一種埃德菌fs110原生質(zhì)體及其制備方法和轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種埃德菌FS110原生質(zhì)體及其制備方法和 轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110是從3739米的深海中分離得到的真菌。 從中分離得到了具有很強抗腫瘤活性的化合物Clavatol，Clavatol對于腫瘤細胞SF-268、 MCF-7、NCI-H460和H印G-2的IC5。為6-llnM。從該真菌中還分離得到了 15種膠霉毒素及 其衍生物，其中4種膠霉毒素為新結(jié)構(gòu)化合物，分離得到膠霉毒素對于腫瘤細胞SF-268、 MCF-7、NCI-H460和H印G-2的IC5。為0. 22-34. 02yM。膠霉毒素具有抗腫瘤、抗真菌活性、 抗病毒和免疫調(diào)節(jié)活性，因此在抗腫瘤、抗肝纖維化、抗病毒及免疫抑制劑藥物開發(fā)方面具 有良好的開發(fā)前景。而且DichotomomycescejpiiFS110粗提物對于病原真菌膠孢炭疽菌、 鏈格孢霉、新月彎孢霉和柱枝雙胞霉的生長抑制率均大于90% (楊小嵐，陳玉嬋，李浩華， 章衛(wèi)民，23株海洋真菌的分子鑒定及其抗植物病原真菌和細胞毒活性研究。生物技術(shù)通報， 2014,8:132-137)。以上結(jié)果預示該真菌具有較新穎的功能基因，存在獨特的生物合成機 制。因此，十分有必要建立該埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110的遺傳轉(zhuǎn)化體系，以 便于后期對該真菌進行遺傳操作改造，以提高高活性次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量并獲得更多結(jié)構(gòu) 新穎的有活性的衍生物，最終獲得更多的藥物先導化合物，促進我國生物醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0003] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種埃德菌FS110原生質(zhì)體及其制備方法。
[0004] 本發(fā)明的埃德菌FS110原生質(zhì)體是通過以下方法制備的，采用含有溶壁酶、纖維 素酶和蝸牛酶的混合酶體系對埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110的菌絲體進行酶解 而得到埃德菌FS110原生質(zhì)體。
[0005] 所述的混合酶體系優(yōu)選是溶壁酶、纖維素酶和蝸牛酶按照質(zhì)量比1 :1 :1混合而 成，混合酶體系中酶的總濃度為l〇mg/L。
[0006] 優(yōu)選，具體步驟為：冰浴條件下200rpm攪拌埃德菌FS110菌絲體3h，然后 5000rpm，4°C條件下收集菌絲體，用0. 02MPB緩沖液洗滌，加入0. 5% 0-巰基乙醇室溫放 置0. 5h，再用0. 02MPB緩沖液洗滌，收集菌絲體，按lg菌絲體/10mL的比例加入混合酶體 系進行酶解，充分振蕩，30°C，lOOrpm酶解3. 5h，將酶解液過濾，取濾液，即為埃德菌FS110 原生質(zhì)體，所述的混合酶體系是溶壁酶、纖維素酶和蝸牛酶按照質(zhì)量比1 :1 :1混合而成，混 合酶體系中酶的總濃度為l〇mg/L。
[0007] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110的轉(zhuǎn)化 方法，其特征在于，將質(zhì)粒PAN7-1通過PEG介導轉(zhuǎn)化至上述埃德菌FS110原生質(zhì)體中，以潮 霉素B作為篩選標記，在再生培養(yǎng)基上對埃德菌FS110原生質(zhì)體進行篩選恢復培養(yǎng)，經(jīng)過篩 選得到含有質(zhì)粒PAN7-1的埃德菌FS110。
[0008] 優(yōu)選，具體步驟為：用STC液洗滌埃德菌FS110原生質(zhì)體，離心取埃德菌FS110原 生質(zhì)體沉淀，用STC液稀釋至10s個/ml，每100yL埃德菌FS110原生質(zhì)體懸浮液與含2yg PAN7-1質(zhì)粒的100yLSTC緩沖液以及50yL體積分數(shù)30%PEG-6000混合，在30°C下溫育 30min后，與2ml體積分數(shù)30 %PEG6000液充分混勻，繼續(xù)培養(yǎng)5min后，再與5ml融化的再 生培養(yǎng)基（50°C)混合，涂布于含有100yg/ml潮霉素B的再生培養(yǎng)基上，然后覆蓋一層含 有100yg/ml潮霉素B的再生培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)，得到抗性菌落，然后提取抗性菌落的基 因組，以潮霉素B作為篩選標記基因，篩選陽性克隆，得到含有質(zhì)粒pAN7-l的埃德菌FS110。
[0009] 所述的質(zhì)粒pAN7-l為帶有潮霉素B抗性基因hph和真菌啟動子gpdA的廣宿主載 體PAN7-1，為現(xiàn)有技術(shù)中的已知產(chǎn)品。
[0010] 所述的再生培養(yǎng)基的配方為：酵母粉lg酶水解干酪素lg瓊脂16g蔗糖274g蒸餾 水1L，滅菌備用。
[0011] 本專利所涉及的埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110分離自3739米的深 海，本發(fā)明以溶壁酶、纖維素酶和蝸牛酶混合酶體系作用制備埃德菌（Dichotomomyces cejpii)FS110原生質(zhì)體。鑒于目前關(guān)于埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110的遺傳轉(zhuǎn) 化體系的構(gòu)建方法尚未見報道，因此本發(fā)明以潮霉素B為篩選標記，采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 將能帶有外源基因的載體PAN7-1導入到埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110原生質(zhì)體 中，從而構(gòu)建埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110原生質(zhì)體的遺傳操作體系，為建立埃 德菌（Dichotomomycescejpii)FSl10的遺傳轉(zhuǎn)化體系并促進其代謝工程改造奠定前期基 礎(chǔ)，從而最終通過基因工程手段提高埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110中高活性代謝 產(chǎn)物的產(chǎn)量和種類。
[0012] 本發(fā)明的埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110,其公開于文獻：楊小M，陳玉 嬋，李浩華，章衛(wèi)民，23株海洋真菌的分子鑒定及其抗植物病原真菌和細胞毒活性研究。生 物技術(shù)通報，2014, 8:132-137。該菌種本申請人也持有，保證自發(fā)明的申請日起20年內(nèi)向 公眾提供。
【附圖說明】
[0013] 圖1為深海真菌DichotomomycescejpiFS110的原生質(zhì)體油鏡鏡檢圖；
[0014] 圖2為質(zhì)粒pAN7-l載體圖譜；
[0015] 圖3為深海真菌DichotomomycescejpiFS110原生質(zhì)體在不導入外源質(zhì)粒 pAN7-l(A)和導入外源質(zhì)粒pAN7-l(B)在含有100yg/ml潮霉素B的YH)培養(yǎng)基平板上的 生長狀況；
[0016] 圖4為以DichotomomycescejpiFS110重組菌為模板擴增hph基因的PCR產(chǎn)物 鑒定圖，其中1、2、3、4、5、6泳道分別為01 20000嫩1&^1?^和以菌落1#-5#基因組為模板 擴增得到的PCR產(chǎn)物。
[0017] 圖5為hph引物擴增得到PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中的比對結(jié)果。
【具體實施方式】
[0018] 以下將參照附圖，結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步解釋。但實施例本身對本 發(fā)明不做任何形式的限定。
[0019] 實施例1:PEG介導的埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，包含 如下步驟：
[0020] 原生質(zhì)體的制備：將埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110于斜面上刮取少 量菌落，接種于30mlYH)液體培養(yǎng)基中（YH)液體培養(yǎng)基屬于現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)培養(yǎng) 基），同時接種于含有20yg/mL、50yg/mL、75yg/mL和100yg/mL潮霉素B的YTO液 體培養(yǎng)基中，30 °C，160rpm培養(yǎng)72h后，結(jié)果表明100yg/mL潮霉素B可以完全抑制埃 德菌（Dichotomomycescejpii)FS110的生長。不含潮霉素B培養(yǎng)基中生長的埃德菌 (Dichotomomycescejpii)FS110菌株用無菌磁力攪拌棒在200rpm，冰浴條件下攪拌菌絲體 3. 0h，5000rpm，4°C條件下收集菌