一種紫花苜蓿原生質(zhì)體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種紫花苜蓿原生質(zhì)體的制備方法，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，包括選擇生長(zhǎng)狀況良好未開花的紫花苜蓿葉片作為制備原生質(zhì)體的材料；將制備原生質(zhì)體的材料進(jìn)行預(yù)處理，得到具有多個(gè)葉條的葉片；將所述具有多個(gè)葉條的葉片進(jìn)行酶解處理，得到原生質(zhì)體酶解液；對(duì)所述原生質(zhì)體酶解液進(jìn)行純化處理，得到紫花苜蓿原生質(zhì)體。本發(fā)明制備原生質(zhì)體成本低、活力高。
【專利說明】
一種紫花苜蓿原生質(zhì)體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種紫花苜蓿原生質(zhì)體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 原生質(zhì)體指去掉細(xì)胞壁的裸露活細(xì)胞，是進(jìn)行各種細(xì)胞及遺傳操作的理想材料， 已廣泛地應(yīng)用于體細(xì)胞雜交、遺傳轉(zhuǎn)化、種質(zhì)資源保存、基因瞬間表達(dá)、蛋白質(zhì)互作、信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)等方面。因此原生質(zhì)體技術(shù)可為紫花苜蓿的種質(zhì)資源創(chuàng)新和遺傳改良提供新的技術(shù)途 徑，而實(shí)現(xiàn)上述應(yīng)用的前提是制備高產(chǎn)量和高活力的紫花苜蓿原生質(zhì)體。
[0003] 目前，紫花苜蓿原生質(zhì)體的制備一般采用發(fā)芽不久的紫花苜蓿幼株的下胚軸，而 且其制備過程需要8h以上，例如王娟等發(fā)表在《草地學(xué)報(bào)》第18卷第2期的"苜蓿愈傷組織原 生質(zhì)體游離與培養(yǎng)"中，采用了下胚軸作為材料;陶茸等發(fā)表在《中國草地學(xué)報(bào)》第22卷第1 期的"隴東野生紫花苜蓿愈傷組織原生質(zhì)體游離條件的篩選"中，采用了紫花苜蓿子葉作為 原生質(zhì)體材料，且其酶解時(shí)間為I Oh。
[0004] 可見，現(xiàn)有技術(shù)對(duì)紫花苜蓿原生質(zhì)體的材料來源要求較高，且酶解時(shí)間過長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的材料來源要求較高，酶解效率低的技術(shù)問題，本發(fā)明 提供一種紫花苜蓿原生質(zhì)體的制備方法，該方法可以高效的提取紫花苜蓿中的原生質(zhì)體， 對(duì)材料要求低。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種紫花苜蓿原生質(zhì)體的制備方法，包括：
[0007] 選擇生長(zhǎng)狀況良好未開花的紫花苜蓿葉片作為制備原生質(zhì)體的材料；
[0008] 將制備原生質(zhì)體的材料進(jìn)行預(yù)處理，切割成具有多個(gè)葉條的葉片；
[0009] 將所述具有多個(gè)葉條的葉片進(jìn)行酶解處理，得到原生質(zhì)體酶解液；
[0010] 對(duì)所述原生質(zhì)體酶解液進(jìn)行純化處理，得到紫花苜蓿原生質(zhì)體。
[0011] 特別是，所述將制備原生質(zhì)體的材料進(jìn)行預(yù)處理包括：
[0012] 剪去紫花苜蓿葉片的邊緣部分，以除去葉片上較小的細(xì)胞；
[0013] 從葉梢處沿著葉中脈平行的方向?qū)λ黾羧ミ吘壊糠值娜~片進(jìn)行局部剪切，得到 具有多個(gè)葉條的葉片。
[0014]尤其是，將所述具有多個(gè)葉條的葉片進(jìn)行酶解處理包括：
[0015] 將所述具有多個(gè)葉條的葉片平鋪在已配制好的酶解液中，真空抽濾后，使酶解液 充分進(jìn)入葉片內(nèi)；
[0016] 將含有葉片的酶解液在黑暗條件下震蕩處理，使原生質(zhì)體釋放，得到原生質(zhì)體粗 酶解液。
[0017] 其中，所述純化處理包括：
[0018] 向所述原生質(zhì)體粗酶解液中加入W5溶液進(jìn)行懸浮，再使用尼龍膜將其進(jìn)行過濾， 以除去沒有降解的細(xì)胞和組織，得到濾液；
[0019] 離心處理所述濾液，去除上清液；
[0020] 重復(fù)上述步驟1-2次，得到原生質(zhì)體。
[0021] 特別是，所述酶解液中包括:纖維素酶、果膠酶、離析酶和甘露醇，以及KCUMES溶 液、CaCl2 和 BSA。
[0022] 尤其是，所述酶解液中各成分的最終濃度為： 纖維素酶 1.6-2.4% 果膠酶 0.4-0.6% 離析酶 Q.24-Q.36%
[0023] KCI 20m M MES 20mM CaCh IOmM BSA 0.1%-0.15%.
[0024] 優(yōu)選地，所述酶解液中各成分的最終濃度為： 纖維素酶 2% 果膠酶 0,5%
[0025] 離析酶 0.3% KCI 20mM MES 20m M CaCh IOmM
[0026] BSA 0·1%-0_!5%。
[0027]尤其是，所述酶解液使用終濃度為0.3-0.6Μ的甘露醇進(jìn)行滲透壓的調(diào)節(jié)。
[0028]優(yōu)選地，所述酶解液使用終濃度為0.4M的甘露醇進(jìn)行滲透壓的調(diào)節(jié)。
[0029] 特別是，所述MES的pH為5.7。
[0030] 特別是，所述酶解液的配制包括如下步驟：
[0031] 預(yù)先配制酶解液，加入纖維素酶、果膠酶、離析酶，再加入KCl、MES溶液，最后使用 濃度為〇. 3-0.6M的甘露醇調(diào)節(jié)其滲透壓，得到混合物；
[0032] 將混合物在55°C下進(jìn)行水浴加熱IOmin，自然冷卻至室溫后，加入CaCldPBSAJg 合均勻，得到酶解液，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0033]尤其是，滲透壓的調(diào)節(jié)采用終濃度為0.4M的甘露醇。
[0034] 其中，所述酶解液中各成分的最終濃度為：纖維素酶1.6-2.4 %、果膠酶0.4-0.6%、離析酶0.24-0.36%、KC1 20mM、MES 20mM、CaCh 10mM、BSA 0·1%-0· 15%。
[0035] 優(yōu)選地，所述所述酶解液中各成分的最終濃度為:纖維素酶2%、果膠酶0.5%、離 析酶0.3%、1((：120111]\1、]\^3 20111]\^&(：12 101111、85厶0.1%-0.15%。
[0036] 其中，所述W5溶液為終濃度包括：154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、2mM MES。
[0037] 其中，所述MES的pH為5.7。
[0038] 特別是，所述具有多個(gè)葉條的葉片的葉條寬度為0.5-lmm。
[0039] 其中，所述真空抽濾的處理時(shí)長(zhǎng)為20min。
[0040] 特別是，所述在黑暗條件下震蕩處理溫度為25°C，處理時(shí)間為4-5h，轉(zhuǎn)速為40rpm。 [0041 ] 尤其是，所述離心處理的離心力為100g，處理時(shí)間為3min，
[0042] 特別是，所述離心處理過程中，加速及減速時(shí)的加速度全部為lm/S2。
[0043] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0044] 1、本發(fā)明采用的是未開花前的紫花苜蓿葉片作為制備原生質(zhì)體的材料來源，不再 僅限于現(xiàn)有技術(shù)中使用的發(fā)芽不久的紫花苜蓿幼株的下胚軸，可見，使用本發(fā)明的方法制 備的原生質(zhì)體材料來源廣泛，降低了原料成本。
[0045] 2、由于本發(fā)明方法對(duì)制備原生質(zhì)體的材處理時(shí)先去除葉邊緣部分，后進(jìn)行了局部 剪切，因此酶解時(shí)不會(huì)出現(xiàn)葉條粘連的情況，提高了原生質(zhì)體提取率。
[0046] 3、由于本發(fā)明使用了包含2%的纖維素酶、0.5%的果膠酶、0.3%的離析酶制備的 酶解液、滲透壓的調(diào)節(jié)選擇0.4M濃度的甘露醇、且黑暗條件下在轉(zhuǎn)速為40rpm的搖床中進(jìn)行 酶解等技術(shù)特征，使得紫花苜蓿的酶解時(shí)間由原來的8h縮短至4-5h，時(shí)間成本降低了一倍 左右，而且由于配制酶解液的成分少，配制簡(jiǎn)單，進(jìn)一步的減低了試劑成本，并且利用本發(fā) 明制得的原生質(zhì)體完整率高，質(zhì)量好，如圖2所示。
【附圖說明】
[0047]圖1是實(shí)施例1材料預(yù)處理之后的葉片形態(tài)圖；
[0048] 圖2是實(shí)施例2觀察到的原生質(zhì)體狀態(tài)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 下面結(jié)合具體實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明所講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0050] 實(shí)施例1
[00511 1、酶解液的配制
[0052]進(jìn)行原生質(zhì)體提取前，先行配制酶解液母液，終濃度包括2%纖維素酶、0.5%果膠 酶、0.3%離析酶及0.4M甘露醇、20mM KCl、20mM MES，其中，MES的pH為5.7，在55°C條件下水 浴加熱IOmin，然后冷卻至室溫，加入終濃度為IOmM CaCl2和0.1 %-0.15%BSA，4°C下保存 備用。
[0053] 2、材料的準(zhǔn)備
[0054]選擇生長(zhǎng)狀況良好、未開花的紫花苜蓿，剪取其葉片作為制備紫花苜蓿原生質(zhì)體 的材料。
[0055] 3、材料的預(yù)處理
[0056]將紫花苜蓿葉片的邊緣部分剪去，以除去形態(tài)較小、生長(zhǎng)狀態(tài)不佳的細(xì)胞，然后從 葉梢處沿著葉中脈平行的方向進(jìn)行不完全切割，使切割后得到的葉條為一個(gè)整體，切割寬 度為0.5-1_，切割后的形態(tài)如圖1所示。
[0057] 經(jīng)多次試驗(yàn)論證發(fā)現(xiàn)，采用除去葉邊緣及局部切割的方式對(duì)葉片進(jìn)行預(yù)處理，解 決現(xiàn)有技術(shù)中采用對(duì)葉片全部切割或?qū)θ~片切碎處理后進(jìn)行酶解處理時(shí)發(fā)生的粘連現(xiàn)象， 較大幅度的提高了原生質(zhì)體的提取率。
[0058] 4、材料的酶解處理
[0059] 4.1、按照I Oml酶解液處理10-15片苜蓿葉片的比例，根據(jù)葉片數(shù)量將切割后的葉 片平鋪在相應(yīng)體積的酶解液中，并利用真空抽濾處理20min，使酶解液進(jìn)入細(xì)胞中，加速葉 片酶解，使細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，得到初原生質(zhì)體酶解液。
[0060] 4.2、將初原生質(zhì)體酶解液放入搖床中，設(shè)置其溫度為25°C，在轉(zhuǎn)速為40rpm的條件 下，處理4-5h，為了避免光照刺激原生質(zhì)體，本處理過程在黑暗條件下進(jìn)行，原生質(zhì)體在轉(zhuǎn) 速為40rpm的搖床中進(jìn)一步釋放，得到原生質(zhì)體酶解液。
[0061] 經(jīng)多次試驗(yàn)論證發(fā)現(xiàn)，采用終濃度包括2%纖維素酶、0.5%果膠酶、0.3%離析酶； 0.4M濃度的甘露醇進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)的酶解液處理具有多個(gè)葉條的葉片，才使得紫花苜蓿原 生質(zhì)體在一個(gè)較佳的穩(wěn)態(tài)環(huán)境中發(fā)生質(zhì)壁分離，不但提高了原生質(zhì)體的提取效率，而且保 證了原生質(zhì)體的完整度，因而本發(fā)明方法提取的紫花苜蓿原生質(zhì)體活力高。
[0062]經(jīng)多次試驗(yàn)論證，采用最終濃度范圍為纖維素酶1.6-2.4%、果膠酶0.4-0.6%、離 析酶0.24-0.36%、KC1 20mM、MES 20mM、CaCl2 10mM、BSA 0·1%-0· 15% 內(nèi)任意比例配制的 酶解液同樣可以達(dá)到相同的效果，
[0063] 例如，酶解液最終成分配比為纖維素酶1.6%、果膠酶0.6%、離析酶0.36%、KC1 20mM、MES 20mM、CaCl2 10mM、BSA 0.1%-0.15%;又例如，酶解液最終成分配比為纖維素酶 2.4%、果膠酶0.4%、離析酶0.24%、KC1 20mM、MES 20mM、CaCl2 10mM、BSA 0·1%-0·15%; 又例如，酶解液最終成分配比為纖維素酶1.6%、果膠酶0.4%、離析酶0.36%、KCl 20mM、 MES 20mM、CaCl2 10mM、BSA 0.1%-0.15%;又例如，酶解液最終成分配比為纖維素酶 2.4%、果膠酶0.6%、離析酶0.24%、KC1 20mM、MES 20mM、CaCl2 10mM、BSA 0·1%-0·15% 等。
[0064] 5、原生質(zhì)體的純化
[0065] 向原生質(zhì)體酶解液中加入與原生質(zhì)體酶解液等體積的W5溶液進(jìn)行混合后，再使用 尼龍膜將其過濾至干凈的培養(yǎng)皿中，除去沒有降解的細(xì)胞和組織，得到濾液;使用移液器將 濾液轉(zhuǎn)移到圓底離心管中，設(shè)置離心力為l〇〇g，對(duì)裝有原生質(zhì)體酶解液的離心管進(jìn)行離心， 時(shí)間為2min，需要特別說明是，離心處理的過程中，離心加速時(shí)和離心減速時(shí)的加速度均為 WS20
[0066] 重復(fù)上述步驟1~2次，得到純化后的原生質(zhì)體。
[0067] 需要說明的是，每次離心后，都是用W5溶液懸浮，再進(jìn)行下一次離心處理。
[0068] 需要說明的是，W5溶液為終濃度包括：154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、2mM MES，其中，MES 的 pH 為 5.7。
[0069] 實(shí)施例2原生質(zhì)體產(chǎn)活力的測(cè)定
[0070] 向得到的原生質(zhì)體中加入W5溶液對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行重懸，使原生質(zhì)體的濃度為1~2 X IO5，冰浴30min(也可以在冰上放置24h)，顯微鏡觀察原生質(zhì)體狀態(tài)，觀察圖如圖2所示。
[0071] 從圖2中可以看出，原生質(zhì)體呈完整球形狀態(tài)，破碎率較少，可見，使用本發(fā)明方法 不但可以在短時(shí)間內(nèi)獲得紫花苜蓿原生質(zhì)體，而且其活力較高。
[0072]盡管上述對(duì)本發(fā)明做了詳細(xì)說明，但不限于此，本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù) 本發(fā)明的原理進(jìn)行修改，因此，凡按照本發(fā)明的原理進(jìn)行的各種修改都應(yīng)當(dāng)理解為落入本 發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種紫花苜蓿原生質(zhì)體的制備方法，其特征在于，包括： 選擇生長(zhǎng)狀況良好未開花的紫花苜蓿葉片作為制備原生質(zhì)體的材料； 將制備原生質(zhì)體的材料進(jìn)行預(yù)處理，得到具有多個(gè)葉條的葉片； 將所述具有多個(gè)葉條的葉片進(jìn)行酶解處理，得到原生質(zhì)體酶解液； 對(duì)所述原生質(zhì)體酶解液進(jìn)行純化處理，得到紫花苜蓿原生質(zhì)體。2. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述將制備原生質(zhì)體的材料進(jìn)行預(yù)處理 包括： 剪去紫花苜蓿葉片的邊緣部分，以除去葉片上較小的細(xì)胞； 從葉梢處沿著葉中脈平行的方向?qū)λ黾羧ミ吘壊糠值娜~片進(jìn)行局部剪切，得到具有 多個(gè)葉條的葉片。3. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述將具有多個(gè)葉條的葉片進(jìn)行酶解處 理包括： 將所述具有多個(gè)葉條的葉片平鋪在已配制好的酶解液中，真空抽濾后，使酶解液充分 進(jìn)入葉片中； 將含有葉片的酶解液在黑暗條件下震蕩處理，使原生質(zhì)體釋放，得到原生質(zhì)體酶解液。4. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述純化處理包括： 向所述原生質(zhì)體酶解液中加入W5溶液進(jìn)行懸浮，再使用尼龍膜將其進(jìn)行過濾，以除去 沒有降解的細(xì)胞和組織，得到濾液； 離心處理所述濾液，去除上清液； 重復(fù)上述步驟1-2次，得到原生質(zhì)體。5. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述酶解液的MES溶液pH為5.7。6. 如權(quán)利要求3-4所述的制備方法，其特征在于，所述酶解液的配制包括如下步驟： 預(yù)先配制酶解液，包括纖維素酶、果膠酶、離析酶，并加入KC1、MES溶液，使用0.3-0.6M 濃度的甘露醇調(diào)節(jié)其滲透壓； 將其水浴加熱，自然冷卻至室溫后，加入CaCl2和BSA，混合均勻，得到酶解液，4°C保存?zhèn)? 用。7. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述酶解液中各成分的最終濃度為： 纖維素酶 1.6-2,4% 果膠酶 0.4-0.6% 離析酶 0.24-0.36% KCi 20m Μ MES 20mM CaCb 2〇mM BSA 0·1%-0_15%。8. 如權(quán)利要求1-3所述的制備方法，其特征在于，所述具有多個(gè)葉條的葉片的葉條寬度 為0·5_lmm〇9. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述在黑暗條件下震蕩處理溫度為25 °C，處理時(shí)間為4_5h，轉(zhuǎn)速為40rpm。10.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述離心處理的過程中，加速時(shí)和減速 時(shí)的加速度全部為lm/S2。
【文檔編號(hào)】C12N5/04GK105861414SQ201610424213
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月15日
【發(fā)明人】王贊, 龔攀, 賈聰俊, 王學(xué)敏, 高洪文
【申請(qǐng)人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所