一種兩維短梯度高效蛋白質(zhì)組分離鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種兩維短梯度高效蛋白質(zhì)組分離鑒定技術(shù)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)組分離鑒定方法，包括以下步驟：1）從離體的細(xì)胞或組織中提取蛋白質(zhì)混合物；2）采用蛋白酶將待分離鑒定的蛋白質(zhì)混合物酶切成肽段混合物；3）將酶切獲得的肽段混合物進(jìn)行高溫高pH短梯度反相色譜分離，反相色譜采用的柱溫為30℃-80℃，采用流動(dòng)相pH為7-12，有效梯度時(shí)間僅為26分鐘；收集餾分，并對餾分進(jìn)行干燥濃縮；4）將步驟3）獲得的干燥濃縮樣本復(fù)溶后，采用低pH短梯度反相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行鑒定，反相色譜采用的流動(dòng)相的pH值為2-5，有效梯度時(shí)間僅為30分鐘。本發(fā)明的方法在6-24小時(shí)內(nèi)，假陽性率低于1％條件下，實(shí)現(xiàn)對6000-9000個(gè)蛋白質(zhì)的分析鑒定。
【專利說明】一種兩維短梯度高效蛋白質(zhì)組分離鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種兩維短梯度高效蛋白質(zhì)組分離鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)組學(xué)不僅研究特定細(xì)胞、組織、體液及亞結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)的組成和表達(dá)變化，而且還研究蛋白質(zhì)異構(gòu)體、翻譯后修飾及其相互作用及功能等，其中蛋白質(zhì)組與基因組的對接是一項(xiàng)重要研究內(nèi)容，但其前提之一是實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)組的高覆蓋率鑒定，而采用何種蛋白質(zhì)組學(xué)分析策略是實(shí)現(xiàn)上述研究的關(guān)鍵。目前，有兩種蛋白質(zhì)組學(xué)分析策略:一是基于凝膠電泳分離-質(zhì)譜鑒定的技術(shù)策略；二是高效液相色譜分離-質(zhì)譜鑒定的技術(shù)策略。隨著蛋白質(zhì)組技術(shù)的發(fā)展，基于多維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組研究中的主流技術(shù)，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組表達(dá)、修飾及蛋白復(fù)合物等的研究中。這種分析技術(shù)的改進(jìn)有助于提高蛋白質(zhì)組的鑒定覆蓋率。
[0003]由于生物樣本中蛋白質(zhì)組成的高度復(fù)雜性，在多維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用過程中，質(zhì)譜分析時(shí)的離子抑制效應(yīng)和質(zhì)譜掃描速度的限制，致使許多肽段不能被檢出，嚴(yán)重影響了蛋白質(zhì)組的鑒定覆蓋率。為了解決這個(gè)問題，已經(jīng)發(fā)展了多種提高蛋白質(zhì)/多肽分離和質(zhì)譜檢測效率的方法。例如，在分離部分采用離子交換-反相液相色譜分離技術(shù)、超長梯度分離技術(shù)和超長色譜柱分離等；在質(zhì)譜鑒定部分采用高霧化效率離子源、多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分段掃描等。雖然這些方法可有效提高蛋白質(zhì)組鑒定的覆蓋率，但它們存在一個(gè)共同的缺點(diǎn)，就是需要較長的分析時(shí)間，嚴(yán)重影響了生物樣本分析的通量和效率。因此有必要建立一種快速高效的蛋白質(zhì)組分離鑒定技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種快速高效蛋白質(zhì)組分離鑒定技術(shù)。
[0005]本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)組分離鑒定方法，如圖1所示，包括以下步驟:
[0006]I)從離體的細(xì)胞或組織中提取蛋白質(zhì)混合物；
[0007]2)采用蛋白酶將待分離鑒定的蛋白質(zhì)混合物酶切成肽段混合物；
[0008]3)將酶切獲得的肽段混合物進(jìn)行高溫高pH短梯度反相色譜分離，收集餾分，并對餾分進(jìn)行干燥濃縮；
[0009]4)將步驟3)獲得的干燥濃縮樣本復(fù)溶后，采用低pH短梯度反相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行鑒定。
[0010]所述步驟I)從細(xì)胞或組織中提取蛋白質(zhì)混合物的提取方法為:利用6?SM尿素溶液將細(xì)胞或組織混懸后，在冰浴上超聲提取蛋白質(zhì)混合物；
[0011]所述步驟2)蛋白酶切方法為:使用TrypsiruGluC或Lys-C中的一種或兩種以上蛋白酶任意組合對蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行酶切。
[0012]所述步驟3)中，所述高溫高pH短梯度反相色譜分離的流動(dòng)相pH值為pH 7-12 ；所述柱溫為30°C -80°C，優(yōu)選為60°C。[0013]具體的，所述高溫高pH短梯度反相色譜分離采用的流動(dòng)相A為pH 7-12的2%乙腈水溶液(體積百分比濃度，下同；用氨水調(diào)節(jié)PH值)，具體可以為pH 10的2%的乙腈水溶液，流動(dòng)相B為pH 7-12的98%乙腈水溶液(用氨水調(diào)節(jié)pH值)，具體可以為pH 10的98%的乙腈水溶液。
[0014]反相色譜分離柱填料粒徑為1.9-5 μ m,填料孔徑為10_50nm，反相色譜分離柱長度為 50-500mm。
[0015]有效梯度時(shí)間最低為26分鐘，具體設(shè)置為:1)流動(dòng)相B的起始含量為(O~5)%，終止含量為(8~10) %，梯度時(shí)間為2~5分鐘；2)流動(dòng)相B的起始含量為(8~10) %,終止含量為(18~25) %，梯度時(shí)間為11~14分鐘；3)流動(dòng)相B的起始含量為(18~25)%，終止含量為(32~45)%，梯度時(shí)間為9~12分鐘；4)流動(dòng)相B的起始含量為(32~45) %，終止含量為95%，梯度時(shí)間為I~4分鐘；5)流動(dòng)相B的含量始終為95%，梯度時(shí)間為I~4分鐘；6)流動(dòng)相B的起始含量為95%，終止含量為5%，梯度時(shí)間為2~5分鐘；所述％表示體積百分比濃度。
[0016]所述高溫高pH短梯度反相色譜分離采用的流速為0.2-1.5mL/min，紫外檢測波長為 214nm。[0017]所述步驟4)中，所述低pH短梯度反相色譜分離采用的流動(dòng)相A為pH 2-5的2%乙腈水溶液(用甲酸調(diào)節(jié)PH值)，流動(dòng)相B為pH 2-5的98%乙腈水溶液(用甲酸調(diào)節(jié)pH值)。
[0018]反相色譜分離柱填料粒徑為1.9-5 μ m，填料孔徑為10_50nm，反相色譜分離柱長度為 50-500mm。流速為 100-500nL/min。
[0019]根據(jù)第一維餾分的收集先后順序，如圖2所示，進(jìn)行針對性梯度設(shè)置，根據(jù)步驟3)獲得的餾分集先后順序，每四個(gè)餾分分成一組，即第1-4餾分、5-8餾分、9-12餾分，……以此類推；采用的梯度設(shè)置為:在第0-4分鐘的梯度時(shí)間內(nèi)，流動(dòng)相B的初始含量均為0，流動(dòng)相B的終止含量按照分組順序依次為4%、6%、8%……以此類推；在第4-25分鐘的梯度時(shí)間內(nèi)，流動(dòng)相B的初始含量按照分組順序依次為4%、6%、8%……以此類推，流動(dòng)相B的終止含量按照分組順序依次為14%、16%、18%……以此類推；在第25-30分鐘的梯度時(shí)間內(nèi)，流動(dòng)相B的初始含量按照分組順序依次為14%、16%、18%……以此類推，流動(dòng)相B的終止含量均為30% ;所述％表示體積百分比濃度。有效梯度時(shí)間僅為30分鐘。如圖3所示，所述質(zhì)譜鑒定系采用電噴霧質(zhì)譜儀進(jìn)行分析鑒定。
[0020]本發(fā)明方法的特征在于對復(fù)雜生物蛋白質(zhì)組的儀器分析效率達(dá)到6-24小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)在假陽性率低于I %時(shí)，對6000-9000個(gè)蛋白質(zhì)的分析鑒定。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明方法的技術(shù)路線圖
[0022]圖2為實(shí)施例1獲得的樣品的梯度設(shè)置示意圖和總離子流色譜圖
[0023]圖3為實(shí)施例2獲得的樣品的總離子流色譜圖
[0024]圖4為實(shí)施例3獲得的樣品的總離子流色譜圖
【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1[0026]將Hela細(xì)胞混懸于8M尿素溶液，在冰浴上超聲提取蛋白質(zhì)混合物，并使用Trypsin進(jìn)行酶切，得到其肽段混合物。
[0027]將從Hela細(xì)胞中提取的400 μ g蛋白混和物酶切后，進(jìn)行一維反相色譜分離，采用的流動(dòng)相A為pH 10的2%乙腈水溶液(用氨水調(diào)節(jié)pH值)，流動(dòng)相B為pH 10的98%乙腈水溶液(用氨水調(diào)節(jié)pH值)。Durashell反相色譜分離柱購自Agela公司，反相色譜分離柱填料粒徑為5 μ m,填料孔徑為15nm,反相色譜分離柱為4.6 X 250_。梯度設(shè)置為第一梯度:流動(dòng)相B的初始含量為5%，終止含量為8%，梯度時(shí)間為2分鐘；第二梯度:流動(dòng)相B的初始含量為8%，終止含量為18%，梯度時(shí)間為11分鐘；第三梯度:流動(dòng)相B的初始含量為18%，終止含量為32%，梯度時(shí)間為9分鐘；第四梯度:流動(dòng)相B的初始含量為32%，終止含量為95%，梯度時(shí)間為I分鐘；第五梯度:流動(dòng)相B的含量始終為95%，梯度時(shí)間為I分鐘；第六梯度:流動(dòng)相B的初始含量為95% B，終止含量為5%，梯度時(shí)間為2分鐘。流速為1.5mL/min,紫外檢測波長為214nm，柱溫為60°C。從第2分鐘開始收集餾分，共得到24個(gè)餾分。并用Savant SPD 2010真空離心干燥機(jī)(Thermo公司)對餾分進(jìn)行濃縮干燥，干燥溫度設(shè)置為45°C，至餾分完全干燥。上述％表示體積百分比濃度。
[0028]將獲得的干燥濃縮餾分用pH 3的2%乙腈水溶液復(fù)溶后，依次進(jìn)行低pH反相色譜分離-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜采集和分析。低PH反相色譜分離采用的流動(dòng)相A為pH 3的2%乙腈水溶液(用甲酸調(diào)節(jié)PH值)，流動(dòng)相B為pH 3的98%乙腈水溶液(用甲酸調(diào)節(jié)pH值)。反相色譜分離柱采用C18反相硅膠填料，反相色譜分離柱填料粒徑為3 μ m，填徑為30nm，反相色譜分離柱為75 μ mX 150mm。流速為380nL/min。根據(jù)上述懼分的收集先后順序,進(jìn)行針對性梯度設(shè)置(如圖2所示)，每四個(gè)餾分分成一組，即第1-4餾分、5-8餾分、9-12餾分，……以此類推；采用的梯 度設(shè)置為:在第0-4分鐘的梯度時(shí)間內(nèi)，流動(dòng)相B的初始含量均為0，流動(dòng)相B的終止含量按照分組順序依次為4%、6%、8%……以此類推；在第4-25分鐘的梯度時(shí)間內(nèi)，流動(dòng)相B的初始含量按照分組順序依次為4%、6%、8%……以此類推，流動(dòng)相B的終止含量按照分組順序依次為14%、16%、18%……以此類推；在第25-30分鐘的梯度時(shí)間內(nèi)，流動(dòng)相B的初始含量按照分組順序依次為14%、16%、18%……以此類推，流動(dòng)相B的終止含量均為30% ;上述％表示體積百分比濃度。質(zhì)譜采集系統(tǒng)為5600Q-T0F質(zhì)譜儀(美國AppliedBiosystems公司)，掃描采用數(shù)據(jù)依賴模式:進(jìn)行一個(gè)全掃描(掃描范圍m/ζ 350-1250),選擇最強(qiáng)的50個(gè)母離子進(jìn)行二級掃描(信號閾值為120cps)。電噴霧電壓1800V，正離子模式。得到的總離子流色譜圖如圖2所示。24個(gè)餾分經(jīng)采集分析后，在假陽性率低于I %時(shí)，12小時(shí)(30分鐘*24個(gè)餾分)共鑒定到8035個(gè)蛋白質(zhì)。
[0029]實(shí)施例2
[0030]C57小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將從小鼠肝臟得到的細(xì)胞核提取物混懸于SM尿素溶液，在冰浴上超聲提取其蛋白質(zhì)混合物，并使用Trypsin進(jìn)行酶切，得到其肽段混合物。
[0031]將鼠肝細(xì)胞核提取的400 μ g蛋白混和物酶切后，進(jìn)行一維反相色譜分離，采用的流動(dòng)相A為pH 10的2%乙腈水溶液(用氨水調(diào)節(jié)pH值)，流動(dòng)相B為pH 10的98%乙腈水溶液(用氨水調(diào)節(jié)pH值)。Durashell反相色譜分離柱購自Agela公司，反相色譜分離柱填料粒徑為5 μ m，填料孔徑為15nm，反相色譜分離柱為4.6 X 250_。梯度設(shè)置為第一梯度:流動(dòng)相B的初始含量為5%，終止含量為8%，梯度時(shí)間為2分鐘；第二梯度:流動(dòng)相B的初始含量為8%，終止含量為18%，梯度時(shí)間為11分鐘；第三梯度:流動(dòng)相B的初始含量為18%，終止含量為32%，梯度時(shí)間為9分鐘；第四梯度:流動(dòng)相B的初始含量為32%，終止含量為95%，梯度時(shí)間為I分鐘；第五梯度:流動(dòng)相B的含量始終為95%，梯度時(shí)間為I分鐘；第六梯度:流動(dòng)相B的初始含量為95%，終止含量為5%，梯度時(shí)間為2分鐘。流速為1.5mL/min，紫外檢測波長為214nm，柱溫為60°C。從第2分鐘開始收集餾分，共得到24個(gè)餾分。并用SavantSro 2010真空離心干燥機(jī)(Thermo公司)對餾分進(jìn)行濃縮干燥，干燥溫度設(shè)置為450C，至餾分完全干燥。上述％表示體積百分比濃度。
[0032]將獲得的干燥濃縮餾分用pH 3的2%乙腈水溶液復(fù)溶后，依次進(jìn)行低pH反相色譜分離-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜采集和分析。低PH反相色譜分離采用的流動(dòng)相A為pH 3的2%乙腈水溶液(用甲酸調(diào)節(jié)PH值)，流動(dòng)相B為pH 3的98%乙腈水溶液(用甲酸調(diào)節(jié)pH值)。反相色譜分離柱采用C18反相硅膠填料，填料粒徑為3 μ m，填料孔徑為30nm，反相色譜分離柱為75 μ mX 150mm。流速為300nL/min。根據(jù)上述餾分的收集先后順序，進(jìn)行針對性梯度設(shè)置，即第1-4餾分、5-8餾分、9-12餾分，……以此類推；采用的梯度設(shè)置為:在第0-4分鐘的梯度時(shí)間內(nèi)，流動(dòng)相B的初始含量均為0，流動(dòng)相B的終止含量按照分組順序依次為4%、6%、8%……以此類推；在第4-25分鐘的梯度時(shí)間內(nèi)，流動(dòng)相B的初始含量按照分組順序依次為4%、6%、8%……以此類推，流動(dòng)相B的終止含量按照分組順序依次為14%、16%、18%……以此類推；在第25-30分鐘的梯度時(shí)間內(nèi)，流動(dòng)相B的初始含量按照分組順序依次為14%、16%, 18%……以此類推，流動(dòng)相B的終止含量均為30% ;上述％均表示體積百分比濃度。質(zhì)譜采集系統(tǒng)為線性軌道離子講質(zhì)譜儀(LTQ-Orbitrap-Velos, Thermo公司)，掃描采用數(shù)據(jù)依賴模式:進(jìn)行一個(gè)全掃描(掃描范圍m/z 350-2000)，選擇最強(qiáng)的20個(gè)母離子進(jìn)行二級掃描(信號閾值為1000)。電噴霧電壓1700V，正離子模式。得到的總離子流色譜圖如圖3所示。24個(gè)餾分經(jīng)采集分析后，在假陽性率低于1%時(shí)，12小時(shí)(30分鐘*24個(gè)餾分)共鑒定到6684個(gè)蛋白質(zhì)。
[0033]實(shí)施例3
[0034]將Hela細(xì)胞混懸于SM尿素`溶液，在冰浴上超聲提取蛋白質(zhì)混合物，并使用Trypsin進(jìn)行酶切，得到其肽段混合物。
[0035]將從Hela細(xì)胞中提取的400 μ g蛋白混和物酶切后，進(jìn)行一維反相色譜分離，采用的流動(dòng)相A為pH 10的2%乙腈水溶液(用氨水調(diào)節(jié)pH值)，流動(dòng)相B為pH 10的98%乙腈水溶液(用氨水調(diào)節(jié)pH值)。Durashell反相色譜分離柱購自Agela公司，反相色譜分離柱填料粒徑為5 μ m,填料孔徑為15nm,反相色譜分離柱為4.6 X 250_。梯度設(shè)置為第一梯度:流動(dòng)相B的初始含量為5%，終止含量為8%，梯度時(shí)間為2分鐘；第二梯度:流動(dòng)相B的初始含量為8%，終止含量為18%，梯度時(shí)間為11分鐘；第三梯度:流動(dòng)相B的初始含量為18%，終止含量為32%，梯度時(shí)間為9分鐘；第四梯度:流動(dòng)相B的初始含量為32%，終止含量為95%，梯度時(shí)間為I分鐘；第五梯度:流動(dòng)相B的含量始終為95%，梯度時(shí)間為I分鐘；第六梯度:流動(dòng)相B的初始含量為95% B，終止含量為5%，梯度時(shí)間為2分鐘。流速為1.5mL/min，紫外檢測波長為214nm，柱溫為60°C。從第2分鐘開始收集餾分，共得到24個(gè)餾分。并用Savant SPD 2010真空離心干燥機(jī)(Thermo公司)對餾分進(jìn)行濃縮干燥，干燥溫度設(shè)置為45°C，至餾分完全干燥。上述％均表示體積百分比濃度。
[0036]將獲得的每個(gè)干燥濃縮餾分用pH 3的2%乙腈水溶液復(fù)溶后，分為等量的兩份樣品，依次進(jìn)行低PH反相色譜分離-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜采集和分析。低pH反相色譜分離采用的流動(dòng)相A為pH 3的2%乙腈水溶液(用甲酸調(diào)節(jié)pH值)，流動(dòng)相B為pH 3的98%乙腈水溶液(用甲酸調(diào)節(jié)PH值)。反相色譜分離柱采用C18反相硅膠填料，反相色譜分離柱填料粒徑為3 μ m,填徑為30nm,反相色譜分離柱為75 μ mX 150mm。流速為380nL/min。根據(jù)上述懼分的收集先后順序，進(jìn)行針對性梯度設(shè)置(如圖2所示)，每四個(gè)餾分分成一組，即第1-4餾分、5-8餾分、9-12餾分，……以此類推；采用的梯度設(shè)置為:在第0-4分鐘的梯度時(shí)間內(nèi)，流動(dòng)相B的初始含量均為0，流動(dòng)相B的終止含量按照分組順序依次為4%、6%、8%……以此類推；在第4-25分鐘的梯度時(shí)間內(nèi)，流動(dòng)相B的初始含量按照分組順序依次為4%、6%、8%……以此類推，流動(dòng)相B的終止含量按照分組順序依次為14 %、16 %、18%……以此類推；在第25-30分鐘的梯度時(shí)間內(nèi)，流動(dòng)相B的初始含量按照分組順序依次為14%、16%、18%……以此類推，流動(dòng)相B的終止含量均為30% ;上述％均表示體積百分比濃度。質(zhì)譜采集系統(tǒng)為QExactive質(zhì)譜儀(Thermo公司)，掃描采用數(shù)據(jù)依賴模式:進(jìn)行一個(gè)全掃描(掃描范圍m/z400-1400)，選擇最強(qiáng)的75個(gè)母離子進(jìn)行二級掃描(信號閾值為6300)。電噴霧電壓1900V，正離子模式。得到的總離子流色譜圖如圖4所示。所有餾分經(jīng)采集分析后，在假陽性率低于I %時(shí)，24小時(shí)(24個(gè)餾分*30分鐘= 12小時(shí)，重復(fù)進(jìn)行一次實(shí)驗(yàn))共鑒定到9032個(gè)蛋白質(zhì)。
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白質(zhì)組分離鑒定方法，其特征包括以下步驟: .1)從離體的細(xì)胞或組織中提取蛋白質(zhì)混合物； .2)采用蛋白酶將待分離鑒定的蛋白質(zhì)混合物酶切成肽段混合物； .3)將酶切獲得的肽段混合物進(jìn)行高溫高pH短梯度反相色譜分離，收集餾分，并對餾分進(jìn)行干燥濃縮； .4)將步驟3)獲得的干燥濃縮樣本復(fù)溶后，采用低pH短梯度反相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法進(jìn)行鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟3)中，所述高溫高pH短梯度反相色譜分離的流動(dòng)相PH值為pH 7-12 ;所述柱溫為30°C -80°C，優(yōu)選為60°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述步驟3)中，所述高溫高pH短梯度反相色譜分離采用的流動(dòng)相為PH 7-12的乙腈水溶液，其中，乙腈初始濃度為2%，終止?jié)舛葹?8% ； 和/或，所述步驟4)中，所述低pH短梯度反相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法中低pH短梯度反相色譜采用的流動(dòng)相為PH 2-5的乙腈水溶液，優(yōu)選為pH 3的乙腈水溶液，其中，乙腈初始濃度為2%，終止?jié)舛葹?8% ； 所述％表示體積百分比濃度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于:所述步驟3)中，所述高溫高pH短梯度反相色譜分離采用的流動(dòng)相由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成，流動(dòng)相A為pH 7-12的2%的乙腈水溶液，優(yōu)選為pH 10的2%的乙腈水溶液，流動(dòng)相B為pH 7-12的98%的乙腈水溶液，優(yōu)選為PHlO的98%的乙腈水溶液； 高溫高pH短梯度反相色譜采用的梯度范圍設(shè)置為:1)流動(dòng)相B的起始含量為(O~5) %，終止含量為(8~10) %，梯度時(shí)間為2~5分鐘；2)流動(dòng)相B的起始含量為(8~10) %，終止含量為(18~25) %，梯度時(shí)間為11~14分鐘；3)流動(dòng)相B的起始含量為(18~25) %，終止含量為(32~45) %，梯度時(shí)間為9~12分鐘；4)流動(dòng)相B的起始含量為(32~45)%，終止含量為95%，梯度時(shí)間為I~4分鐘；5)流動(dòng)相B的含量始終為95%，梯度時(shí)間為I~4分鐘；6)流動(dòng)相B的起始含量為95%，終止含量為5%，梯度時(shí)間為2~5分鐘； 和/或所述步驟3)中，所述高溫高pH短梯度反相色譜分離采用的流速為0.2-1.5mL/min,紫外檢測波長為214nm ； 所述％表示體積百分比濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于:所述步驟3)中，所述高溫高PH短梯度反相色譜分離柱填料粒徑為1.9-5 μ m,填料孔徑為10-50nm，反相色譜分離柱長度為50-500mm
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:所述步驟I)中，所述從細(xì)胞或組織中提取蛋白質(zhì)混合物的提取方法為利用6-8M尿素溶液將細(xì)胞或組織混懸后，在冰浴上超聲提取蛋白質(zhì)混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中所述的方法，其特征在于:所述步驟2)中，所述蛋白酶切方法為使用Trypsin、GluC或Lys-c中的一種或兩種以上蛋白酶任意組合對蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行酶切。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:所述步驟4)中，所述低pH短梯度反相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法中低PH短梯度反相色譜采用的流動(dòng)相由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成，流動(dòng)相A為pH 2-5的2%乙腈水溶液，優(yōu)選為pH 3的2%乙腈水溶液，流動(dòng)相B為pH 2-5的98%乙腈水溶液，優(yōu)選為pH 3的98%乙腈水溶液；流動(dòng)相B的初始含量為O，終止含量為30%，所述％表示體積百分比濃度。 和/或，根據(jù)步驟3)獲得的餾分集先后順序，每四個(gè)餾分分成一組，即第1-4餾分、5-8餾分、9-12餾分，……以此類推；采用的梯度設(shè)置為:在第0-4分鐘的梯度時(shí)間內(nèi)，流動(dòng)相B的初始含量均為0，流動(dòng)相B的終止含量按照分組順序依次為4%、6%、8%……以此類推；在第4-25分鐘的梯度時(shí)間內(nèi)，流動(dòng)相B的初始含量按照分組順序依次為4%、6%、8%……以此類推，流動(dòng)相B的終止含量按照分組順序依次為14%、16%、18%……以此類推；在第25-30分鐘的梯度時(shí)間內(nèi)，流動(dòng)相B的初始含量按照分組順序依次為14%、16%、18%……以此類推， 流動(dòng)相B的終止含量均為30% ;所述％表示體積百分比濃度。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:所述步驟4)中，所述低pH短梯度反相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法采用反相色譜分離柱填料粒徑為1.9-5 μ m，填料孔徑為10-50nm,反相色譜分離柱長度為50_500mm ； 和/或，所述步驟4)中，所述低pH短梯度反相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法中反相色譜流速為100_500nL/min。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述低PH短梯度反相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法使用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定。
【文檔編號】G01N30/89GK103512997SQ201210210614
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月20日
【發(fā)明者】秦鈞, 錢小紅, 丁琛, 應(yīng)萬濤, 張養(yǎng)軍, 衛(wèi)軍營, 宋雷, 江靜, 張姣, 賀福初 申請人:北京蛋白質(zhì)組研究中心