一種乙?；制ぼ蘸铣晌锛霸诔晒羌?xì)胞增殖中的醫(yī)用用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種乙?；制ぼ蘸铣晌?NGA)，本發(fā)明還進(jìn)一步提供了該化合物在小鼠成骨細(xì)胞增殖中的應(yīng)用，提供了一種柚皮苷新產(chǎn)物NGA，以天然產(chǎn)物柚皮苷為底物酶促乙?；铣傻男禄衔铮軌蝻@著促進(jìn)小鼠正常成骨細(xì)胞和經(jīng)TNF?α誘導(dǎo)損傷的成骨細(xì)胞增殖，可以制備促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖藥物；本發(fā)明合成工藝比較簡(jiǎn)單，成本較低，有利于工業(yè)化成產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】
一種乙?；制ぼ蘸铣晌锛霸诔晒羌?xì)胞増殖中的醫(yī)用用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明公開(kāi)了一種乙?；制ぼ蘸铣晌?NGA)，本發(fā)明還進(jìn)一步提供了該化合物 在小鼠成骨細(xì)胞增殖中的應(yīng)用，屬于涉及酶合成和醫(yī)藥應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨代謝是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，該平衡的失調(diào)將引發(fā)骨代謝性疾 病。牙周炎是最常見(jiàn)和多發(fā)的口腔骨代謝疾病，我國(guó)大部分人患有各種牙周炎，且呈現(xiàn)逐年 上升的趨勢(shì)，牙周炎主要的病理改變是牙周袋形成和牙槽骨吸收，導(dǎo)致牙松動(dòng)甚至脫落。長(zhǎng) 期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直致力于研究牙槽骨再生和重建方法，然而這些方法雖有一定的應(yīng) 用價(jià)值和前景，但是各自都存在著一定的缺憾。至今，臨床上不能根治牙周炎的主要原因之 一是無(wú)效果良好的阻斷牙槽骨吸收或促進(jìn)牙槽骨再生的藥物，因此尋求一種既費(fèi)用經(jīng)濟(jì)、 療效顯著而又安全無(wú)明顯毒副作用的治療方法十分緊迫。
[0003] 中醫(yī)認(rèn)為骨碎補(bǔ)有明顯鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用，并可刺激成骨細(xì)胞代償性增生，改善成 骨細(xì)胞功能，推遲其退行性病變。李順祥等報(bào)道指出柚皮苷(Naringin，NG)為骨碎補(bǔ)的主要 有效成分，大量存在于柚、葡萄柚和酸橙及其變種的果皮及果實(shí)中，屬于二氫黃酮甙類，黃 酮貳的甙元，為黃酮類化合物，藥理作用廣泛，具有促進(jìn)骨細(xì)胞增殖和分化、抗過(guò)敏、抗炎、 抗氧化、降血脂、抑癌等多種藥理活性，藥典規(guī)定其含量不少于0.5%。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在大量的 臨床實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)柚皮苷能促進(jìn)小鼠 MC3T3-E1細(xì)胞、小鼠原代培養(yǎng)成骨細(xì)胞、人原代培養(yǎng)成 骨細(xì)胞和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等多種成骨細(xì)胞的增殖和分化，且對(duì)牙周炎等骨代謝疾病的 防治和治療有確實(shí)療效。但柚皮苷分子中存在多個(gè)酚羥基，脂溶性差，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，限 制了其生物療效的發(fā)揮。于人體功效方面，柚皮苷不易透過(guò)雙脂層脂質(zhì)細(xì)胞膜，難以到達(dá)靶 向作用點(diǎn)而大大降低其應(yīng)有的藥物效果。本發(fā)明涉及一種乙?；制ぼ蘸铣晌?，通過(guò)改變 其分子結(jié)構(gòu)，有效的提高柚皮苷對(duì)骨代謝疾病的防治療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明公開(kāi)一種乙?；制ぼ蘸铣晌?縮寫(xiě):NGA)，是一種以天然產(chǎn)物柚皮苷為底 物酶促乙酰化合成的新化合物，能夠顯著促進(jìn)小鼠正常成骨細(xì)胞和經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)損傷的成 骨細(xì)胞增殖。
[0005] 本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種酶促乙?；制ぼ蘸铣晌锏闹苽浞椒?，適用于工業(yè)化大 規(guī)模生產(chǎn)。
[0006] 本發(fā)明還提供NGA在促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞增殖的醫(yī)用用途，一定濃度的NGA對(duì)小鼠正 常成骨細(xì)胞和經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)損傷的成骨細(xì)胞的增殖具有顯著的促進(jìn)作用。
[0007] 本發(fā)明所述的一種酶促乙酰化柚皮苷合成物(NGA)，具有以下結(jié)構(gòu)式：
其化學(xué)名稱為:NGA;分子式為:C29H34〇i5;相對(duì)分子量為:622.19，核磁鑒定圖譜如圖1、 圖2所示。
[0008] 本發(fā)明所述的一種乙?；制ぼ蘸铣晌锏暮铣煞椒?，包括以下步驟： 將0.05-0.4mmol的柚皮苷溶于20mL丙酮溶液中；再加入2-4mmol的乙酸乙稀酯，混合均 勾后，另加入8〇-120mg CSL( 1 ipase from Candida sp)或Novozym 435 (immobilized lipase B from Candida antarctica)酶，放置于30°C，100rpm恒溫?fù)u床中，保持水活度 0.60，反應(yīng)24h;反應(yīng)結(jié)束時(shí)將酶過(guò)濾終止反應(yīng)并將溶劑旋轉(zhuǎn)濃縮。
[0009] 本發(fā)明所述的一種乙?；制ぼ蘸铣晌锏暮铣煞椒ǎ罴阎苽涔に嚾缦拢?柚皮苷和乙酸乙烯酯的摩爾比為〇. 05:2-0.2:3，反應(yīng)溶劑為20mL丙酮溶液;混合均勻 后，另加入80-120mg CSL或Novozym 435酶，置于30°C，100rpm恒溫?fù)u床中，保持水活度 0.60，反應(yīng)24h;反應(yīng)結(jié)束時(shí)將酶過(guò)濾終止反應(yīng)并將溶劑旋轉(zhuǎn)濃縮。
[0010] 本發(fā)明所述的一種乙酰化柚皮苷合成物在制備促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖藥物中的用途。
[0011] 本發(fā)明化合物作為藥效活性成分能夠顯著的促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞的增殖，和未修飾 的柚皮苷母體相比，對(duì)正常成骨細(xì)胞的增殖，相比提高了 1.5-2.8倍;對(duì)經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)損傷的 成骨細(xì)胞的增殖，相比提高了 2.5-3.6倍。
[0012] 通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的乙?；制ぼ蘸铣晌锬軌蝻@著的促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞 增殖 首先建立小鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)體系，通過(guò)柚皮苷和乙?；制ぼ諏?duì)正常成骨細(xì)胞及經(jīng) TNF-a誘導(dǎo)損傷成骨細(xì)胞刺激作用，以觀察對(duì)比柚皮苷和乙?；制ぼ諏?duì)成骨細(xì)胞增殖的 影響，為乙?；制ぼ赵诔晒菗p傷組織修復(fù)應(yīng)用上提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。因此，選用相同濃度梯度 的柚皮苷和乙酰化柚皮苷對(duì)小鼠正常成骨細(xì)胞及經(jīng)TNF-a誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，探索 柚皮苷和乙酰化柚皮苷對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖的影響。
[0013] 從實(shí)驗(yàn)MTT法結(jié)果中可以看出：低濃度組對(duì)成骨細(xì)胞的增值無(wú)明顯促進(jìn)作用。中濃 度的柚皮苷和乙?；制ぼ諏?duì)正常成骨細(xì)胞以及經(jīng)TNF-a誘導(dǎo)損傷的成骨細(xì)胞增殖都具有 促進(jìn)作用，且乙?；制ぼ盏拇龠M(jìn)作用更顯著。高濃度組僅與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比有顯著性差 異。在正常成骨細(xì)胞MTT法結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，lOμg/ml的柚皮苷和乙?；制ぼ諏?duì)正常成骨細(xì)胞 的具有促進(jìn)作用，且和柚皮苷相比，乙酰化柚皮苷對(duì)正常成骨細(xì)胞的促進(jìn)作用提高了 1.5-2.6倍。在經(jīng)TTNF-a誘導(dǎo)損傷的成骨細(xì)胞增殖結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，20μg/ml的柚皮苷和乙?；制?苷對(duì)經(jīng)TTNF-a誘導(dǎo)損傷的成骨細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，且和柚皮苷相比，乙?；制ぼ諏?duì) 經(jīng)TTNF-α誘導(dǎo)損傷的成骨細(xì)胞促進(jìn)作用提高了 2.5-3.8倍?？梢?jiàn)，經(jīng)酶促合成的乙酰化柚皮 苷對(duì)正常成骨細(xì)胞和經(jīng)TTNF-α誘導(dǎo)損傷的成骨細(xì)胞的促進(jìn)作用都顯著提高，分析原因可能 是由于柚皮苷分子結(jié)構(gòu)的改變，增加了其通過(guò)磷脂雙分子層細(xì)胞的能力，更好的發(fā)揮了體 內(nèi)生物活性作用。
[0014] 本發(fā)明的積極效果在于:提供了一種柚皮苷新產(chǎn)物NGA，以天然產(chǎn)物柚皮苷為底物 酶促乙?；铣傻男禄衔?，能夠顯著促進(jìn)小鼠正常成骨細(xì)胞和經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)損傷的成骨 細(xì)胞增殖，可以制備促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖藥物;本發(fā)明合成工藝比較簡(jiǎn)單，成本較低，有利于 工業(yè)化成產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1、圖2為本發(fā)明NGA的核磁鑒定圖譜； 圖3為本發(fā)明NGA和NG對(duì)小鼠正常成骨細(xì)胞的增殖作用對(duì)比； 圖4為本發(fā)明NGA和NG對(duì)經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)損傷的小鼠成骨細(xì)胞增殖作用對(duì)比。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步具體說(shuō)明，但本發(fā)明的范圍不限于以下實(shí)施例。 [0017] 實(shí)施例！ 稱取0.05mmol柚皮苷溶于20mL丙酮溶液中，加入2mmo 1乙酸乙稀酯，混合均勾后，另加 入80mg CSL酶，放置于30° C，lOOrpm恒溫?fù)u床中，保持水活度0.60，反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束時(shí)將 酶過(guò)濾終止反應(yīng)并將溶劑旋轉(zhuǎn)濃縮。利用HPLC分離純化反應(yīng)產(chǎn)物，分離條件為:Thermo C18 (4.6 mmX250 mm Χ5μηι，Agilent, USA)色譜柱；流動(dòng)相是水(A)和甲醇（13)，〇-5111；[1140-80%(B)，5-15min維持80%(B)，15-20min 80-40%(B);流速1 ·0 ml/min。柱溫30°C，進(jìn)樣量為 10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，乙?；制ぼ盏谋Ａ魰r(shí)間分別為10.8 min，收率為89.0%。經(jīng)核 磁共振譜儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定反應(yīng)合成的該物質(zhì)為目標(biāo)產(chǎn)物NGA，分子式為： C29H34O15;相對(duì)分子量為:622.19。
[0018] 實(shí)施例2 稱取0.2mmol柚皮苷溶于20mL丙酮溶液中，加入4mmol乙酸乙稀酯，混合均勾后，另加入 100mg CSL酶，放置于30° C，lOOrpm恒溫?fù)u床中，保持水活度0.60，反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束時(shí)將酶 過(guò)濾終止反應(yīng)并將溶劑旋轉(zhuǎn)濃縮。利用HPLC分離純化反應(yīng)產(chǎn)物，分離條件為:Therm 〇 C18 (4.6 mmX250 mm Χ5μηι，Agilent, USA)色譜柱；流動(dòng)相是水(A)和甲醇（13)，〇-5111；[1140-80%(B)，5-15min維持80%(B)，15-20min 80-40%(B);流速1 ·0 ml/min。柱溫30°C，進(jìn)樣量為 10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，乙?；制ぼ盏谋Ａ魰r(shí)間分別為10.8 min，收率為92.6%。經(jīng)核 磁共振譜儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定反應(yīng)合成的該物質(zhì)為目標(biāo)產(chǎn)物NGA，分子式為： C29H34O15;相對(duì)分子量為:622.19。
[0019] 實(shí)施例3 稱取0.4mmo 1柚皮苷溶于2OmL乙腈溶液中，加入6mmo 1乙酸乙稀酯，混合均勾后，另加入 120mg CSL酶，放置于30° C，lOOrpm恒溫?fù)u床中，保持水活度0.60，反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束時(shí)將酶 過(guò)濾終止反應(yīng)并將溶劑旋轉(zhuǎn)濃縮。利用HPLC分離純化反應(yīng)產(chǎn)物，分離條件為:Therm 〇 C18 (4.6 mmX250 mmX 5μηι，Agilent，USA)色譜柱；流動(dòng)相是水（A)和甲醇（B)，0_5min 40- 80%(B)，5-15min維持80%(B)，15-20min 80-40%(B);流速1 ·0 ml/min。柱溫30°C，進(jìn)樣量為 10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，乙酰化柚皮苷的保留時(shí)間分別為10.8 min，收率為92.0%。經(jīng)核 磁共振譜儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定反應(yīng)合成的該物質(zhì)為目標(biāo)產(chǎn)物NGA，分子式為： C29H34O15;相對(duì)分子量為:622.19。
[0020] 實(shí)施例4 稱取0.2mmol柚皮苷溶于20mL丙酮溶液中，加入4mmol乙酸乙稀酯，混合均勾后，另加入 lOOmg Novozym 435酶，放置于30°C，100rpm恒溫?fù)u床中，保持水活度0.60,反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié) 束時(shí)將酶過(guò)濾終止反應(yīng)并將溶劑旋轉(zhuǎn)濃縮。利用HPLC分離純化反應(yīng)產(chǎn)物，分離條件為： Thermo C18(4.6 mmX250 mmX5ym, Agilent, USA)色譜柱;流動(dòng)相是水(A)和甲醇(B)，〇-5min 40-80%(B)，5-15min維持80%(B)，15-20min 80-40%(B);流速 1.0 ml/min。柱溫30°C， 進(jìn)樣量為10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，乙?；制ぼ盏谋Ａ魰r(shí)間分別為10.8 min，收率為 91.0%。經(jīng)核磁共振譜儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定反應(yīng)合成的該物質(zhì)為目標(biāo)產(chǎn)物NGA，分子 式為:C29H34O15;相對(duì)分子量為:622.19。
[0021] 以下試驗(yàn)表明本發(fā)明合成化合物NGA在促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞增殖方面的效果 試驗(yàn)例1對(duì)小鼠正常成骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用 (1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1至離心管內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞的濃度為5X104個(gè) 細(xì)胞/ml，每孔100 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，過(guò)夜培養(yǎng)，保證細(xì)胞狀態(tài)良好，貼壁正常； (2 )將原料NG和實(shí)施例1 -實(shí)施例4合成的化合物NGA，過(guò)濾除菌，DMEM培養(yǎng)基稀釋，作用 小鼠正常成骨細(xì)胞MC3T3-E1 48 h，每一個(gè)實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置三個(gè)重復(fù)孔； (3) 藥物作用結(jié)束后，無(wú)菌條件下加入20 μL MTT溶液，在5% C02培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)； (4) 加入150 μL DMS0溶解產(chǎn)生的藍(lán)紫色晶體，在492 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定光吸收值即0D 值； (5) 計(jì)算細(xì)胞增值率，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組取三個(gè)重復(fù)孔的平均值； 試驗(yàn)結(jié)果：與原料NG相比，使用實(shí)施例1-實(shí)施例4合成的化合物NGA處理正常成骨細(xì)胞 48 h后，對(duì)正常成骨細(xì)胞的增殖均表現(xiàn)為促進(jìn)作用。結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0022]結(jié)論:實(shí)施例1-實(shí)施例4合成的化合物NGA與NG原料相比，均可顯著促進(jìn)正常成骨 細(xì)胞的增殖，且實(shí)施例2合成的化合物NGA對(duì)正常成骨細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用最顯著，相比NG 提高了2.6倍。
[0023] 試驗(yàn)例2 本發(fā)明合成化合物NGA對(duì)經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)損傷成骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用 (1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1至離心管內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞的濃度為5X104個(gè) 細(xì)胞/ml，每孔100 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，過(guò)夜培養(yǎng)，保證細(xì)胞狀態(tài)良好，貼壁正常； (2 )將原料NG和實(shí)施例1 -實(shí)施例4合成的化合物NGA，過(guò)濾除菌，DMEM培養(yǎng)基稀釋，作用 加入TNF-a誘導(dǎo)損傷的小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1 48 h，每一個(gè)實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置三個(gè)重復(fù)孔； (3) 藥物作用結(jié)束后，無(wú)菌條件下加入20 μL MTT溶液，在5% C02培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)； (4) 加入150 μL DMS0溶解產(chǎn)生的藍(lán)紫色晶體，在492 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定光吸收值即0D 值； (5) 計(jì)算細(xì)胞增值率，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組取三個(gè)重復(fù)孔的平均值； 試驗(yàn)結(jié)果:與原料NG相比，實(shí)施例1-實(shí)施例4合成的化合物NGA處理TNF-a誘導(dǎo)損傷的成 骨細(xì)胞48 h后，對(duì)TNF-α誘導(dǎo)損傷的成骨細(xì)胞的增殖均表現(xiàn)為促進(jìn)作用。結(jié)果見(jiàn)圖4。
[0024] 結(jié)論:實(shí)施例1-實(shí)施例4合成的化合物NGA與NG原料相比，可顯著促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)損 傷的成骨細(xì)胞的增殖，且實(shí)施例2合成的化合物NGA對(duì)TNF-a誘導(dǎo)損傷的成骨細(xì)胞的增殖促 進(jìn)作用最顯著，相比NG提高了 3.8倍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種乙酷化抽皮巧合成物，具有W下結(jié)構(gòu)式：其化學(xué)名稱為:NGA;分子式為:C2訊34〇15;分子量為:622.19。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙酷化抽皮巧合成物的合成方法，包括W下步驟： 將0.05-0.4mmol的抽皮巧溶于20血丙酬溶液中；再加入2-4mmol的乙酸乙締醋，混合均 勻后，另加入80-120mg C化或Novozym 435酶，放置于30°C，100rpm恒溫?fù)u床中，保持水活度 0.60，反應(yīng)2地;反應(yīng)結(jié)束時(shí)將酶過(guò)濾終止反應(yīng)并將溶劑旋轉(zhuǎn)濃縮。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙酷化抽皮巧合成物的合成方法，最佳制備工藝如下： 抽皮巧和乙酸乙締醋的摩爾比為0.05 : 2-0.2 :3，反應(yīng)溶劑為20mL丙酬溶液;混合均勻 后，另加入80-120mg C化或Novozym 435酶，置于30°C，100巧m恒溫?fù)u床中，保持水活度 0.60，反應(yīng)2地;反應(yīng)結(jié)束時(shí)將酶過(guò)濾終止反應(yīng)并將溶劑旋轉(zhuǎn)濃縮。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙酷化抽皮巧合成物在制備促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖藥物中的 用途。
【文檔編號(hào)】C12P19/60GK106083955SQ201610418761
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月13日 公開(kāi)號(hào)201610418761.8, CN 106083955 A, CN 106083955A, CN 201610418761, CN-A-106083955, CN106083955 A, CN106083955A, CN201610418761, CN201610418761.8
【發(fā)明人】閆國(guó)棟, 張迪, 蓋彥忻, 王雅妮, 葉緒廷, 姜麗艷, 孟慶繁, 滕利榮
【申請(qǐng)人】吉林大學(xué)