始濃度的乙酸乙醋條件下 的降解效果圖。
[0017] 圖5為綠色木霉（Trichoderma viride) LW-I在不同pH條件下對乙酸乙醋的降解 效果圖。
[0018] 圖6為綠色木霉（Trichoderma viride) LW-I在不同pH條件下的生物量變化。
[0019]
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此，下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0021] 實施例1 :綠色木霉（Trichoderma viride)LW-I的分離、純化及其鑒定。
[0022] L 綠色木霉（Trichoderma viride)LW-1 的分離及純化。
[0023] 綠色木霉（Trichoderma viride)LW-I是從浙江杭州市某污水處理廠曝氣池中的 活性污泥中馴化、分離得到的一株真菌。具體步驟如下：取浙江杭州市某污水處理廠曝氣 池中的活性污泥。自來水淘洗五次后，空曝48h，盡量去除殘留的有機物。配制無機鹽培養(yǎng) 液，以乙酸乙酯為唯一碳源對活性污泥進行定向馴化，每3d更換新鮮無機鹽培養(yǎng)液，40d左 右即可分離。
[0024] 配制乙酸乙醋初始濃度為50mg/L無機鹽培養(yǎng)基，配制方法如下：KH2PO 4O. 45g， Na2HPO4O. 47g，（NH4)2S042. 0g，MgSO4 · 7H20 0· 5g，無水 CaCl2O. 01g，微量元素（MnSO4 · H2O 0· 001g，ZnSO4 · 7H20 0· 001g，F(xiàn)eSO4O. 001g，CuSO4 · 5Η200· OOlg)，蒸餾水，IOOOmL ;pH = 3 ? 6,分裝于250mL的密封鹽水瓶（50mL/個），110°C滅菌40min。
[0025] 從馴化瓶中取50ml上清液進行離心，將沉淀下來的污泥加入到裝有50ml的無機 鹽培養(yǎng)基（已滅菌）的鹽水瓶中，并且添加鏈霉素〇. 〇〇3g，慶大霉素0. 001g。蓋上瓶塞后 加入乙酸乙酯（濃度為50mg/L)。放置在30°C，160rpm的搖床中培養(yǎng)。隔一段時間觀察鹽 水瓶中菌體生長情況，之后在已降解完全的鹽水瓶中取5mL菌懸液到裝有新鮮的50mL的無 機鹽培養(yǎng)基的瓶中，仍添加鏈霉素〇. 〇〇3g，慶大霉素0. 001g。蓋上瓶塞后加入乙酸乙酯（濃 度為100mg/L)。將培養(yǎng)瓶置于30°C，160rpm的搖床中培養(yǎng)。培養(yǎng)一定時間后，再取5ml菌 懸液到裝有新鮮的50ml的無機鹽培養(yǎng)基的瓶中，添加鏈霉素0. 003g，慶大霉素0. 001g。蓋 上瓶塞后加入乙酸乙酯（濃度為200mg/L)。置于搖床中培養(yǎng)。
[0026] 取2ml混合菌液，涂布于含有乙酸乙酯的固體無機鹽培養(yǎng)基上，連續(xù)劃線分離， 最終獲得純化菌株，接種到PDA斜面培養(yǎng)基中，在4°C的冰箱中保存。
[0027] 2.綠色木霉（Trichoderma viride) LW-1 的鑒定。
[0028] 通過真菌ITS序列分析，確定菌株為綠色木霉（Trichoderma viride)。具體步驟 如下：PCR擴增反應(yīng)體系見表1，PCR擴增的反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s， 55°C退火 30s，72°C延伸 40s，循環(huán) 32 次；72°C延伸 10min，10°C保存。
[0029] 表I :ITS序列PCR擴增反應(yīng)體系
【主權(quán)項】
1. 一株具有乙酸乙醋降解能力的綠色木霉菌（7>icAoofe/ma n>i￡/e)LW-l，其保藏編號 為 CCTCC NO: M2014176。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有乙酸乙醋降解能力的綠色木霉菌（ w>iife)LW-l，其特征在于：其菌落特征為子座為半球形、扁碟狀或盾狀，直徑I. 5-7mm，表 面綠色，內(nèi)部近白色。
3. 權(quán)利要求1所述的具有乙酸乙醋降解能力的綠色木霉菌（ririofe) LW-I在降解乙酸乙醋、苯、甲苯、氯苯、α-蒎烯或二氯甲烷中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的降解在30°C、pH= 4. 87條件下進 行。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有乙酸乙酯降解能力的綠色木霉菌(<i>Trichoderma</i><i>？viride</i>)LW-1，其保藏編號為CCTCC？NO:？M2014176。以及該綠色木霉菌(<i>Trichoderma</i><i>？viride</i>)LW-1在降解乙酸乙酯、苯、甲苯、氯苯、α-蒎烯或二氯甲烷中的應(yīng)用。本發(fā)明對目標污染物高效降解、耐受能力強。CCTCC NO：M201417620140503
【IPC分類】C02F101-34, C02F101-32, C02F101-36, B01D53-84, C02F3-34, C12N1-14, B01D53-72, C12R1-885
【公開號】CN104560728
【申請?zhí)枴緾N201410813740
【發(fā)明人】成卓韋, 陳建孟, 於建明, 陸李超
【申請人】浙江工業(yè)大學
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月24日