專利名稱：一種種子特異表達(dá)的淀粉合成酶基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)和植物基因工程領(lǐng)域，具體的說，涉及一種種子 特異表達(dá)的淀粉合成酶基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
種子是人和動(dòng)物的主要食物來源，而且還是許多工業(yè)的原材料，與人類的生 產(chǎn)生活密切相關(guān)。但是，由于植物自身的局限性，種子中所含的蛋白和其他成分 不能完全滿足人類的需求。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因植物在理論 研究和植物育種上的應(yīng)用越來越廣泛，通過DNA重組技術(shù)，植物不僅可以獲得 一些本身不具備的抗蟲、抗病、抗逆等特性，還可以在種子中合成一些本身不具
有的必需氨基酸來提高營養(yǎng)價(jià)值，或者進(jìn)行代謝修飾，產(chǎn)生更符合人類需求的代 謝產(chǎn)物等。
植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白是一個(gè)極具商業(yè)前景的領(lǐng)域，植物生物反 應(yīng)器是指以植物懸浮細(xì)胞、某一組織和器官或整株植物為工廠生產(chǎn)具有重要功能 的蛋白。與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵相比，由于植物是真核生物，外源蛋白在合成后的 修飾加工更接近于真實(shí)狀態(tài)，因此具有更高的生物活性，克服了微生物表達(dá)外源 蛋白不能進(jìn)行修飾加工的缺陷；與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物相比，不僅技術(shù)上 相對容易實(shí)現(xiàn)，而且成本低廉。此外，轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥用蛋白還具有以下優(yōu)點(diǎn) 不需要復(fù)雜的生產(chǎn)設(shè)備；生產(chǎn)的藥用蛋白可供人和動(dòng)物直接食用，不需要象傳統(tǒng) 方法(如發(fā)酵法)生產(chǎn)藥用蛋白那樣進(jìn)行分離提純；比傳統(tǒng)的口服藥物更有效，植 物細(xì)胞中的藥用蛋白通過胃內(nèi)的酸性環(huán)境時(shí)可受到細(xì)胞壁的保護(hù)，降低了胃酸的 破環(huán)作用；易于儲存和分發(fā)，不需要冷藏設(shè)備即可保存數(shù)年而保持活性等。
種子是作物的主要營養(yǎng)貯藏器官，是人和家畜的重要食物來源。因此種子是 表達(dá)外源蛋白的理想場所。目前植物基因工程上經(jīng)常采用CaMVJ:^啟動(dòng)子、玉 米W)/9"衍"啟動(dòng)子和水稻^cri"7啟動(dòng)子等組成型啟動(dòng)子，所謂組成型啟動(dòng)子是 指能夠啟動(dòng)下游基因在受體植物的任何組織和器官內(nèi)持續(xù)、高效表達(dá)的一類啟動(dòng) 子,這類啟動(dòng)子不具有組織特異性，而外源基因的額外高效表達(dá)不僅是一種浪費(fèi)，而且會對植物形成一種生理負(fù)擔(dān)并有可能對植物組織造成傷害，從而影響植物的 正常生長發(fā)育。應(yīng)用組織特異性啟動(dòng)子則可以避免這種影響，組織特異啟動(dòng)子是 指只能在特定時(shí)間或條件下啟動(dòng)下游基因在受體植物的特定組織和器官內(nèi)表達(dá) 的一類啟動(dòng)子。要在特定部位或組織中表達(dá)目的蛋白，就必須選用組織特異性啟 動(dòng)子，以確保目的基因在特定組織中正常表達(dá)。目前己有的組織特異啟動(dòng)子有根 特異性啟動(dòng)子，韌皮部特異性啟動(dòng)子，葉片特異性啟動(dòng)子，胚乳特異性啟動(dòng)子和 種子特異性啟動(dòng)子等?，F(xiàn)有的種子特異性啟動(dòng)子主要來源于植物貯藏蛋白基因， 如谷醇溶蛋白基因啟動(dòng)子、花生種子豆球蛋白/eg^基因啟動(dòng)子、水稻谷蛋白g/W 和g/"5基因啟動(dòng)子和玉米醇溶蛋白基因啟動(dòng)子等，但貯藏蛋白基因啟動(dòng)子一個(gè) 明顯的缺陷是活性一般要受到氮素供應(yīng)的限制。
淀粉是種子的主要組成部分，在作物種子中，淀粉一般占到籽粒重量的70% 左右。植物淀粉合成酶按存在狀態(tài)可分為可溶性淀粉合成酶和顆粒結(jié)合性淀粉合 成酶。玉米可溶性淀粉合成酶主要由zSSI和zSSIII組成，zSSIII由dt////基因編 碼。通過檢測不同時(shí)期玉米的根，莖、葉以及授粉后不同天數(shù)的玉米籽粒、種皮、 胚乳發(fā)現(xiàn)rf"http:///基因的mRNA只能在授粉10天以后的籽粒中檢測到，說明該基 因是一個(gè)種子特異表達(dá)的啟動(dòng)子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種玉米淀粉合成酶基因甴/〃啟動(dòng)子，用于驅(qū)動(dòng)外源 基因在轉(zhuǎn)基因植物的種子中特異表達(dá)。所述啟動(dòng)子是具有下述核苷酸序列之一
1) 序列表中SEQIDNo: 1
2) 序列表中SEQIDNo: 2所示的由1773個(gè)堿基組成的核苷酸序列； 所述SEQIDNO: 2是序列表中SEQ ID No: 1所示的序列第-1651至+122
的1773bp核苷酸序列，該序列足以驅(qū)動(dòng)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的籽粒中特異表 達(dá)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有上述啟動(dòng)子序列與所需目的基因的編 碼區(qū)核苷酸序列連接后產(chǎn)生的重組質(zhì)粒。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。 本發(fā)明涉及首次克隆的具有植物種子特異表達(dá)的玉米淀粉合成酶III基因 dM///啟動(dòng)子的核苷酸序列。包括該啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因的時(shí)空特異表達(dá)特性以 及該啟動(dòng)子與gw^報(bào)告基因編碼區(qū)融合的重組質(zhì)粒在植物組織中的表達(dá)。植物種子是表達(dá)外源蛋白的理想場所。與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵相比，由于植物 是真核生物，外源蛋白在合成后的修飾加工更接近于真實(shí)狀態(tài)，因此具有更高的 生物活性，克服了微生物表達(dá)外源蛋白不能進(jìn)行修飾加工的缺陷；與動(dòng)物細(xì)胞培 養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物相比，不僅技術(shù)上相對容易實(shí)現(xiàn)，而且成本低廉。此外，轉(zhuǎn)基因 植物種子生產(chǎn)藥用蛋白還具有不需要復(fù)雜的生產(chǎn)設(shè)備；生產(chǎn)的藥用蛋白可供人和 動(dòng)物直接食用，不需要像傳統(tǒng)方法(如發(fā)酵法)生產(chǎn)藥用蛋白那樣進(jìn)行分離提純； 比傳統(tǒng)的口服藥物更有效，植物細(xì)胞中的藥用蛋白通過胃內(nèi)的酸性環(huán)境時(shí)可受到 細(xì)胞壁的保護(hù)，降低了胃酸的破環(huán)作用；易于儲存和分發(fā)，不需要冷藏設(shè)備即可 保存數(shù)年而保持活性等優(yōu)點(diǎn)。
要在植物種子中表達(dá)目的蛋白，就必須選用種子特異性啟動(dòng)子，以確保目的 基因在種子中正常表達(dá)。目前植物基因工程上經(jīng)常采用CaMV3:W啟動(dòng)子、玉米 C^/《w衍w啟動(dòng)子和水稻4"/n7啟動(dòng)子等組成型啟動(dòng)子，這類啟動(dòng)子不具有組織 特異性，而外源基因的額外高效表達(dá)不僅是一種浪費(fèi)，而且會對植物形成一種生 理負(fù)擔(dān)并有可能對植物組織造成傷害，從而影響植物的正常生長發(fā)育。目前已有 的組織特異啟動(dòng)子有根特異性啟動(dòng)子，韌皮部特異性啟動(dòng)子，葉片特異性啟動(dòng)子， 胚乳特異性啟動(dòng)子和種子—異性啟動(dòng)子等?，F(xiàn)有的種子特異性啟動(dòng)子主要來源于 植物貯藏蛋白基因，如谷醇溶蛋白基因啟動(dòng)子、花生種子豆球蛋白基因啟 動(dòng)子、水稻谷蛋白g/W和g/"5基因啟動(dòng)子和玉米醇溶蛋白基因啟動(dòng)子等，但貯 藏蛋白基因啟動(dòng)子一個(gè)明顯的缺陷是活性一般要受到氮素供應(yīng)的限制。
本發(fā)明采用Genomic walking法，根據(jù)玉米甴/〃基因的cDNA序歹i』(GenBank Accession No: AF036891)設(shè)計(jì)特異巢式引物，以玉米基因組為模板，從玉米中 分離了^//7基因啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子的核苷酸序列見SEQIDNo:l。該啟動(dòng)子能 驅(qū)動(dòng)目的基因在植物種子中特異表達(dá)，而且淀粉合成酶基因不受氮素供應(yīng)的限 制。本發(fā)明首次獲得的玉米啟動(dòng)子序列3474 bp (序列表中SEQ ID No: 1 所示)，其部分片段是序列表中SEQ ID No: 1所示的序列第-1651至+122的核苷 酸序列1773bp (序列表中SEQIDNo: 2所示)，該序列足以驅(qū)動(dòng)外源基因在轉(zhuǎn) 基因植物的籽粒中特異表達(dá)。其具體開發(fā)過程為 一、玉米^///基因表達(dá)部位分析
首先提取玉米不同時(shí)期不同組織總RNA，用TOYOBO公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒按
以下體系做反轉(zhuǎn)錄
總RNA 500-1000嗎
5 XRT Buffer 4dNTP Mixture (各10 mmol/L) 2 nL
RNase Inhibitor (10 U/pL) 1 nL
Oligo(dT)20 1 nL
Rsv6rTraAcc 1 pL
用RNase-Free H20補(bǔ)至 20
反應(yīng)條件為42°C 20min
99 °C 5 min
然后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍作為模板進(jìn)行Real-TimePCR檢測，內(nèi)參基因 選用玉米J"&97基因。標(biāo)準(zhǔn)曲線用反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物倍比稀釋作模板制定。所用到的 引物序列如下(所有引物均由Invitrogen公司合成，下同)
Pal: 5' — GTTGGGCGTCCTCGTCA — 3' Pa2: 5' — TGGGTCATCTTCTCCCTGTT — 3'
f/M//7引物
Pdl:5' —- CACTCGCCTGACAGCCCAAAAG —3'
Pd2: 5 ， 一 GCCAGCGTATATCAGATGCGAGAG — 3'
Real-Time PCR采用天根生化科技有限公司RealMasterMix試劑盒，反應(yīng)體系為 2 X RealMasterMix 12.5 fiL 引物1 0.5 nL
引物2 0.5 nL
cDNA模板 1.0 nL
H20 10.5 (xL
總體積 25 jxL
反應(yīng)程序?yàn)?5°C lmin
95 °C 20 sec 、
58°C 20 sec ^ 40 cycles
68 °C 20 sec
82°C 7 sec 讀熒光J
68。C 5min
Real-Time PCR檢測顯示，^////基因轉(zhuǎn)錄的mRNA可以在胚乳和種皮中表 達(dá)，在葉片、葉脈和根部沒有表達(dá)。 二、玉米^/"http:///5'側(cè)翼序列的克隆
提取玉米基因組DNA，根據(jù)GenBank中玉米基因的mRNA序列 (AccessionNo: AF036891 )設(shè)計(jì)兩個(gè)反向巢式引物，用玉米基因組DNA為模板， 用SON-PCR法克隆基因5'側(cè)翼未知序列，LA Taq酶購自TaKaRa公司， 引物序列如下Psonl: 5,- CTCCGAAGGCAGAGAGGGCTCTG-3, Pson2: 5，國CCGTAGGACCATCTCCATTTCTAG-3' 第一輪PCR反應(yīng)體系如下
lOxLAPCR buffer5pL
dNTP(10mmol/L)5jxL
MgCl25nL
gDNA(100 ng/nL)0.5 nL
Psonl(10mmol/L)2nL
LATaq酶(5U/nL)0.5 ^
ddH2032 nL
總體積50 jiL
PCR反應(yīng)條件如下:
94 。C 94 。C 60 。C 72 。C 94 。C 29 。C 29 'C 72 。C 94 。C 60 °C 72 °C 72 °C
30 sec 3 min Ramp 3 min to 72 。C 2.5 min
3 min
7.5 min
第二輪PCR反應(yīng)體系如下
lOxLA PCR buffer 5
dNTP(10 mmol/L) 5 jxL
MgCl2 5 nL
第一輪PCR產(chǎn)物 0.5
Pson2(10 mmol/L) 2 |iL
LAT叫酶(5U/nL) 0.5
ddH20 32 nL
總體積 50 nL
PCR反應(yīng)條件如下:
94 °C 94 °C 60 °C 72 °C 94 °C
3 min
30 sec<formula>formula see original document page 8</formula>
PCR產(chǎn)物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳分離，切取含最大長度的PCR產(chǎn)物膠塊， 用DNA凝膠回收試劑盒(購自天根生化科技有限公司)回收，連接進(jìn)pMD18-T 載體后進(jìn)行測序，測序結(jié)果如SEQ IDNo:l所示。 三、^^//7尸啟動(dòng)子活性的驗(yàn)證
首先構(gòu)建含基因啟動(dòng)子與報(bào)告基因融合的植物表達(dá)載體。根據(jù)SEQ ID No:l序列，設(shè)計(jì)合成含有限制性酶切位點(diǎn)的啟動(dòng)子引物，以連結(jié)在測序載體 pMD18-T上的3.5 Kb的序列為模板通過PCR擴(kuò)增法克隆1.8 Kb的基因啟 動(dòng)子序列。
Pde 1: 5， -— CACTCGTCGACGCCTTTGAGACTG —3'
Pde 2: 5， 一 TCTCCATGGCTAGAAGGGGAAGAAAAGAAG —3'
Pdel劃線部分為序列自身含有的&|//酶切位點(diǎn)，Pde2劃線部分為添加的
7Vco/酶切位點(diǎn)。
反應(yīng)體系如下
10xLA PCR buffer 5 nL
dNTP(10 mmol/L) 5
MgCl2 5 nL
Pdel(10 mmol/L) 2
Pde2( 10 mmol/L) 2 nL
模扳UOng/nL) 0.5 nL
LAT叫酶(5U/nL) 0.5
ddH20 30
總體積 50 nL
PCR反應(yīng)條件如下<formula>formula see original document page 8</formula>
將擴(kuò)增出的1779 bp的啟動(dòng)子序列命名為甴//7尸，連接到pMD18-T測序載 體上，經(jīng)Invitrogen公司測序，表明擴(kuò)增沒有出現(xiàn)錯(cuò)配，結(jié)果見SEQ ID No:2。根據(jù)引物Pdel和Pde2兩段設(shè)計(jì)的限制性酶切位點(diǎn)，用&//和Wco/將Jm〃7尸片 段從pMD18-T載體上切下，回收后與經(jīng)Sfl//和Wco/雙酶切的pCAMBIA1301 載體片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化￡>//5 菌株中，挑選陽性克隆送Invitrogen公司測 序，證明連接正確。將陽性克隆在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上繁殖后用質(zhì)粒小提 試劑盒(天根生化科技有限公司)提取質(zhì)粒。
取玉米骨干自交系18-599授粉后8-12天的胚乳(無菌處理)作為基因槍轉(zhuǎn) 化的受體，在含有高滲培養(yǎng)基(MS鹽+0.4mol/L蔗糖)的培養(yǎng)皿(直徑9cm) 中央2-3cm處高滲處理4h，然后用基因槍進(jìn)行轟擊，將構(gòu)建的融合表達(dá)載體轉(zhuǎn) 入玉米胚乳。28 。C暗培養(yǎng)2天后，進(jìn)行組織化學(xué)染色分析，結(jié)果表明，該啟動(dòng) 子能驅(qū)動(dòng)gt/"基因的高效表達(dá)。
本發(fā)明啟動(dòng)子分離及其功能的闡明，不僅為研究植物淀粉合成代謝的表達(dá)調(diào) 控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為基因工程技術(shù)調(diào)控淀粉的生物合成創(chuàng)造了條件，而且為利 用作物籽粒作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白提供了條件。該啟動(dòng)子在植物淀粉改良 和植物生物反應(yīng)器研究中將發(fā)揮重要作用。
本發(fā)明啟動(dòng)子的意義及應(yīng)用價(jià)值在于
1. 本發(fā)明通過Genomic walking法首次克隆了玉米淀粉合成關(guān)鍵酶基因 的啟動(dòng)子序列，為確定淀粉合成酶基因啟動(dòng)子中的關(guān)鍵順式作用元件，從而揭示 植物淀粉合成代謝的調(diào)控途徑奠定了基礎(chǔ)。
2. 本發(fā)明的淀粉合成酶基因啟動(dòng)子用于基因工程技術(shù)調(diào)控淀粉合成能在表 達(dá)部位和表達(dá)強(qiáng)度上與植物本身淀粉合成酶基因完全一致，能最大效果的起到調(diào) 控作用。
3. 本發(fā)明的啟動(dòng)子具有時(shí)空特異表達(dá)特性，能驅(qū)動(dòng)目的基因在灌漿期的植 物種子中高效表達(dá)，而在葉片、葉脈和根部不表達(dá)，在植物生物反應(yīng)器研究中將 有廣泛的用途。


圖1為Real-Time PCR檢測基因在不同組織中的表達(dá)情況
圖2為SON-PCR擴(kuò)增玉米基因5，側(cè)翼序列的電泳圖譜
圖3為cM/7尸片斷構(gòu)建到真核表達(dá)載體pCAMBIA1301上的圖譜示意圖
圖4為基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的組織化學(xué)染色結(jié)果
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但并非對本發(fā)明的限制，凡 依照本發(fā)明公開內(nèi)容所作的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 實(shí)施例l:玉米^/"http:///基因表達(dá)部位分析
1. 玉米不同時(shí)期不同組織總RNA的提取
取50-100mg新鮮或-7(TC液氮中保存的組織，用液氮研磨，置1.5mL離心管 中，加入l mLTrizol (購自Invitrogen公司)充分震蕩，室溫靜置5 min。加入0.2 mL 氯仿，振蕩15sec，靜置2min。 4 。C 12000 r/min離心15 min，取上清。加入等體 積乙二醇丁醚，將管中液體輕輕混勻，冰浴靜置l h。 4 °C 10000r/min離心10min， 棄上清。加入l mL75。/。乙醇，輕輕洗滌沉淀。4 °C 7500 r/min離心5 min，棄上清。 加入lmL100。/。乙醇，輕輕洗滌沉淀。4 °C 7500 r/min離心5 min，棄上清，晾干， 加入適量的DEPC &0溶解。然后用核酸蛋白檢測儀(BIO-RAD公司)測定濃度及 純度，并用變性瓊脂糖膠電泳檢測RNA完整性。
2. RT-PCR
所有檢測合格的RNA用TOYOBO公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒按以下體系做反轉(zhuǎn)錄 總RNA 500-1000 ng
5 xRT Buffer 4pL dNTP Mixture (各10 mmol/L) 2 pL RNase Inhibitor (10 U/fiL) 1 pL 01igo(dT)20 1 nL
ReverTraAce 1 nL
用RNase-Free H20補(bǔ)至 20
反應(yīng)條件為42°C 20min
99°C 5 min
3. Real-Time PCR檢測玉米^W基因在不同組織中的表達(dá)情況
將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍作為模板進(jìn)行Real-TimePCR檢測，內(nèi)參基因選用玉 ^iUcri/^7基因。標(biāo)準(zhǔn)曲線用反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物倍比稀釋作模板制定。所用到的引物序 列如下(所有引物均由Invitrogen公司合成，下同) Jc"'"97引物
Pal: 5，一 GTTGGGCGTCCTCGTCA— 3， Pa2: 5，一 TGGGTCATCTTCTCCCTGTT -— 3'
Pdl: 5，陽一CACTCGCCTGACAGCCCAAAAG —- 3'Pd2:
GCCAGCGTATATCAGATGCGAGAG — 3，
Real-Time PCR釆用天根生化科技有限公司RealMasterMix試劑盒，反應(yīng)體系為: 2xRealMasterMix 12.5
引物l 引物2 cDNA模板 H20 總體積
反應(yīng)程序?yàn)?5°C 95 °C 58°C 68°C 82 。C 68'C
0.5 (xL 0.5 1.0 10.5 25 nL
1 min 20 sec 20 sec 20 sec
"7 S6C
5min
40 cycles
讀熒光^
Real-Time PCR檢測顯示，t/"/〃基因轉(zhuǎn)錄的mRNA可以在胚乳和種皮中表達(dá)， 在葉片、葉脈和根部沒有表達(dá)。結(jié)果見圖l。圖l中，E:胚乳；P:種皮；R:根; L:葉片；LS:葉脈。數(shù)字為授粉后天數(shù)，根、葉片、葉脈取于授粉前14天。
實(shí)施例2:玉米甴/〃 5'側(cè)翼序列的克隆
1. 玉米基因組DNA的提取
稱取1.0g新鮮玉米葉片，剪成lcm的小段，放在預(yù)冷的研缽中，用液氮迅速 研成均勻的粉末，在組織沒有溶解之前，將粉末全部裝入5mL的離心管中，迅 速向離心管中加入2mL， 65'C溫育的CTAB提取緩沖液，輕輕搖晃混勻后65 °C 水浴30min-lh，加入等體積的氯仿:異戊醇(24: 1)，混勻，輕微震蕩15min。室 溫下，10000 r/min離心8 min。吸取上清到一個(gè)干凈的5 mL的離心管中。加入等 體積預(yù)冷的異丙醇(4'C)，室溫下10000r/min離心5min 。棄上清，用75%乙醇 清洗沉淀兩次，無水乙醇清洗一次。在真空干燥器中干燥10min，用適量的TE Buffer(lO mM Tris, 1 mM EDTA， pH 8.0)溶解DNA，在每管中加入3 jiL 10 mg/mL RNaseA4 'C過夜降解基因組DNA中RNA。
2. SON-PCR擴(kuò)增玉米dM/〃 5'側(cè)翼序列
根據(jù)0611631^中玉米甴//7基因的《11^八序列(AccessionNo: AF036891)設(shè)計(jì) 兩個(gè)反向巢式引物，用玉米基因組DNA為模板，用SON-PCR法克隆^/7基因5， 側(cè)翼未知序列，LATaq酶購自TaKaRa公司，引物序列如下
Psonl: 5，- CTCCGAAGGCAGAGAGGGCTCTG-3，Pson 2: 5，- CCGTAGGACCATCTCCATTTCTAG-3，
第一輪PCR反應(yīng)體系如下
10xLAPCR buffer 5
dNTP(10mmol/L) 5 nL
MgCl2 5
gDNA(lOO ng/pL) 0.5 jxL
Psonl(lO mmol/L) 2 nL
LATaq酶(5U/pL) 0.5
ddH20 32
總體積 50
PCR反應(yīng)條件如下 94 °C 94 °C 60 °C 72 °C 94 °C 29 °C 29 °C 72 °C 94 °C 60 °C 72 °C 72 °C
5 Cycks
60 Cycles
7.5 min
第二輪PCR反應(yīng)體系如下:
lOxLAPCR buffer 5
dNTP( 10 mmol/L) 5 (iL
MgCl2 5
第一輪PCR產(chǎn)物 0.5 nL
Pson2(10 mmol/L) 2
LAT叫酶(5U4iL) 0.5
ddH20 32
總體積 50 nL
PCR反應(yīng)條件如下 94 °C 94 °C 60 °C 72 °C 94 °C 29 °C 29 °C
3 min 30 sec ，
1 min 卜 5 Cycles 2.5 miir^ 30 sec 3 min Ramp 3 min to 72 。C72 °C 2.5 min
94°C 10 sec ，
60 。C lmin卜30 Cycles
72 °C 2.5 miJ
72 °C 7.5 min
3. PCR產(chǎn)物的電泳和回收
用1.0Q/。瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，電泳結(jié)束，用凝膠成相系統(tǒng) (BIO-RAD公司)照相分析(見圖2)，切取含最大長度的PCR產(chǎn)物膠塊，用DNA 凝膠回收試劑盒(購自天根生化科技有限公司)回收。
4. DNA連接反應(yīng)
在無菌Eppendorft中加入1 nL 10xT4 DNAligase Buffer, 4pL回收的PCR 產(chǎn)物，1 nL pMD 18-T載體(購自TaKaRa公司)，1 nL T4 DNA連接酶(購自TaKaRa 公司)，3pL無菌ddH20，總體積為10^L。將各組分混勻，16X:中連接過夜。
5. 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
挑取大腸桿菌DH5a單菌落到含有50mLLB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37 。C振 蕩培養(yǎng)過夜；取10pL到含有50mLLB培養(yǎng)基的三角瓶中，37 "C振蕩培養(yǎng)到OD 600值為0.4-0.6;將培養(yǎng)好的的菌液轉(zhuǎn)移到50mL的離心管中，冰浴10min;在4 °C， 5000r/min條件下離心5 min，去上清，收集細(xì)胞；用20mL冰預(yù)冷的0.1 mol/LCaCl2輕輕懸浮沉淀，在冰上放置10min;在4。C， 5000 r/min離心10 min， 用2 mL 0.1 mol/L CaCl2懸浮沉淀，按每管200 nL分裝細(xì)胞懸浮液于無菌的 Eppenforf管中，用液氮快速冷凍，儲存于-70'C。
6. 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化
在200 pL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中加入10 ^LDNA連接產(chǎn)物，手指輕彈管壁， 混勻混合物，置于冰上30min; 42'C水浴熱激處理90sec,迅速放回冰上，冰浴 2-3min;加入800 nL LB培養(yǎng)液，混勻，37'C振蕩培養(yǎng)1 h;將混合液涂布在氨芐 選擇性培養(yǎng)基上，37'C過夜培養(yǎng)。
7. 陽性克隆的篩選和目的片斷測序
從選擇性培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落，接種于3 mL含50 ng/mL的氨芐LB液體培 養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜(37。C， 200r/min)，用Pson2做PCR檢測后，送Invitrogen 公司測序，測序結(jié)果如SEQIDNo:l所示。
實(shí)施例3: ^"http://^啟動(dòng)子啟動(dòng)活性的驗(yàn)證1.植物表達(dá)載體的構(gòu)建
根據(jù)SEQIDNo:l序列，設(shè)計(jì)合成含有限制性酶切位點(diǎn)的啟動(dòng)子引物，以連 結(jié)在測序載體pMD18-T上的3.5 Kb的序列為模板通過PCR擴(kuò)增法克隆1.8 Kb的 由/W基因啟動(dòng)子序列。
Pde 1: 5， —- CACTCGTCGACGCCTTTGAGACTG —3' Pde 2: 5， —- TCTCCATGGCTAGAAGGGGAAGAAAAGAAG —3' Pdel劃線部分為序列自身含有的1^//酶切位點(diǎn)，Pde2劃線部分為添加的Wco/ 酶切位點(diǎn)。
反應(yīng)體系如下 10xLAPCR buffer dNTP(10 mmol/L) MgCl2
Pdel(lO鵬ol/L) Pde2(10 mmol/L) 模扳(lOng^iL) LAT叫酶(5U/nL) 細(xì)20 總體積
PCR反應(yīng)條件如下: 94 °C 94'C 60 。C 72。C 72 °C Hold
5nL 5 nL
2nL 0.5 nL 0.5 nL 30 nL 50 nL
3min 30sec -j
lmin 卜30 Cycles
2min 」
8min
4'C
將擴(kuò)增出的1779bp的啟動(dòng)子序列命名為rf"/Z7尸，連接到pMD18-T測序載體 上，經(jīng)Invitrogen公司測序，表明擴(kuò)增沒有出現(xiàn)錯(cuò)配，結(jié)果見SEQ ID No:2。根據(jù) 弓I物Pdel和Pde2兩段設(shè)計(jì)的限制性酶切位點(diǎn)，用1^/御^ ^將由////>片段從 pMDl8-T載體上切下，回收后與經(jīng)Sa/御Wco風(fēng)酶切的pCAMBIAl301載體片段 連接，構(gòu)建過程見圖3。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a菌株中，挑選陽性克隆送Invitrogen 公司測序，證明連接正確。將陽性克隆在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上繁殖后用質(zhì) 粒小提試劑盒(天根生化科技有限公司)提取質(zhì)粒。
2.轉(zhuǎn)化受體的準(zhǔn)備
取玉米骨干自交系18-599授粉后8-12天的胚乳(無菌處理)作為基因槍轉(zhuǎn)化 的受體，在含有高滲培養(yǎng)基(MS鹽+0.4mol/L蔗糖)的培養(yǎng)皿(直徑9cm)中央 2-3cm處滲透處理4h，然后用基因槍進(jìn)行轟擊。(1) 金粉的制備
稱60 mg金粉(直徑1.6 nm， Bio-Rad)于1.5 mL的EppendorfW (Thermo公司) 中，加入新鮮制備的lmL70o/。的乙醇(HPLC級)，置漩渦混合器上震蕩3-5 min， 靜置15min, 1000r/min離心3min，使金粉沉淀，棄上清液。重復(fù)下列步驟3次。 再加入lmL消毒蒸餾水，漩渦震蕩lmin，靜置lmin; 1000 r/min離心3 sec,使金 粉沉淀，棄上清液。加入滅菌的50%甘油，使金粉濃度達(dá)到60mg/mL。
漩渦震蕩50%甘油中的金粉，沉淀5min，使之成為懸浮液，去掉粗堆集， 取50 nL懸浮混合液于1.5 mL的管中，同時(shí)震蕩，依次加入5 pLDNA(l ng/pL) 50 HL CaCl2 (2.5 mol/L)， 20 ^L亞精胺(0.1 mol/L，新鮮配置)，繼續(xù)震蕩2-3 min， 靜置3 min(混勻后置于冰上5-10min，使載體DNA分子充分沉降在微粒載體表面， 3000-5000 r/min離心2sec，沉淀金粉DNA，棄上清液;加入150 ^70%乙醇，不 破壞沉淀塊，棄上清液;加入150^100%乙醇，不破壞沉淀塊，棄上清液；力口 入50nL100。/。乙醇，指彈管壁幾次，使之重新懸浮，然后低速漩渦2-3 sec，就成 為可用的微彈了。每次取6pL微彈涂在載體膜中央，每次要盡量取出等量的微粒 子，并盡力作到均勻鋪在載體膜(70y。乙醇滅菌)中央3cm直徑之內(nèi)，自然條件下 干燥。
(2) 基因槍轟擊
使用BIO-RAD公司生產(chǎn)的PDS-1000/He型基因槍進(jìn)行轉(zhuǎn)化，按照產(chǎn)品說明書 提供的方法操作。真空度為25mmHg，氣壓為1100psi，每皿轟擊兩槍。將轟擊 后的胚乳轉(zhuǎn)入琥珀酸鈉培養(yǎng)液(20 mmol/L琥珀酸鈉，20 mmol/LCaCl2， 10 nmol/L 氯霉素，PH=5.0) 25。C黑暗培養(yǎng)24h。
(3) 組織化學(xué)染色分析
取培養(yǎng)后的材料置于X-Gluc染色液
中，抽真空半小時(shí)后37。C保溫過夜，在解剖鏡下觀察照相，結(jié)果 見圖4。SEQUENCE LISTING
<110> 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
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<213> 玉米屬玉米(Zea mays. L)
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權(quán)利要求
1、一種種子特異表達(dá)的淀粉合成酶基因啟動(dòng)子，其特征在于，該啟動(dòng)子具有核苷酸-3340至+134的3474bp的序列，如SEQ ID NO1所示。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的淀粉合成酶基因啟動(dòng)子，其特征在于，該啟動(dòng)子 的-1651至+122的1773 bp核苷酸序列足以驅(qū)動(dòng)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的籽粒中 特異表達(dá)，其序列如SEQIDNO: 2所示。
3、 一種種子特異表達(dá)的含有淀粉合成酶基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒，其特征在 于，所述重組質(zhì)粒是含有權(quán)利要求1或2所述的核苷酸序列的重組質(zhì)粒。
4、 一種種子特異表達(dá)的含有淀粉合成酶基因啟動(dòng)子的細(xì)胞系，其特征在于， 所述細(xì)胞系是含有權(quán)利要求1或2所述的核苷酸序列的細(xì)胞系。
5、 一種種子特異表達(dá)的含有淀粉合成酶基因啟動(dòng)子的宿主菌，其特征在于， 所述宿主菌是含有權(quán)利要求1或2所述的核苷酸序列的宿主菌。
全文摘要
本發(fā)明采用Genomic walking法，根據(jù)玉米dull1基因的cDNA序列(GenBankAccession NoAF036891)設(shè)計(jì)特異巢式引物，以玉米基因組為模板，從玉米中分離了一種玉米淀粉合成酶基因dull1啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子具有時(shí)空特異表達(dá)特性，能驅(qū)動(dòng)目的基因在灌漿期的植物種子中高效表達(dá)，而在葉片、葉脈和根部不表達(dá)，在植物生物反應(yīng)器研究中將有廣泛的用途。該啟動(dòng)子的發(fā)明為研究植物淀粉合成代謝的表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為基因工程技術(shù)調(diào)控淀粉的生物合成創(chuàng)造了條件，在植物淀粉改良和植物生物反應(yīng)器研究中將發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/63GK101525622SQ200910058060
公開日2009年9月9日 申請日期2009年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月7日
發(fā)明者劉漢梅, 張軍杰, 李曉兵, 田孟良, 胡育峰, 榮廷昭, 黃玉碧 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)