專利名稱：一種蛋白質(zhì)混合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組蛋白融合技術(shù)，具體地涉及一種蛋白質(zhì)混合物。此外，本發(fā)明還涉 及該蛋白質(zhì)混合物的制備方法。
背景技術(shù)：
1.人誘導(dǎo)多功能干(iPS)細(xì)胞2006年，日本Yamanaka實(shí)驗(yàn)室利用逆病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)四種轉(zhuǎn)錄因子(KLF4，c_Myc，S0X2， 0CT-4)進(jìn)入小鼠胚胎和成年成纖維細(xì)胞，成功地獲得了一種多功能干細(xì)胞，其特性與小鼠 胚胎干細(xì)胞非常相似。不久，使用同樣的方法轉(zhuǎn)導(dǎo)人成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)的人多功能干細(xì)胞也 被成功獲得。隨后，從多種遺傳病病人細(xì)胞誘導(dǎo)的iPS cells也被獲得。iPS cells具有與 胚胎干細(xì)胞非常相似的特征，胚胎干細(xì)胞能夠分化成所有類型的體細(xì)胞，這些分化的體細(xì) 胞可以被用于修復(fù)由于疾病或受傷造成的組織損傷，因此胚胎干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有非 常廣泛的應(yīng)用前景。但是，胚胎干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用有兩個(gè)重要的障礙(1)移植后的免 疫排斥；(2)使用人類胚胎的倫理學(xué)問題。即便使用體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的方法獲得的胚胎干細(xì) 胞，也存在倫理學(xué)方面的問題。而誘導(dǎo)的人多功能干細(xì)胞可以從病人細(xì)胞獲得，不存在免疫 排斥的問題。又由于不需要破壞人胚胎或者使用人卵細(xì)胞，因此不存在使用胚胎干細(xì)胞的 倫理問題。這些優(yōu)點(diǎn)使得iPS細(xì)胞技術(shù)有更好的再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。2.誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的技術(shù)最早人們在誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞時(shí)，使用復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體將所 需的重編程因子基因?qū)爰?xì)胞，這些病毒載體都會(huì)整合到宿主細(xì)胞的基因組中。雖然這些 外源基因在iPS細(xì)胞中在絕大多數(shù)情況下是靜默的。但是一旦被重新激活，可能會(huì)導(dǎo)致腫 瘤。這些基因的泄漏表達(dá)，也有可能使iPS細(xì)胞分化和成熟的不完全，導(dǎo)致形成未成熟的畸 胎瘤危險(xiǎn)性大增。病毒整合也有可能激活或終止內(nèi)源基因的表達(dá)。在基因治療的歷史上， 使用逆轉(zhuǎn)錄病毒整合技術(shù)也曾由于激活原癌基因?qū)е掳籽?。許多實(shí)驗(yàn)室都嘗試使用非病 毒整合技術(shù)誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞。腺病毒和質(zhì)粒以及質(zhì)粒都曾被用來載體將重編程因子導(dǎo)入 細(xì)胞，成功獲得iPS細(xì)胞。但是iPS細(xì)胞產(chǎn)生的機(jī)率非常低。OriP/EBNA-1質(zhì)粒附加體也被 用來作為載體來誘導(dǎo)iPS細(xì)胞。有一些實(shí)驗(yàn)室利用Cre/loxp，轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶，在獲得iPS 細(xì)胞之后，將整合到基因組的外源基因切除。另外一種避免外源基因基因組整合的方法是 用化學(xué)物質(zhì)來代替重編程轉(zhuǎn)錄因子，從目前已發(fā)表的結(jié)果來看，還沒有找到能完全替代重 編程轉(zhuǎn)錄化學(xué)物質(zhì)或組合，只能替代一到兩種重編程因子。即使iPS細(xì)胞沒有整合的外源 基因，上述方法也不能完全避免基因組的改變，比如用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的方法會(huì)有低機(jī)率的基因 組整合，化學(xué)物質(zhì)可能會(huì)導(dǎo)致突變。3.蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)最初來自于對于HIV TAT蛋白的研究，人們發(fā)現(xiàn)全長HIV TAT蛋白能夠 進(jìn)入細(xì)胞激活病毒基因的轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步研究表明，HIV TAT蛋白的一個(gè)區(qū)域(TAT PTD)負(fù) 責(zé)進(jìn)入細(xì)胞的功能。人們發(fā)現(xiàn)將TAT PTD與大分子偶聯(lián)或融合能夠?qū)⒋蠓肿铀腿爰?xì)胞。研究表明帶正電荷的精氨酸對于TAT PTD穿膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)是必須的，任何一個(gè)精氨酸的突變 都會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的喪失。在此基礎(chǔ)上，人們發(fā)現(xiàn)多聚精氨酸同樣具有轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。利用 TAT PTD和其他蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)多肽的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)在解決于大分子藥物進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮功能方 面具有巨大的潛力。4. SUM0融合蛋白的切割泛肽樣修飾物(SUM0)能夠共價(jià)修飾蛋白。SUM0修飾能夠調(diào)控多種細(xì)胞進(jìn)程包括 核轉(zhuǎn)移，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白穩(wěn)定性。uipl，一種SUM0蛋白酶，能夠特異性地識(shí)別SUM0的三級(jí) 結(jié)構(gòu)，在SUM0與其修飾蛋白相連的位置切割。當(dāng)SUM0與其他蛋白融合時(shí)(相當(dāng)于SUM0修 飾目標(biāo)蛋白的N端氨基)，Ulpl也能特異性地將SUM0切除，將目標(biāo)蛋白完整地釋放。5.蛋白誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞用蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的技術(shù)將重編程因子蛋白(KLF4，c-Myc, S0X2, 0CT-4)直接導(dǎo)入細(xì)胞， 是一種可以避免以上提到安全性問題的方法。一個(gè)來自Scripps研究所的實(shí)驗(yàn)室成功的使 用大腸桿菌表達(dá)的四種重編程因子的重組蛋白加上一種化學(xué)物質(zhì)(HDAC抑制劑)得到小鼠 iPS細(xì)胞。他們使用的重組重編程因子是0CT-4，KLF4，Sox2，C-MyC。利用c端融合的多聚 精氨酸將這四種重編程因子導(dǎo)入細(xì)胞。這種技術(shù)能夠完全排除所有利用DNA將重編程因子 導(dǎo)入細(xì)胞的弊端，從而使得iPS細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用的可能性向前推進(jìn)了一大步。但 是，他們使用的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)多肽-多聚精氨酸與重編程因子直接融合，由于轉(zhuǎn)導(dǎo)多肽帶強(qiáng)正 電荷，存在與帶負(fù)電荷的基因組的DNA非特異性結(jié)合的可能性，與轉(zhuǎn)導(dǎo)多肽融合的轉(zhuǎn)錄因 子可能會(huì)非特異地改變基因表達(dá)。這種非特異的基因表達(dá)的改變，可能會(huì)導(dǎo)致誘導(dǎo)多功能 干細(xì)胞的效率降低，還有可能導(dǎo)致某些基因表達(dá)的永久性改變，影響iPS細(xì)胞隨后的分化 和成熟。因此，獲得一種能夠克服上述缺點(diǎn)的制劑，來誘導(dǎo)人的多功能干細(xì)胞，對于人IPS 細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中的實(shí)際應(yīng)用具有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種具有潛在醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值的蛋白質(zhì)混合物， 該蛋白質(zhì)混合物能大大降低與基因組DNA非特異性結(jié)合的可能性，在轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)后具有 轉(zhuǎn)錄激活活性，可用于誘導(dǎo)人多功能干細(xì)胞。為此，本發(fā)明還提供該蛋白質(zhì)混合物的制備方 法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)混合物，該蛋白質(zhì)混和物由C-myc，S0X2, KLF4，0CT-4的 融合蛋白組成，每一種融合蛋白的使用濃度為lng/ml-lmg/ml ；這些融合蛋白具有以下構(gòu) 成PTD-SUM0-Protein ；PTD是一個(gè)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)，代表HIV-TAT，HSV-VP22，AntP或者多聚精 氨酸；SUM0是泛肽樣修飾物，代表酵母SMT3p或者其在各個(gè)物種的同源物，是融合蛋白進(jìn)入 細(xì)胞后被切割的識(shí)別區(qū)域；Protein是C-myc，S0X2, KLF4或者0CT-4。所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)PTD為HIV TAT蛋白的TAT PTD區(qū)域，或者其他具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功 能的氨基酸序列；該蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)PTD使該蛋白質(zhì)混合物能夠進(jìn)入人細(xì)胞。所述泛肽樣修飾物SUM0為酵母SMT3p，或者其他氨基酸序列，其三級(jí)結(jié)構(gòu)能被 SUM0蛋白酶識(shí)別并切割，該泛肽樣修飾物SUM0使蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)多肽能夠從融合蛋白切除。優(yōu)選地，在所述PTD和SUM0之間可以插入NES，所述融合蛋白具有以下構(gòu)成PTD-NES-SUMO-Protein, NES是一個(gè)可選的核運(yùn)出序列，決定融合蛋白的細(xì)胞質(zhì)定位。所述可選的核運(yùn)出序列NES為人IkBa的核運(yùn)出序列，或者具有核運(yùn)出序列功能的
氨基酸序列。所述PTD-NES-SUM0具有SEQ ID NO. 1所示的DNA序列，具有SEQ IDN0. 2所示的
氨基酸序列。所述PTD-NES-SUM0-S0X2 具有 SEQ ID NO. 3 所示的 DNA 編碼序列； PTD-NES-SUM0-0CT-4 具有 SEQ ID NO. 4 所示的 DNA 編碼序列；PTD-NES-SUM0-KLF4 具有 SEQ ID NO. 5所示的DNA編碼序列；PTD-NES-SUMO-C-myc具有SEQ ID NO. 6所示的DNA編碼序 列。優(yōu)選地，在所述PTD和NES之間插入6個(gè)組氨酸以便純化。此外，本發(fā)明還提供一種蛋白質(zhì)混合物的制備方法，包括如下步驟(1)構(gòu)建PTD-NES-SUMO-Protein的表達(dá)質(zhì)粒首先，分別合成8段長為75bp且相 互間有20bp重疊的寡核苷酸引物，經(jīng)過三次重疊PCR，合成PTD-NES-SUM0 ；然后，從人胚胎 干細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增得到人0CT-4，S0X2，KLF4，C-myc cDNA，3，端含有Xhol位點(diǎn)，與合成的 TAT-NES-SUM0的順序通過PCR進(jìn)行組裝，獲得的產(chǎn)物克隆到pET_24a⑴載體的Ndel/Xhol 位點(diǎn)上；(2)篩選表達(dá)菌株將步驟(1)得到的PTD-NES-SUMO-Protein表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 BL21宿主菌中，小量培養(yǎng)篩選高表達(dá)克隆；(3)融合蛋白的大規(guī)模表達(dá)將表達(dá)菌種接種于瓶中，培養(yǎng)至0D0. 6，加入IPTG誘 導(dǎo)3小時(shí)；(4)分離純化融合蛋白采用疏水層析和離子交換來分離純化上述融合蛋白。本發(fā)明獲得的蛋白質(zhì)混合物，能從根本上解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的缺陷(非特異的 基因表達(dá)的改變，可能會(huì)導(dǎo)致誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的效率降低，還有可能導(dǎo)致某些基因表達(dá) 的永久性改變，影響iPS細(xì)胞隨后的分化和成熟)。PTD的融合使得融合蛋白能夠進(jìn)入細(xì)胞。 SUM0在融合蛋白中的存在，使得蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)多肽能夠從融合蛋白切除，去除融合的PTD，NES, SUM0。這種混合物如果應(yīng)用于誘導(dǎo)人多功能干細(xì)胞，能最大限度地降低在誘導(dǎo)多功能干細(xì) 胞的過程中，由于加入的誘導(dǎo)物對于最終得到的iPS細(xì)胞的不利影響，使得到的iPS細(xì)胞更 加適合于在再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用以及其他相關(guān)領(lǐng)域中的應(yīng)用。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中構(gòu)建PTD-NES-SUM0的PCR反應(yīng)示意圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例2融合蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞內(nèi)切割結(jié)果示意圖(采用 western免疫印跡的方法)；圖3是本發(fā)明實(shí)施例3融合蛋白的轉(zhuǎn)錄活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。優(yōu)選實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用 于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法， 通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1蛋白質(zhì)混合物的制備1. TAT-NES-SUM0-重編程因子的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道所報(bào)道的HIV TAT PTD和酵母SMT3p (SUMO)，人IkBa的核運(yùn)出 順序NES的氨基酸序列對密碼子進(jìn)行優(yōu)化，以便于在大腸桿菌中進(jìn)行高水平表達(dá)。按照 TAT-NES-SMT3p的順序進(jìn)行排列，并在TAT和NES之間插入6個(gè)Histidine (6聚組氨酸)以 便純化。這部分融合蛋白的編碼序列通過基于寡聚核苷酸，PCR組裝的方法合成，5’端含有 一個(gè)NdeI位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)方法如下分別合成6段長為75bp左右且相互間有20bp重疊的寡核 苷酸引物，經(jīng)過三次重疊PCR(見圖1)①將引物a(SEQ ID NO. 7所示序列)和引物b(SEQ ID NO. 8所示序列)，引物c (SEQ ID NO. 9所示序列)和引物d (SEQ ID NO. 10所示序列)， 引物e (SEQ ID NO. 11所示序列)和引物f (SEQ ID N0. 12所示序列)分別混合進(jìn)行PCR反 應(yīng)，得到產(chǎn)物ab、cd、ef.②將引物a、d與上一輪PCR產(chǎn)物ab、cd相混合后進(jìn)行擴(kuò)增，③將引 物a、f與上一輪PCR產(chǎn)物ad、第一輪產(chǎn)物ef相混合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到產(chǎn)物af，瓊脂糖凝 膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，回收目的條帶。PCR采用Roche公司的高保真擴(kuò)增系統(tǒng)，反應(yīng)體系按 照說明書的要求配置。反應(yīng)條件均為步驟①95°C 5分鐘；步驟②94°C 45秒，55°C 45秒， 72 0C 55秒，30個(gè)循環(huán)；步驟③72 °C 7分鐘。用Invitrogen公司的Trizol Reagent提取5 X IO6人胚胎干細(xì)胞總RNA。按照 Invitrogen公司的Superscript 111逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒的說明書用隨機(jī)引物將RNA反轉(zhuǎn)錄 成cDNA，OCT-4, S0X2, KLF4, C-myc cDNA使用下列引物擴(kuò)增得到C-myc 5，ATCGCGAACAGATTGGAGGTATGCCCCTCAACGTTAGCTTC(SEQ ID NO. 13)C-myc 3，CGACTCGAGTTACGCACAAGAGTTCCGTA(SEQ ID NO. 14)Klf45'ATCGCGAACAGATTGGAGGTATGGCTGTCAGCGACGCGCT(SEQ ID NO. 15)Klf43'CGACTCGAGTTAAAAATGCCTCTTCATGTG(SEQ ID NO. 16)Nanog5'ATCGCGAACAGATTGGAGGTATGAGTGTGGATCCAGCTTG(SEQ ID NO. 17)Nanog 3，CGACTCGAGTCACACGTCTTCAGGTTGCA(SEQ ID NO. 18)0ct-45，ATCGCGAACAGATTGGAGGTATGGCGGGACACCTGGCTTC(SEQ ID NO. 19)0ct-43，CGACTCGAGTCAGTTTGAATGCATGGGAG(SEQ ID NO. 20)這些引物中，5’引物都含有20個(gè)堿基與TAT-NES-SMT3p片段3’端完全相同，便于 拼裝。每個(gè)cDNA與合成的TAT-NES-SUM0的順序通過PCR (反應(yīng)條件與拼裝 TAT-NES-SUM0的條件相同，使用引物a和各cDNA的3’引物)進(jìn)行組裝。獲得的產(chǎn)物克隆 到 pET-24a(+)載體(Novagen)的 Ndel/Xhol 位點(diǎn)上。
TAT-NES-SUM0 具有 SEQ ID NO. 1 所示的 DNA 編碼序列；TAT-NES-SUM0具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列；TAT-NES-SUM0-S0X2 具有 SEQ ID NO. 3 所示的 DNA 編碼序列；TAT-NES-SUM0-0CT-4 具有 SEQ ID NO. 4 所示的 DNA 編碼序列；TAT-NES-SUM0-KLF4 具有 SEQ ID NO. 5 所示的 DNA 編碼序列；TAT-NES-SUMO-C-myc 具有 SEQ ID N0. 6 所示的 DNA 編碼序列。2.表達(dá)菌株的篩選將融合表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)宿主菌中，小量培養(yǎng)篩選高表達(dá)克隆。在3ml OD 0. 6的大腸桿菌中加入0. ImM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)3小時(shí)后收集菌體，菌體加入上樣 緩沖液煮沸5分鐘，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，選擇表達(dá)量最高的克隆作 為大規(guī)模表達(dá)用菌種。對高表達(dá)菌種的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的融合蛋白大部分存在于包 涵體中。3.融合蛋白的大規(guī)模表達(dá)將表達(dá)菌種接種于10L LB中，37度培養(yǎng)至OD 0. 6，加入0. IM IPTG誘導(dǎo)3小時(shí)。 此時(shí)菌液濃度為OD 600在1. 0左右。將上述獲得的培養(yǎng)物離心，棄去培養(yǎng)基，獲得大約27. 4g菌體。加入300ml裂解液 (50mM PH 8.0 Tris-Cl, 500mM NaCl)重懸菌體。4度超聲裂解菌體。4度6000rpm離心，棄 去上清。用300ml裂解液洗滌沉淀，離心棄去上清。用增溶液(50mM PH 8. OTris-Cl，500mM NaCl,8M Urea)溶解包涵體。包涵體溶解后，用IMAC進(jìn)行親和層析，上樣完畢后先用沖洗液 (8M Urea, 500mM NaCl,50mM Tris-HCl pH8. 0,20mM Imidazole)清洗非特異性結(jié)合的成分， 然后用(8M Urea PH 8. 050mM Tris-Hcl, 500mM NaC1250mM Imidazole)洗脫，紫外 280nM 吸收檢測，收集蛋白峰，共收集洗脫液80ml。疏水層析。上述洗脫液補(bǔ)加NaCl固體到2M，充分溶解后，10，000RPM離心15分鐘， 棄沉淀。上清直接上樣到平衡緩沖液(2M NaCl, 50mMTris-HCl pH8. 0)充分平衡的Phenyl Sepharose FF。上樣完成后，平衡緩沖液進(jìn)一步?jīng)_洗3個(gè)柱長，洗脫緩沖液(50mM Tri s-HCl ρΗ8· 0)洗脫目標(biāo)峰。目標(biāo)蛋白用IM醋酸調(diào)節(jié)ρΗ至6. 0并用無熱源水稀釋三倍，上樣到平衡緩沖液 (IOmM NaAc-HAc, ρΗ6. 0)充分平衡的SP-HP柱，逐步提高NaCl濃度進(jìn)行洗脫，收集目標(biāo)蛋 白為純化的融合蛋白。0. 22微米微孔濾膜過濾除菌后用于功能檢測。實(shí)施例2.融合蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)Hela細(xì)胞培養(yǎng)于high-glucose DMEM(10 %胎牛血清)。在細(xì)胞大約鋪滿30%， 加入TAT-NES-SUM0-重編程因子(每種融合蛋白濃度均為5ug/ml)，12小時(shí)后，更換培 養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12h，24h，72h。細(xì)胞用冷PBS洗兩次。在裂解液(PH 7. 520mM Tris-Cl, 200mM NaCl,l%NP-40,lmM PMSF)中裂解細(xì)胞，取含40ug總蛋白細(xì)胞裂解液，加5X上樣緩 沖液，SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn) PVDF 膜，用 anti-0CT4, S0X2, c-Myc, (cellsignaling) KLF4(santa Cruz)進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明(見圖2)本發(fā)明的融合蛋白能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。實(shí)施例3.融合蛋白的細(xì)胞內(nèi)切割實(shí)驗(yàn)過程同實(shí)施例2。結(jié)果表明(見圖2)，本發(fā)明所獲得的融合蛋白能夠在細(xì)胞內(nèi)被切割，從而降低由于融合轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)的DNA結(jié)合活性所導(dǎo)致的非特異轉(zhuǎn)錄改變。實(shí)施例4.融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的活性Luciferase (熒光素酶)報(bào)告基因的構(gòu)建0CT4報(bào)告基因質(zhì)粒8串聯(lián)0CT4結(jié)合位點(diǎn)(ATGCAAAT)。引物A(SEQID NO. 21)引 物 B(SEQ ID NO. 22)退火后插入 PGL3_promoter luciferaseplasmid KpnI/Bglll 位點(diǎn)。KLF4報(bào)告基因質(zhì)粒8串聯(lián)KLF4結(jié)合位點(diǎn)(AGGGTGC)。引物A(SEQ IDN0. 23)引 物 B(SEQ ID NO. 24)退火后插入 PGL3_promoter luciferaseplasmid KpnI/Bglll 位點(diǎn)。Sox2報(bào)告基因質(zhì)粒Hesxl基因Hesxl翻譯起始位點(diǎn)上游570_bp PCR片段KpnI 酶切后插入 pGL3-basic vector (Promega)KpnI/Smal 位點(diǎn)。引物 5' -CGAGGTACCGAGTTCTC TGTTCTATAAAC-3‘ (SEQ ID NO. 25)和 5 ‘ -CGACCCGGGCCTCTCGTGGTCTGCACAGA-3‘ (SEQ ID N0. 26)。C-myc 報(bào)告基因質(zhì)粒引物 A(5，-CCGGTACCGG GTTGTGGCAGCCAGTCACGT GCCCGCCGCG TAGCCACACC TCTGCTCCTCAGAGCAATGT CAAGCGGTCACGTGTGATAG CAACAGATCA CGTGGCTGCC ATCGCCCCTC-3，)(SEQ ID NO. 27)禾口 弓丨物 B (5，-ATGAATTCCG GACGTTCTGG GCACGTGACC GCCACCCATGCGCTGAGGGG CGGACAGGAG GTGCTTCGAC TGGGAGGAGG GCGAAGAGTG TAAGGGGGCGGAGGGGCGAT GGCAGCC-3，) (SEQ ID N0. 28)退火補(bǔ)齊，KpnI 酶切后插入 PGL3-promoter luciferase plasmid KpnI/Smal 位點(diǎn)。HeIa細(xì)胞在大約鋪滿50 %的時(shí)候，在12-we 11細(xì)胞培養(yǎng)板用fugene6 (購自 Roche)轉(zhuǎn)染重編程轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因(firefly luciferase)和內(nèi)參報(bào)告質(zhì)粒 ρRL-TK-Iuc (promega, Renilla luciferase)。轉(zhuǎn)染后 6 小時(shí)，更換培養(yǎng)基,加入 5ug/ml 融合 蛋白。繼續(xù)培養(yǎng)12h，24h，48h，72h。細(xì)胞用PBS洗兩次，用購自promega的importer lysis buffer (報(bào)告基因裂解緩沖液)裂解細(xì)胞，細(xì)胞裂解液用購自Promega的dual-luciferase kit (雙熒光素酶試劑盒)檢測luciferase的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(見圖3)，本發(fā)明得到的融合蛋白在加入培養(yǎng)基12小時(shí)后，報(bào)告基 因luciferase的活性就有就有較大的提升，一直持續(xù)到72h。說明本發(fā)明得到的融合蛋 白在轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)后具有轉(zhuǎn)錄激活活性，本發(fā)明的蛋白質(zhì)混合物可用于誘導(dǎo)人多功能干細(xì) 胞，在再生醫(yī)學(xué)鄰域有巨大的應(yīng)用前景。序列表<110>上海欣百諾生物科技有限公司<120> 一種蛋白質(zhì)混合物及其制備方法<130>NP-09-13208<160>28<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>381<212>DNA<213>人工序列<400>1tacggtcgta aaaaacgtcg tcagcgtcgt cgtatgggtc atcaccatca tcatcacatg 60
gtgaaagaactgcaggaaattcgtctggggtcggactcagaagtcaatcaagaagctaag120
ccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgatgga180
tcttcagagatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaagcg240
ttcgctaaaagacagggtaaggaaatggactccttaagattcttgtacgacggtattaga300
attcaagctgatcaggcccctgaagatttggacatggaggataacgatattattgaggct360
catcgcgaacagattggaggt381
<210>2
<211>128
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
MYGRKKRRQRRRMGHHHHHHMVKELQEIRLGSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSD60
GSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEM DSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIE120
AHREQIGG128
<210>3
<211>1338
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
atgtacggtcgtaaaaaacgtcgtcagcgtcgtcgtatgggtcatcaccatcatcatcac60
atggtgaaagaactgcaggaaattcgtctggggtcggactcagaagtcaatcaagaagct120
aagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgat180
ggatcttcagagatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaa240
gcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatggactccttaagattcttgtacgacggtatt300
agaattcaagctgatcaggcccctgaagatttggacatggaggataacgatattattgag360
gctcatcgcgaacagattggaggtatgtacaacatgatggagacggagctgaagccgccg420
ggcccgcagcaaacttcggggggcggcggcggcaactccaCCgCggCggCggccggcggc480
aaccagaaaaacagcccggaccgcgtcaagcggcccatgaatgccttcatggtgtggtcc540
cgcgggcagcggcgcaagatggcccaggagaaccccaagatgcacaactcggagatcagc600
aagcgcctgggcgccgagtggaaacttttgtcggagacggagaagcggccgttcatcgac660
gaggctaagcggctgcgagcgctgcacatgaaggagcacccggattataaataccggccc720
cggcggaaaaccaagacgctcatgaagaaggataagtacacgctgcccggcgggctgctg780
gcccccggcggcaatagcatggcgagcggggtcggggtgggcgccggcctgggcgcgggc840
gtgaaccagcgcatggacagttacgcgcacatgaacggctggagcaacggcagctacagc900
atgatgcaggaccagctgggctacccgcagcacccgggcctcaatgcgcacggcgcagcg960
cagatgcagcccatgcaccgctacgacgtgagcgccctgcagtacaactccatgaccagc1020
tcgcagacctacatgaacggctcgcccacctacagcatgtcctactcgcagcagggcacc1080
cctggcatggctcttggctccatgggttcggtggtcaagtccgaggccagctccagcccc1140
cctgtggttacctcttcctcccactccagggcgccctgccaggccggggacctccgggac12000132]atgatcagcatgtatctccccggcgccgaggtgccggaacccgccgcccccagcagactt12600133]cacatgtcccagcactacca gagcggcccg gtgcccggca cggccattaa cggcacactg13200134]cccctctcacacatgtga13380135]<210>40136]<211>14670137]<212>DNA0138]〈213〉人工序列0139]<400>40140]atgtacggtcgtaaaaaacgtcgtcagcgtcgtcgtatgggtcatcaccatcatcatcac600141]atggtgaaagaactgcaggaaattcgtctggggtcggactcagaagtcaatcaagaagct1200142]aagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgat1800143]ggatcttcagagatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaa2400144]gcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatggactccttaagattcttgtacgacggtatt3000145]agaattcaagctgatcaggcccctgaagatttggacatggaggataacgatattattgag3600146]gctcatcgcgaacagattggaggtatggcgggacacctggcttcggatttcgccttctcg4200147]ccccctccaggtggtggaggtgatgggccaggggggccggagccgggctgggttgatcct4800148]cggacctggctaagcttccaaggccctcctggagggccaggaatcgggccgggggttggg5400149]ccaggctctgaggtgtgggggattcccccatgccccccgccgtatgagttctgtgggggg6000150]atggcgtactgtgggccccaggttggagtggggctagtgccccaaggcggcttggagacc6600151]tctcagcctgagggcgaagcaggagtcggggtggagagcaactccgatggggcctccccg7200152]gagccctgcaccgtcacccctggtgccgtgaagctggagaaggagaagctggagcaaaac7800153]ccggaggagtcccaggacatcaaagctctgcagaaagaactcgagcaatttgccaagctc8400154]ctgaagcagaagaggatcaccctgggatatacacaggccgatgtggggctcaccctgggg9000155]gttctatttgggaaggtattcagccaaacgaccatctgccgctttgaggctctgcagctt9600156]agcttcaagaacatgtgtaagctgcggcccttgctgcagaagtgggtggaggaagctgac10200157]aacaatgaaaatcttcaggagatatgcaaagcagaaaccctcgtgcaggcccgaaagaga10800158]aagcgaaccagtatcgagaaccgagtgagaggcaacctggagaatttgttcctgcagtgc11400159]ccgaaacccacactgcagcagatcagccacatcgcccagcagcttgggctcgagaaggat12000160]gtggtccgagtgtggttctgtaaccggcgccagaagggcaagcgatcaagcagcgactat12600161]gcacaacgagaggattttgaggctgctgggtctcctttctcagggggaccagtgtccttt13200162]cctctggccccagggccccattttggtaccccaggctatgggagccctcacttcactgca13800163]ctgtactcctcggtccctttccctgagggggaagcctttccccctgtctccgtcaccact14400164]ctgggctctc ccatgcattc aaactga14670165]<210>50166]<211>17970167]<212>DNA0168]〈213〉人工序列0169]〈400>50170]atgtacggtcgtaaaaaacg tcgtcagcgtcgtcgtatgg gtcatcacca tcatcatcac0171]atggtgaaagaactgcaggaaattcgtctg gggtcggactcagaagtcaa tcaagaagct0172]aagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat0173]ggatcttcagagatcttcttcaagatcaaa aagaccactcctttaagaag gctgatggaa0174]gcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatg gactccttaa gattcttgta cgacggtatt0175]agaattcaagctgatcaggcccctgaagatttggacatgg aggataacga tattattgag0176]gctcatcgcgaacagattggaggtatggctgtcagcgacg cgctgctcccatctttctcc0177]acgttcgcgtCtggCCCggCgggaagggagaagacactgcgtcaagcagg tgccccgaat0178]aaccgctggcgggaggagctctcccacatgaagcgacttcccccagtgcttcccggccgc0179]ccctatgacctggcggcggcgaccgtggccacagacctggagagcggcggagccggtgcg0180]gcttgcggcggtagcaacctggcgcccctacctcggagagagaccgaggagttcaacgat0181]ctcctggacctggactttattctctccaattcgctgacccatcctccggagtcagtggcc0182]gccaccgtgtcctcgtcagcgtcagcctcctcttcgtcgtcgccgtcgagcagcggccct0183]gccagcgcgccctccacctgcagcttcacctatccgatccgggccgggaacgacccgggc0184]gtggcgccgggcggcacgggcggaggcctcctctatggcagggagtccgctccccctccg0185]acggctcccttcaacctggcggacatcaacgacgtgagccCCtCgggCggcttcgtggcc0186]gagctcctgcggccagaattggacccggtgtacattccgccgcagcagccgcagccgcca0187]ggtggcgggctgatgggcaagttcgtgctgaaggcgtcgctgagcgcccctggcagcgag0188]tacggcagcccgtcggtcatcagcgtcagcaaaggcagccctgacggcagccacccggtg0189]gtggtggcgccctacaacggCgggCCgCCgcgcacgtgccccaagatcaagcaggaggcg0190]gtctcttcgtgcacccacttgggcgctggaccccctctcagcaatggccaCCggCCggCt0191]gcacacgacttccccctggggcggcagctccccagcaggactaccccgaccctgggtctt0192]gaggaagtgctgagcagcagggactgtcaccctgccctgccgcttcctcccggcttccat0193]ccccacccggggcccaattacccatccttcctgcccgatcagatgcagccgcaagtcccg0194]ccgctccattaccaagagctcatgccacccggttcctgcatgccagaggagcccaagcca0195]aagaggggaagacgatcgtggccccggaaaaggaccgccacccacacttgtgattacgcg0196]ggctgcggcaaaacctacacaaagagttcccatctcaaggcacacctgcg3.3.CCC3.C3.C3.0197]ggtgagaaaccttaccactgtgactgggacggctgtggatggaaattcgcccgctcagat0198]gaactgaccaggcactaccgtaaacacacggggcaccgcccgttccagtgccaaaaatgc0199]gaccgagcattttccaggtcggaccacctcgccttacacatgaagaggcatttttaa0200]<210>60201]<211>17040202]<212>DNA0203]<213>人工序列0204]<400>60205]atgtacggtcgtaaaaaacgtcgtcagcgtcgtcgtatgg gtcatcacca tcatcatcac0206]atggtgaaagaactgcaggaaattcgtctg gggtcggactcagaagtcaa tcaagaagct0207]aagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat0208]ggatcttcagagatcttcttcaagatcaaa aagaccactcctttaagaag gctgatggaa0209]gcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatg gactccttaa gattcttgta cgacggtatt
120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1797
60 120 180 240 300
agaattcaagctgatcaggcccctgaagat
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gacctcgactacgactcggtgcagccgtat
cagcagcagcagcagagcgagctgcagccc
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ctcatttctgaagaggacttgttgcggaaa
cagctacgga actcttgtgc gtaa
<210>7
<211>78
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈220〉
<221>misc_feature
〈223〉引物
<400>7
cgacatatgtacggtcgtaa aaaacgtcgt
catcacatgg tgaaagaa
<210>8
<211>75
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈220〉
ttggacatgg aggataacga tattattgag360ctcaacgtta gcttcaccaa caggaactat420ttctactgcgacgaggaggagaacttctac480ccggcgcccagcgaggatatctggaagaaa540cctagccgccgctccgggctctgctcgccc600cggggagacaacgacggcggtggcgggagc660accgagctgctgggaggagacatggtgaac720accttcatcaaaaacatcatcatccaggac780aagctcgtctcagagaagctggcctcctac840aaccccgcccgcggccacagcgtctgctcc900gccgccgcctcagagtgcatcgacccctcg960agctcgcccaagtcctgcgcctcgcaagac1020ctgctctcctcgacggagtcctccccgcag1080gagacaccgcccaccaccagcagcgactct1140gatgttgtttctgtggaaaagaggcaggct1200tctgctggaggccacagcaaacctcctcac1260tccacacatcagcacaactacgcagcgcct1320aagagggtcaagttggacagtgtcagagtc1380accagccccaggtcctcggacaccgaggag1440gagcgccagaggaggaacgagctaaaacgg1500gagttggaaaacaatgaaaaggcccccaag1560atcctgtccgtccaagcagaggagcaaaag1620cgacgagaacagttgaaacacaaacttgaa16801704cagcgtcgtcgtatgggtcatcaccatcat60
<22 l>mi SC feature
<223>引物
<400>8
ctggcttagc ttcttgattg acttctgagt ccgaccccag acgaatttcc tgcagttctt60
tcaccatgtg atgat75
<2 10>9
<2l 1>75
<2 1 2>DNA
<213>人工序列
<220>
<22 l>mi SC feature
<223>引物
<400>9
caatcaagaa gctaagccag aggtcaagcc agaagtcaag cctgagactc acatcaattt60
aaaggtgtcc gatgg75
<210>10
<2l 1>75
<2 1 2>DNA
<213>人工序列
<220>
<22 l>mi SC feature
<223>引物
<400>10
catcagcctt cttaaaggag tggtcttttt gatcttgaag aagatctctg aagatccatc60
ggacaccttt aaatt75
<210>11
<211>110
<2 1 2>DNA
<213>人工序列
<220>
<22 l>mi SC feature
<223>引物
<400>11
ctcctttaag aaggctgatg gaagcgttcg ctaaaagaca gggtaaggaa atggactcct60
taagattctt gtacgacggt attagaattc aagctgatca ggcccctgaa110
<210>12
<2l 1>77
<2 1 2>DNA
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature <223>引物 <400>12
acctccaatc tgttcgcgat gagcctcaat aatatcgtta tcctccatgt ccaaatcttc 60
aggggcctga tcagctt77
<210>13
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature <223>引物 <400>13
atcgcgaaca gattggaggt atgcccctca acgttagctt c41
<210>14
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature <223>引物 <400>14
cgactcgagt tacgcacaag agttccgta29
<210>15
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature <223>引物 <400>15
atcgcgaaca gattggaggt atggctgtca gcgacgcgct40
<210>16 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<221>misc feature
<223> 引物<400>16cgactcgagt taaaaatgcc tcttcatgtg30<210>17<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>17atcgcgaaca gattggaggt atgagtgtgg atccagcttg40<210>18<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>18cgactcgagt cacacgtctt caggttgca29<210>19<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>19atcgcgaaca gattggaggt atggcgggac acctggcttc40<210>20<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>20cgactcgagt cagtttgaat gcatgggag29<210>21
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<210>22 <211>74 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<221>misc_feature <223>引物 <400>22
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<210>23
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<210>25<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>25cgaggtaccg agttctctgt tctataaac29<210>26<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>26cgacccgggc ctctcgtggt ctgcacaga29<210>27<211>120<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>27ccggtaccgg gttgtggcag ccagtcacgt gcccgccgcg tagccacaccagagcaatgt caagcggtca cgtgtgatag caacagatca cgtggctgcc<210>28<211>117<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>28atgaattccg gacgttctgg gcacgtgacc gccacccatg cgctgagggg cggacaggag 60gtgcttcgac tgggaggagg gcgaagagtg taagggggcg gaggggcgat ggcagcc117
tctgctcctc 60 atcgcccctc 120
權(quán)利要求
一種蛋白質(zhì)混合物，其特征在于，該蛋白質(zhì)混和物由C myc，SOX2，KLF4，OCT 4的融合蛋白組成，每一種融合蛋白的使用濃度為1ng/ml 1mg/ml；這些融合蛋白具有以下構(gòu)成PTD SUMO Protein；PTD是一個(gè)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)，代表HIV TAT，HSV VP22，AntP或者多聚精氨酸；SUMO是泛肽樣修飾物，代表酵母SMT3p或者其在各個(gè)物種的同源物，是融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞后被切割的識(shí)別區(qū)域；Protein是C myc，SOX2，KLF4或者OCT 4。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)混合物，其特征在于，所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)PTD為HIVTAT蛋 白的TAT PTD區(qū)域，或者其他具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的氨基酸序列；該蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)PTD使該蛋白 質(zhì)混合物能夠進(jìn)入人細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)混合物，其特征在于，所述泛肽樣修飾物SUMO為酵母 SMT3p，或者其他氨基酸序列，其三級(jí)結(jié)構(gòu)能被SUMO蛋白酶識(shí)別并切割，該泛肽樣修飾物 SUMO使蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)多肽能夠從融合蛋白切除。
4.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)混合物，其特征在于，在所述PTD和SUMO之間插入NES， 所述融合蛋白具有以下構(gòu)成=PTD-NES-SUMO-Protein, NES是一個(gè)可選的核運(yùn)出序列，決定 融合蛋白的細(xì)胞質(zhì)定位。
5.如權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)混合物，其特征在于，所述可選的核運(yùn)出序列NES為人 IkBa的核運(yùn)出序列，或者具有核運(yùn)出序列功能的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)混合物，其特征在于，所述PTD-NES-SUM0具有SEQID NO. 1所示的DNA序列，具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
7.如權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)混合物，其特征在于，所述PTD-NES-SUM0-S0X2具有SEQ ID NO. 3所示的DNA編碼序列；PTD-NES-SUM0-0CT-4具有SEQ ID NO. 4所示的DNA編碼序 列；PTD-NES-SUM0-KLF4 具有 SEQ ID N0. 5 所示的 DNA 編碼序列；PTD-NES-SUMO-C-myc 具有 SEQ ID N0. 6所示的DNA編碼序列。
8.如權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)混合物，其特征在于，所述PTD和NES之間插入6個(gè)組氨酸。
9.一種蛋白質(zhì)混合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)構(gòu)建PTD-NES-SUMO-Protein的表達(dá)質(zhì)粒首先，分別合成8段長為75bp且相互 間有20bp重疊的寡核苷酸引物，經(jīng)過三次重疊PCR，合成PTD-NES-SUM0 ；然后，從人胚胎干 細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增得到人OCT-4，S0X2, KLF4，C-myc cDNA，3，端含有XhoI位點(diǎn)，與合成的 TAT-NES-SUM0的順序通過PCR進(jìn)行組裝，獲得的產(chǎn)物克隆到pET_24a⑴載體的Ndel/Xhol 位點(diǎn)上；(2)篩選表達(dá)菌株將步驟(1)得到的PTD-NES-SUMO-Protein表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21宿 主菌中，小量培養(yǎng)篩選高表達(dá)克隆；(3)融合蛋白的大規(guī)模表達(dá)將表達(dá)菌種接種于瓶中，培養(yǎng)至0D0.6，加入IPTG誘導(dǎo)3 小時(shí)；(4)分離純化融合蛋白采用疏水層析和離子交換來分離純化上述融合蛋白。
10.一種如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)混合物在誘導(dǎo)人多功能干細(xì)胞中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛋白質(zhì)混合物，由C-myc，SOX2，KLF4，OCT-4的融合蛋白組成，每一種融合蛋白的使用濃度為1ng/ml-1mg/ml；融合蛋白中包含PTD(蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū))，SUMO(泛肽樣修飾物)與上述四種蛋白質(zhì)的融合。PTD的融合使得融合蛋白能夠進(jìn)入細(xì)胞。融合的SUMO使得融合蛋白在進(jìn)入細(xì)胞后能被切割，去除融合的PTD、SUMO。此外，本發(fā)明還公開了上述蛋白質(zhì)混合物的制備方法。這種具有生物活性的蛋白質(zhì)混合物，有可能應(yīng)用于體外誘導(dǎo)人多功能干細(xì)胞，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/19GK101993495SQ20091005774
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月12日
發(fā)明者丁劍鋒, 劉程, 梁巖, 蔡麗君, 趙智祥 申請人:上海近岸科技有限公司