用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的多肽混合物等電聚焦分離方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的多肽混合物等電聚焦分離方法，先將生物樣品的總蛋白質(zhì)混合物全部酶切成較短的肽段混合物，使用肽段等電聚焦緩沖液復(fù)溶肽段混合物，再采用上樣杯上樣方式進(jìn)行等電聚焦電泳，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜肽段混合物的有效分離。最后，將各個(gè)槽中預(yù)分離的多肽混合物取出脫鹽用于質(zhì)譜分析，便能獲得比傳統(tǒng)方法更多數(shù)量的多肽信號(hào)、更高的肽段覆蓋率和蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量。本發(fā)明方法精確、高效、費(fèi)用低，可用于各種生物樣品總蛋白質(zhì)的多維液相色譜-質(zhì)譜鑒定技術(shù)體系，可以替代傳統(tǒng)的離子交換色譜預(yù)分離方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)肽段混合物的高效預(yù)分離，避免了肽段的丟失。據(jù)此，還可建立高覆蓋率的蛋白質(zhì)組表達(dá)譜信息。
【專利說(shuō)明】用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的多肽混合物等電聚焦分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)組學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的多肽混合物等電聚焦分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)和功能分子，是生命活動(dòng)的執(zhí)行者和生命現(xiàn)象的體現(xiàn)者。蛋白質(zhì)組是指一種細(xì)胞或一種組織內(nèi)的基因在特定條件下表達(dá)的所有蛋白質(zhì)，對(duì)于這些蛋白質(zhì)的分析和鑒定研究稱為蛋白質(zhì)組學(xué)。
[0003]目前，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法主要有兩類，分別是雙向電泳(Two-dimensionalpolyacrylamide gel electrophoresis, 2DE)技術(shù)和多維液相色譜(Mult1-dimensionalliquid chromatography,MDLC)技術(shù)。雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)是目前廣泛應(yīng)用的經(jīng)典蛋白質(zhì)研究途徑，先將復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行膠上分離，再將凝膠上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)切下，用胰蛋白酶進(jìn)行膠內(nèi)酶切后，用質(zhì)譜儀測(cè)定肽質(zhì)量指紋圖譜，最后對(duì)這些肽數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索而鑒定蛋白質(zhì)信息。至今因其能夠獨(dú)立地分離大量蛋白而廣泛用于蛋白質(zhì)組的定量和分離中，并能夠比較和測(cè)量出細(xì)胞中生理狀態(tài)、疾病狀態(tài)時(shí)的差異蛋白質(zhì)。然而，以2DE為基礎(chǔ)的蛋白組學(xué)研究方法仍有其技術(shù)上的局限性，主要表現(xiàn)在以下幾方面:
[0004](I)在雙向凝膠電泳圖譜上，并非每個(gè)蛋白點(diǎn)所包含的蛋白量都足以用于鑒定蛋白；
[0005](2)實(shí)驗(yàn)的操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性較差；
[0006](3 )對(duì)于強(qiáng)酸性蛋白、強(qiáng)堿性蛋白、疏水性蛋白和低豐度蛋白，2D-PAGE尚不能將其很好地檢測(cè)出來(lái)
[0007](4) 2D-PAGE不能在線與質(zhì)譜連接以達(dá)到高效的蛋白分離和鑒定水平。
[0008]鑒于雙向凝膠電泳的一些不足，高效液相色譜技術(shù)作為其補(bǔ)充方法應(yīng)運(yùn)而生，特別是各種模式色譜聯(lián)用組成的多維色譜分離技術(shù)。此方法用胰蛋白酶把蛋白質(zhì)混合物樣品全部酶切成多肽，再利用多維分離技術(shù)將肽段細(xì)分成多個(gè)組分，送入電噴霧質(zhì)譜中實(shí)現(xiàn)鑒定蛋白質(zhì)的目的。這種技術(shù)具備高分辨率、高重現(xiàn)性及能夠與質(zhì)譜良好兼容等特點(diǎn)。
[0009]MDLC中目前較為廣泛應(yīng)用的方法主要是二步正交:即第一維不固定，第二維采用反相液相色譜(RP-LC)直接耦聯(lián)質(zhì)譜(2D-LC-MS)。RP-LC因其高效的分離能力、無(wú)鹽以及便于后續(xù)處理而常作為多維分離體系中的最后一維。第一維預(yù)分離常用離子交換色譜(1n-Exchange Chromatography, IEC)、體積排阻色譜(Size Exclusion Chromatography,SEC)、親和色譜(Affinity Chromatography, AC)等模式。然而，多肽混合物在實(shí)施第一維分離時(shí)，采用這些模式，會(huì)隨著流動(dòng)相的洗脫而導(dǎo)致部分多肽丟失，影響到低豐度蛋白質(zhì)的檢出。為了解決肽段丟失的問(wèn)題，需要對(duì)第一維的預(yù)分離新方法進(jìn)行探索。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種簡(jiǎn)便、高效的用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的多肽混合物等電聚焦分離方法，可替代傳統(tǒng)的離子交換色譜預(yù)分離方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)肽段混合物的高效預(yù)分離，避免了肽段的丟失。
[0011]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的多肽混合物等電聚焦分離方法，先將生物樣品的總蛋白質(zhì)混合物全部酶切成較短的肽段混合物，使用肽段等電聚焦緩沖液復(fù)溶肽段混合物，再采用上樣杯上樣方式進(jìn)行等電聚焦電泳。
[0012]上述用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的多肽混合物等電聚焦分離方法，包括以下步驟:
[0013](I)取細(xì)胞總蛋白質(zhì)樣品100微克，使用40mM碳酸氫銨溶解，分別加入40mM 二硫蘇糖醇和IOOmM碘乙酰胺進(jìn)行還原和烷基化處理后，按質(zhì)量比25:1加入4微克測(cè)序級(jí)胰蛋白酶(Trypsin)，在37°C酶解12小時(shí)，將所有蛋白質(zhì)酶切成16-25個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多肽，得到多肽混合物；
[0014](2)將步驟(I)所得多肽混合物在真空濃縮儀中抽干后，再加入200微升肽段等電聚焦緩沖液復(fù)溶；
[0015](3)將步驟(2)中復(fù)溶的多肽混合物用于等電聚焦電泳儀電泳，以干膠條和上樣杯組合方式上樣；
[0016](4)在等電聚焦電泳儀中進(jìn)行多肽混合物電泳。
[0017]根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的多肽混合物等電聚焦分離方法，其特征在于:步驟(2)中所述加肽段等電聚焦緩沖液是含有7M尿素的水溶液，并添加
0.5%pH3-10兩性電解質(zhì)緩沖液(IPG buffer)。
[0018]步驟(3)中所述上樣是以13cm pH3_10IPG膠條作為聚焦底座，用上樣杯壓蓋膠條形成獨(dú)立上樣口的杯上樣方式，膠條上不覆蓋石蠟油。
[0019]步驟(4)中電泳參數(shù)為①500v，3h ;@ 8000v，4h。
[0020]上述用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的多肽混合物等電聚焦分離方法，還包括以下步驟:
[0021](5)步驟(4)的電泳程序完成后，將上樣杯內(nèi)12個(gè)槽中的液體分別取出，轉(zhuǎn)移至新離心管中；
[0022](6)步驟(5)中收集得到的12份預(yù)分離多肽溶液使用ZipTip C18脫鹽槍頭除鹽，真空濃縮儀抽干；
[0023](7)步驟(6)中抽干后的多肽使用easy-nLClOOO納升液相色譜分離，色譜柱為C18毛細(xì)管反相分離柱，再次分離后的肽段送入LTQ-Orbitrap質(zhì)譜中采集信號(hào)，進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定
[0024]針對(duì)多維液相色譜預(yù)分離時(shí)肽段丟失的問(wèn)題，發(fā)明人建立了一種用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的多肽混合物等電聚焦分離方法，先通過(guò)溶液酶解方式將所有蛋白質(zhì)混合物酶解成肽段混合物，避免蛋白質(zhì)在后續(xù)處理過(guò)程中的降解，使用高效而簡(jiǎn)化肽段等電聚焦緩沖液復(fù)溶肽段混合物，以實(shí)現(xiàn)肽段的全部溶解；再采用上樣杯上樣方式，并合理設(shè)置等電聚焦電泳參數(shù)，實(shí)現(xiàn)多肽混合物根據(jù)其等電點(diǎn)不同在高壓電場(chǎng)作用下自由遷移至上樣杯的各個(gè)槽中，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜肽段混合物的有效分離。最后，將各個(gè)槽中預(yù)分離的多肽混合物取出脫鹽用于質(zhì)譜分析，便能獲得比傳統(tǒng)方法更多數(shù)量的多肽信號(hào)、更高的肽段覆蓋率和蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量。本發(fā)明方法精確、高效、費(fèi)用低，可用于各種生物樣品總蛋白質(zhì)的多維液相色譜-質(zhì)譜鑒定技術(shù)體系，可以替代傳統(tǒng)的離子交換色譜預(yù)分離方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)肽段混合物的高效預(yù)分離，避免了肽段的丟失。據(jù)此，還可建立高覆蓋率的蛋白質(zhì)組表達(dá)譜信息?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1是本發(fā)明中上樣杯上樣方式和等電聚焦原理的示意圖，圖中:1上樣杯架，213cm干膠條(pH3-10)，3上樣杯杯蓋，4高壓等電聚焦。
【具體實(shí)施方式】
[0026]實(shí)施例1
[0027]以下所用的試劑乙腈、水、甲酸都是色譜純，購(gòu)自Sigma-Aldrich試劑公司；質(zhì)譜級(jí)胰蛋白酶購(gòu)自Promega公司；干膠條和上樣杯購(gòu)自Bio-Rad公司；質(zhì)譜儀是線性離子講一靜電場(chǎng)軌道講組合式質(zhì)譜儀(Thermo LTQ-Orbitrap Elite)。
[0028](I)水牛精子超聲波破碎后，加入裂解液(7M尿素、2%CHAPS、0.5%DTT和0.5%PMSF)消化提取總蛋白質(zhì)，離心去除細(xì)胞碎片其他雜質(zhì)，棄掉下層細(xì)胞碎片；
[0029](2)取上述提取的上清液500 μ L，加入1.5mL預(yù)冷丙酮沉淀過(guò)夜，12000rpm離心Ih,丟棄上清，將沉淀用100 μ L的40mM碳酸氫銨(NH4HCO3)復(fù)溶；
[0030](3)分別加入10yL40mM 二硫蘇糖醇(DTT)和10 μ LlOOmM碘乙酰胺(IAA)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行還原和烷基化處理；
[0031](4)按1:25的比例,加入4 μ g質(zhì)譜級(jí)胰蛋白酶(Trypsin)至上述蛋白質(zhì)溶液中，37°C 酶切 12h ；
[0032](5)酶切后肽段真空抽干，使NH4HCO3完全揮發(fā)；
[0033](6)在等電聚焦緩沖液(7M尿素、2%CHAPS、0.5%DTT)中按0.5%比例加入兩性電解質(zhì)(IPG Buffer pH3_10，購(gòu)自 GE Healthcare 公司，貨號(hào) 17-6004-40)，取 200 μ L 復(fù)溶肽段混合物；
[0034](7)使用13cm IPG膠條(pH3_10)作為聚焦底座，在膠條上蓋壓上樣杯，形成獨(dú)立的、隔離的上樣口(如圖l_a所示)，膠條上不覆蓋石蠟油；
[0035](8)將步驟(6)所述的復(fù)溶肽段混合物均勻加入12個(gè)上樣口中，蓋上上樣杯蓋(如圖l_b所示)，此時(shí)，肽段混合物均勻的分布于各個(gè)上樣口內(nèi)；
[0036](9)執(zhí)行以下等電聚焦程序:①500v，3h ;@8000v，4h ;在高壓電場(chǎng)的作用下，多肽混合物會(huì)穿過(guò)底層的膠條，根據(jù)其等電點(diǎn)的不同，逐步遷移至其合適的上樣口內(nèi)(如圖1-c所示)；
[0037](8)電泳結(jié)束后，多肽將在各個(gè)上樣口內(nèi)重新定位(如圖Ι-d所示)，將各個(gè)上樣口中的液體轉(zhuǎn)移至新EP管中，用于脫鹽處理；
[0038](9)將步驟(8)所得溶液濃縮至20yL左右，用微量碳18反相色譜吸附柱(C18ZipTip, Millipore公司)脫鹽處理，去除多肽混合液的小分子無(wú)機(jī)鹽和其他雜質(zhì)；
[0039](10)將步驟(9)得到的脫鹽后的12個(gè)樣品用真空濃縮儀抽干，用反相色譜的A相(2%乙腈+0.1%甲酸水溶液)復(fù)溶，用于液質(zhì)聯(lián)用分析(LC-MS);色譜柱:C18反相毛細(xì)管柱；流動(dòng)相A:2%乙腈+0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B:98%乙腈+0.1%甲酸水溶液。
[0040](11)質(zhì)譜條件:電噴霧電壓1.5kV,采用一級(jí)模式、Orbitrap檢測(cè)全譜,掃描分辨率為60000 ;質(zhì)量掃描范圍是m/z=350-1800 ; 10個(gè)LTQ 二級(jí)質(zhì)譜用CID碰撞模式完成，二級(jí)掃描分辨率為60000 ;串聯(lián)質(zhì)譜CID碰撞能量是35%歸一化能量，數(shù)據(jù)依賴的自動(dòng)化模式采集信號(hào)；采用Xcalibular軟件自動(dòng)進(jìn)樣。
[0041](12)所有的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò)搜索引擎SEQUEST (Protein Discovery軟件)進(jìn)行搜索，檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為牛屬(Bovine)數(shù)據(jù)庫(kù)，為減少假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)，用以上數(shù)據(jù)庫(kù)的反庫(kù)驗(yàn)證。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索參數(shù)設(shè)置如下=Trypsin酶切；最大2個(gè)漏切位點(diǎn)；一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量范圍IOppm ;二級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量偏差20mmu,可變修飾為:半胱氨酸碘乙酰胺化Carbamidomethyl(+57Da),甲硫氨酸氧化Oxsidation (+15.995Da)、人工確認(rèn)匹配二級(jí)圖譜減少錯(cuò)配率。最后鑒定得到蛋白質(zhì)數(shù)量為1148種(部分蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)如表I所示)。將該方法獲得的數(shù)據(jù)與常規(guī)方法(二維液相色譜分離結(jié)合質(zhì)譜分析方法)相比，常規(guī)方法在鑒定蛋白質(zhì)的數(shù)量為834種，平均肽段覆蓋率為36%，均低于本方法的鑒定蛋白質(zhì)數(shù)量1148種和45%的平均肽段覆蓋率。
[0042]表I鑒定得到蛋白質(zhì)的部分信息
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的多肽混合物等電聚焦分離方法，其特征在于:先將生物樣品的總蛋白質(zhì)混合物全部酶切成較短的肽段混合物，使用肽段等電聚焦緩沖液復(fù)溶肽段混合物，再采用上樣杯上樣方式進(jìn)行等電聚焦電泳。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的多肽混合物等電聚焦分離方法，其特征在于包括以下步驟: (1)取細(xì)胞總蛋白質(zhì)樣品100微克，使用40mM碳酸氫銨溶解，分別加入40mM二硫蘇糖醇和IOOmM碘乙酰胺進(jìn)行還原和烷基化處理后，按質(zhì)量比25:1加入4微克測(cè)序級(jí)胰蛋白酶，在37°C酶解12小時(shí)，將所有蛋白質(zhì)酶切成16-25個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多肽，得到多肽混合物； (2)將步驟(I)所得多肽混合物在真空濃縮儀中抽干后，再加入200微升肽段等電聚焦緩沖液復(fù)溶； (3)將步驟(2)中復(fù)溶的多肽混合物用于等電聚焦電泳儀電泳，以干膠條和上樣杯組合方式上樣； (4 )在等電聚焦電泳儀中進(jìn)行多肽混合物電泳。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的多肽混合物等電聚焦分離方法，其特征在于:步驟(2)中所述加肽段等電聚焦緩沖液是含有7M尿素的水溶液，并添加0.5%pH3-10兩性電解質(zhì)緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的多肽混合物等電聚焦分離方法，其特征在于:步驟(3)中所述上樣是以13cm PH3-10IPG膠條作為聚焦底座，用上樣杯壓蓋膠條形成獨(dú)立上樣口的杯上樣方式，膠條上不覆蓋石蠟油。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的多肽混合物等電聚焦分離方法，其特征在于:步驟(4)中電泳參數(shù)為①500v，3h ;@8000v，4h。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的多肽混合物等電聚焦分離方法，其特征在于還包括以下步驟: (5)步驟(4)的電泳程序完成后，將上樣杯內(nèi)12個(gè)槽中的液體分別取出，轉(zhuǎn)移至新離心管中； (6)步驟(5)中收集得到的12份預(yù)分離多肽溶液使用ZipTipC18脫鹽槍頭除鹽，真空濃縮儀抽干； (7)步驟(6)中抽干后的多肽使用easy-nLClOOO納升液相色譜分離，色譜柱為C18毛細(xì)管反相分離柱，再次分離后的肽段送入LTQ-Orbitrap質(zhì)譜中采集信號(hào)，進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。
【文檔編號(hào)】G01N27/62GK103926301SQ201410153861
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月17日
【發(fā)明者】付強(qiáng), 岑衛(wèi)健, 朱平川 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)