一種室內(nèi)斑點(diǎn)落葉病菌侵染蘋果葉片的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于試驗(yàn)研宄領(lǐng)域，涉及一種斑點(diǎn)落葉病菌侵染蘋果葉片的方法，專用于 感染斑點(diǎn)落葉病蘋果葉片的獲得。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘋果斑點(diǎn)落葉?。ˋlternaria Blotch)是由輪紋病菌的強(qiáng)毒菌系蘋果鏈格孢 (Alternaria mali Roberts，A.mali)侵染而引起的一種世界性分布的氣傳病害，該病危害 蘋果葉片、新梢和幼果，嚴(yán)重影響蘋果生產(chǎn)。該病于1924年發(fā)現(xiàn)于美國（Roberts，1924)，現(xiàn) 在在全球范圍發(fā)生（Filajdic andSutton，1995 ;Rotondo et al·，2012 ;Sawamura，1962) 〇 目前斑點(diǎn)落葉病已是亞洲國家蘋果產(chǎn)區(qū)的主要病害（Miyamoto et al，2009;Li et al.， 2〇ll;Filajdi0et al.，1991)。近年來，在我國主要蘋果產(chǎn)區(qū)斑點(diǎn)落葉病發(fā)生比較普遍， 特殊年份在很多果園造成60 %?70%的落葉，果實(shí)的受害程度高達(dá)50 %?60% (慕琦， 2008)。加強(qiáng)抗斑點(diǎn)落葉病蘋果品種的研宄和選育對提高蘋果產(chǎn)量、質(zhì)量有重要的意義。獲 得抗斑點(diǎn)落葉病蘋果品種感病植株，有利于觀察抗病品種在感病時期的表現(xiàn)和生理生化指 標(biāo)變化，提供抗病品種抗病機(jī)制科學(xué)研宄，為選育抗病品種提供優(yōu)良樣本。目前獲得足量、 穩(wěn)定的抗病品種的感病植株較為困難。斑點(diǎn)落葉病菌在不斷地遺傳進(jìn)化中形成不同的生理 小種，不同的蘋果品種，同一品種的不同部位對不同的生理小種有不同的抗性（Dalphy et al，2014)。因此高效穩(wěn)定的斑點(diǎn)落葉病侵染方法尤為重要。
[0003] 目前，對蘋果斑點(diǎn)落葉病的侵染方法主要是參照病原菌致病性處理方法，一般為 孢子懸浮液侵染，包括點(diǎn)接法、噴接法、涂抹法等，需要先將斑點(diǎn)落葉病菌培養(yǎng)一段時間誘 發(fā)產(chǎn)生孢子，測定孢子濃度要求在IXlO 5?10 7個/ml。這一方法不僅步驟復(fù)雜，而且由于 孢子萌發(fā)需要較長時間，溫度濕度要求較高，使斑點(diǎn)落葉病菌孢子懸浮液侵染效率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)中蘋果斑點(diǎn)落葉病侵染時間長，步驟復(fù)雜，效率低等問題，本發(fā)明提 供一種高效穩(wěn)定的室內(nèi)斑點(diǎn)落葉病菌侵染蘋果葉片的方法，能夠獲得穩(wěn)定的感、抗病蘋果 品種的感病植株。
[0005] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)手段獲得：
[0006] 1、本發(fā)明提供一種斑點(diǎn)落葉病菌侵染離體蘋果葉片的方法，該方法步驟為：
[0007] (1)供試材料的處理：將供試蘋果葉齡7d的葉片用無菌水清洗干凈并保持葉片無 水，用無菌水浸濕的脫脂棉將葉柄包上，做保水處理；保水常溫培養(yǎng)2d剔除雜菌污染及機(jī) 械損傷葉片；
[0008] ⑵斑點(diǎn)落葉病菌的處理：將斑點(diǎn)落葉病菌接種在PDA培養(yǎng)基，霉菌培養(yǎng)箱26°C培 養(yǎng)7d，取最外圍直徑為4mm菌塊，用作侵染；
[0009] (3)侵染處理：以處理好的菌塊帶菌絲一面貼于步驟（1)處理過的蘋果葉片背面， 分布于主脈兩側(cè)約lcm，避開葉脈，在25°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，注意保持脫脂棉的濕潤，發(fā)現(xiàn)葉 柄剪口處褐化及時剪去褐化部分；
[0010] (4)感病材料獲得：去除已發(fā)病葉片上的菌塊，無菌水清洗病斑去除殘留的培養(yǎng) 基，用脫脂棉或吸水紙去除葉片表面水分，獲得感病材料。
[0011] 其中，步驟（1)中培養(yǎng)指的是在保水處理過程，培養(yǎng)箱中常溫培養(yǎng)2d。
[0012] 2、上述1提供的室內(nèi)斑點(diǎn)落葉病菌侵染蘋果葉片的方法，其中，步驟（2)是選擇活 力強(qiáng)作為侵染菌體侵染葉片。
[0013] 其中，活力強(qiáng)指的是菌落形態(tài)：外圍菌絲白色、短而密，以該菌落的形態(tài)作為判斷 菌體活力強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)。
[0014] 3、上述1提供的室內(nèi)斑點(diǎn)落葉病侵染蘋果葉片的方法，其中，步驟（3)是菌絲直接 接觸葉片，有厚度約I. 5mm培養(yǎng)基提供營養(yǎng)。
[0015] 有益效果：
[0016] 1.本發(fā)明直接使用斑點(diǎn)落葉病菌絲塊進(jìn)行侵染，解決了傳統(tǒng)的孢子侵染萌發(fā)率低 而導(dǎo)致侵染效率低的問題，本發(fā)明提供的斑點(diǎn)落葉病菌只需接種培養(yǎng)七天左右，即可直接 侵染蘋果葉片，使蘋果葉片感病，發(fā)病快，建立了高效、穩(wěn)定獲得不同蘋果品種感病材料的 技術(shù)。
[0017] 2.本發(fā)明利用PDA培養(yǎng)基為病菌在侵染過程中持續(xù)提供營養(yǎng)，能再次加強(qiáng)侵染效 率，從而解決侵染不穩(wěn)定的問題。提高了中、高抗斑點(diǎn)落葉病蘋果的侵染率和穩(wěn)定性，為各 品種蘋果斑點(diǎn)落葉病實(shí)驗(yàn)研宄提供充足、可靠的實(shí)驗(yàn)材料，以確保實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。
[0018] 3.根據(jù)國內(nèi)外不同侵染方法的侵染效率分析，不同的方法，不同品種感病率差別 很大（呂松，2012)。本發(fā)明提供的侵染方法與孢子懸浮液滴接法，在不同品種進(jìn)行對比侵 染實(shí)驗(yàn)，通過總感病位點(diǎn)與總侵染位點(diǎn)比值為感病率，在48h內(nèi)斑點(diǎn)落葉病菌絲塊侵染的 感病率能達(dá)到98%以上，是侵染方法中較為有效的一種，并且在不同抗性品種中感病率相 差不大；而孢子懸浮液滴接法感病率在50%以下，且不同抗性品種感病率差異很大。
【附圖說明】
[0019] 圖1為菌絲塊侵染蘋果葉片流程圖。
[0020] 圖2為斑點(diǎn)落葉病菌接種7d菌塊選擇位置。
[0021] 圖3為材料處理及侵染示意圖。
[0022] A :未經(jīng)處理蘋果葉片；B :蘋果葉片經(jīng)無菌水及浸濕脫脂棉處理C :菌絲塊接種位 點(diǎn)選擇及接種。
[0023] 圖4為不同品種侵染效果圖。
[0024] A :紅星品種侵染24h后效果圖；B :紅玉品種侵染24h后效果圖；C :紅星品種侵染 48h后效果圖；D :紅玉品種侵染48h后效果圖。
[0025] 圖5為孢子懸浮液侵染不同品種。
[0026] A :紅星品種侵染48h后效果圖；B :紅玉品種侵染48h后效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照本領(lǐng)域的公知手段。
[0028] 實(shí)施例I
[0029] 蘋果高感品種'紅星'室內(nèi)感病葉片的獲得。
[0030] (1)供試材料的處理：選擇一年生枝條距頂端完全展開葉第3?4 (約7d葉齡）健 康蘋果'紅星'品種葉片作為實(shí)驗(yàn)材料。將'紅星'葉片用無菌水清洗，去除葉片表面的灰 塵，用無菌吸水紙或脫脂棉吸去葉片表面的水分。用浸濕的脫脂棉將葉柄包起，以確保葉片 在侵染期間的水分供應(yīng)。剔除處理過程中受傷的葉片。
[0031] ⑵斑點(diǎn)落葉病菌的處理：將保存的斑點(diǎn)落葉病菌接種在PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯浸 出粉3g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂粉1