專利名稱：一種大葉藻幼苗原生質(zhì)體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及原生質(zhì)體的制備方法，尤其涉及無(wú)菌大葉藻原生質(zhì)體的制備方法。

背景技術(shù)：
原生質(zhì)體是植物細(xì)胞除去細(xì)胞壁后裸露的球形細(xì)胞，它具有全能性，可在人工控制條件下進(jìn)行大量快速繁殖，也可誘導(dǎo)其融合，形成雜種細(xì)胞，為體細(xì)胞雜交提供實(shí)驗(yàn)材料。從海藻體分離出原生質(zhì)體有機(jī)械法、微生物法、酶法等方法。一般酶法是較為理想而常用的方法。機(jī)械法獲得的原生質(zhì)體受到的損傷較大，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。微生物法容易引起雜菌污染，對(duì)于后續(xù)愈傷組織形成及成苗帶來(lái)污染。大葉藻(Zostera marina L.)俗稱海帶草，屬于被子植物門(Angiospermae)，單子葉植物綱(Monocotyledoneae，或稱百合綱Liliopsida)，澤瀉目(Alismales)，眼子菜科(Potamogetonaceae)，大葉藻屬(Zostera L.)，大葉藻為多年生草本植物，根狀莖匍匐，節(jié)上生須根。莖疏生分枝，扁平，淡綠色。葉互生，綠色，長(zhǎng)條形，長(zhǎng)達(dá)50厘米以上，寬約3～5毫米，頂端圓形，全緣，有5～7脈，托葉膜質(zhì)。肉穗花序初時(shí)包于佛焰苞內(nèi)，長(zhǎng)4～6厘米，花序軸扁平，邊緣無(wú)苞片狀附屬物；花小，單性，雌、雄花沿花序軸一側(cè)交互排成2列，無(wú)花被；子房卵狀長(zhǎng)橢圓形；柱頭2，剛毛狀。種子矩圓形，長(zhǎng)約4毫米，有縱紋。大葉藻分布于我國(guó)的山東、河北、遼寧等沿海省份；以及分布于朝鮮、日本、歐洲、北美等國(guó)家和地區(qū)。無(wú)菌的大葉藻幼苗原生質(zhì)體能為原生質(zhì)體融合，遺傳轉(zhuǎn)化，植株再生，新品種培育打下基礎(chǔ)。目前雖然有通過(guò)常規(guī)消毒方法及酶解條件獲得無(wú)菌海藻原生質(zhì)體的報(bào)道，如論文“帶愈傷組織的高效率誘導(dǎo)”(刊登在《海洋與湖沼》1999年第06期第652～657頁(yè))介紹了無(wú)菌海藻原生質(zhì)體多種常規(guī)消毒方法，其中一種常規(guī)消毒方法是將切好的組織塊在1.5％濃度的碘化鉀溶液中浸泡10分鐘，用75％濃度的酒精棉球檫3次，再用高壓蒸汽滅菌海水沖洗4遍，放入MS固體增富培養(yǎng)基中培養(yǎng)。論文“大型海藻的組織培養(yǎng)及其應(yīng)用”(刊登在《植物生理學(xué)通訊》2007年第03期第605～611頁(yè))、論文“角叉菜(Chondrus ocellatusHolm)原生質(zhì)體分離、培養(yǎng)與再生的研究”(刊登在《中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》1991年第01期第52～61頁(yè))、論文“條斑紫菜單細(xì)胞固體培養(yǎng)的初步研究”(刊登在《海洋通報(bào)》2004年第05期第52～61頁(yè))介紹了無(wú)菌海藻原生質(zhì)體常規(guī)酶解條件采用纖維素酶和海螺酶相結(jié)合，酶解時(shí)間2～3小時(shí)。這里的酶解時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則原生質(zhì)體會(huì)大量破碎，或者失去活性，所以研究者一般在酶解12小時(shí)后就會(huì)放棄后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。但運(yùn)用上述常規(guī)消毒方法及酶解條件在處理大葉藻時(shí)均不能得到大葉藻的原生質(zhì)體。分析認(rèn)為，大葉藻這種植物不屬于海藻，屬于一種生活在海水中的被子植物，正是由于大葉藻這個(gè)生理特點(diǎn)，目前還未見有關(guān)于大葉藻原生質(zhì)體制備方法的相關(guān)報(bào)道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種無(wú)菌大葉藻幼苗原生質(zhì)體的制備方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是 一種無(wú)菌大葉藻幼苗原生質(zhì)體的制備方法，其步驟是 (1)將大葉藻幼苗放入雙抗海水中暫養(yǎng)2天； (2)選取剛萌發(fā)的大葉藻幼苗； (3)將暫養(yǎng)后的大葉藻幼苗浸泡在75％濃度的酒精10秒； (4)將大葉藻幼苗浸泡在1％濃度的次氯酸鈉溶液5分鐘； (5)將大葉藻幼苗浸泡在1.5％濃度的碘化鉀溶液10分鐘； (6)將大葉藻幼苗用無(wú)菌海水沖洗3次，再用無(wú)菌海水浸泡10分鐘，然后用無(wú)菌海水恢復(fù)浸泡20分鐘； (7)將大葉藻幼苗從無(wú)菌海水撈出后用無(wú)菌棉布吸干，然后將大葉藻幼苗放入離心管中并加入酶液，酶液配方為海水1000重量份，纖維素酶470重量份，果膠酶5重量份，山梨醇90重量份，再用剪刀在離心管中將大葉藻幼苗剪碎，剪碎的大葉藻幼苗在酶液中進(jìn)行酶解； (8)酶解結(jié)束后，向酶液中加入等體積葡萄糖液體，靜置，取上清液，然后過(guò)濾； (9)配置高滲海水，在過(guò)濾后的上清液中加入等體積高滲海水，用高滲海水洗3次在上清液中加入等體積的高滲海水搖勻后，在離心機(jī)2000r/min轉(zhuǎn)速下旋轉(zhuǎn)5分鐘，離心后棄上清液，獲得沉淀物；在沉淀物中再次加入等體積的高滲海水搖勻后，在離心機(jī)2000r/min轉(zhuǎn)速下旋轉(zhuǎn)5分鐘，離心后棄上清液，獲得沉淀物；在沉淀物中再次加入等體積的高滲海水搖勻后，在離心機(jī)2000r/min轉(zhuǎn)速下旋轉(zhuǎn)分鐘，離心后棄上清液，獲得沉淀物； (10)第3次離心獲得的沉淀物中加入培養(yǎng)液，搖勻后用離心機(jī)在2000r/min的轉(zhuǎn)速下離心，即可收集到大葉藻幼苗原生質(zhì)體。
上述步驟(7)的酶解優(yōu)選條件為酶液PH值為4，溫度保持15℃，0.6克纖維素酶濃度，酶解時(shí)間48小時(shí)。
上述步驟(8)的葡萄糖液體濃度為2摩爾/立方厘米，所述過(guò)濾的網(wǎng)孔徑為300目。
本發(fā)明的有益技術(shù)效果由于大葉藻這種植物不屬于海藻，是一種在海水中完成開花、結(jié)種和萌發(fā)的被子植物，正因?yàn)榇笕~藻這個(gè)生理特點(diǎn)，故大葉藻在成分及生理特性上介于海藻與被子植物之間，更接近于被子植物。本發(fā)明大葉藻幼苗經(jīng)過(guò)酒精、次氯酸鈉溶液、碘化鉀溶液消毒處理后獲得無(wú)菌幼苗；經(jīng)過(guò)剪碎、酶解后處理得到大葉藻幼苗原生質(zhì)體。由于大葉藻細(xì)胞壁的纖維含量高于其他藻類植物，因此本發(fā)明選擇了纖維素酶和果膠酶相結(jié)合的酶解方法，并提高纖維素酶在酶液中的含量。在不影響大葉藻幼苗原生質(zhì)體活性的前提下，延長(zhǎng)酶解時(shí)間，酶解48小時(shí)是個(gè)突破，這么長(zhǎng)的酶解時(shí)間，一般的海藻體會(huì)死亡，而大葉藻確不一樣，酶解48小時(shí)，大葉藻幼苗原生質(zhì)體達(dá)到數(shù)量高峰并具有活性。本發(fā)明方法能夠克服污染，獲得無(wú)菌大葉藻幼苗原生質(zhì)體，為原生質(zhì)體融合，遺傳轉(zhuǎn)化，植株再生，新品種培育等工作打下基礎(chǔ)。另外，本發(fā)明方法也能為建立大葉藻細(xì)胞工程繁殖技術(shù)，快速繁育優(yōu)良大葉藻品系，改良大葉藻遺傳工程提供技術(shù)儲(chǔ)備。



1、圖1為本發(fā)明方法步驟流程圖。
2、圖2為本發(fā)明酶解處理48小時(shí)后獲得的大葉藻幼苗原生質(zhì)體照片。
3、圖3為本發(fā)明酶解處理48小時(shí)后測(cè)定大葉藻幼苗原生質(zhì)體直徑的照片。
4、圖4為本發(fā)明酶解處理48小時(shí)后中性紅和甲基藍(lán)染色光學(xué)顯微鏡下的大葉藻幼苗原生質(zhì)體照片。
5、圖5為本發(fā)明酶解處理48小時(shí)后中性紅和甲基藍(lán)染色光學(xué)相差顯微鏡下的大葉藻幼苗原生質(zhì)體照片。
6、圖6為纖維素酶濃度與大葉藻幼苗原生質(zhì)體釋放量關(guān)系的折線統(tǒng)計(jì)圖。
7、圖7為酶解時(shí)間與大葉藻幼苗原生質(zhì)體釋放量關(guān)系的折線統(tǒng)計(jì)圖。
8、圖8為PH值與大葉藻幼苗原生質(zhì)體釋放量關(guān)系的折線統(tǒng)計(jì)圖。
9、圖9為溫度與大葉藻幼苗原生質(zhì)體釋放量關(guān)系折線統(tǒng)計(jì)圖。

具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明 如圖1所示，一種無(wú)菌大葉藻幼苗原生質(zhì)體的制備方法，其具體步驟是 (1)將大葉藻幼苗放入雙抗海水中暫養(yǎng)，在溫度保持4攝氏度的雙抗海水中暫養(yǎng)2天。大葉藻幼苗既可是天然生長(zhǎng)的，也可是人工養(yǎng)殖或培育的，大葉藻幼苗培育方法之一見本請(qǐng)求人發(fā)明專利申請(qǐng)“一種大葉藻種子快速萌發(fā)方法”，申請(qǐng)?zhí)枮?00910223107.1。
本實(shí)施例雙抗海水配方為青霉素濃度為每毫升100單位(100units/ml)，鏈霉素濃度為每毫升100單位(100units/ml)，即1升海水需0.48g(80萬(wàn)單位)的青霉素0.06克，以及需100萬(wàn)單位的鏈霉素0.1克，通過(guò)攪拌或搖勻等方法混合均勻即可。
(2)選取種子萌發(fā)一個(gè)月的大葉藻幼苗，本實(shí)施例取鮮重為0.025克大葉藻幼苗，這時(shí)大葉藻幼苗長(zhǎng)出兩片子葉，取完整的大葉藻幼苗，并去掉大葉藻幼苗胚乳部分。選取的大葉藻幼苗不宜生長(zhǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，生長(zhǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，大葉藻幼苗細(xì)胞纖維化成分過(guò)長(zhǎng)，需要酶解的時(shí)間越長(zhǎng)，這樣對(duì)大葉藻原生質(zhì)體的傷害會(huì)加大，不利于后期大葉藻原生質(zhì)體成苗后續(xù)工作的進(jìn)行。生長(zhǎng)時(shí)間過(guò)短，大葉藻幼苗較小，未長(zhǎng)出子葉，獲得的原生質(zhì)體種類不全，并且缺少葉子部分的大葉藻幼苗重量太輕，得不到理想數(shù)量的大葉藻幼苗原生質(zhì)體。
(3)在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)中放入75％濃度的酒精，然后將暫養(yǎng)后的大葉藻幼苗浸泡在75％濃度的酒精10秒。
超凈工作臺(tái)在使用前要進(jìn)行紫外線燈照射，并開通無(wú)菌風(fēng)，照射時(shí)間為30分鐘，無(wú)菌操作室同時(shí)也要用紫外線燈照射30分鐘，關(guān)閉紫外線燈15分鐘后，人員進(jìn)入無(wú)菌室進(jìn)行具體操作。
(4)在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)中放入1％濃度的次氯酸鈉(NaCIO)溶液，然后將浸泡酒精后的大葉藻幼苗浸泡在1％濃度的次氯酸鈉溶液5分鐘。
(5)在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)中放入1.5％濃度的碘化鉀(KI)溶液，然后將浸泡次氯酸鈉溶液后的大葉藻幼苗浸泡在1.5％濃度的碘化鉀(KI)溶液10分鐘。
(6)將浸泡碘化鉀溶液后的大葉藻幼苗用無(wú)菌海水沖洗3次，即將大葉藻幼苗放入裝有無(wú)菌海水的培養(yǎng)皿中，用鑷子夾住幼苗，在水中涮洗，依次涮洗3次。再用無(wú)菌海水浸泡10分鐘，目的是去除殘留的碘化鉀、酒精、次氯酸鈉和生海水的殘留；然后用無(wú)菌海水恢復(fù)浸泡20分鐘，目的是讓大葉藻幼苗的細(xì)胞能從刺激的環(huán)境中恢復(fù)過(guò)來(lái)，使細(xì)胞處于一種良好的狀態(tài)，為下一步酶解作準(zhǔn)備。無(wú)菌海水浸泡和恢復(fù)大葉藻幼苗要在不同的培養(yǎng)皿中進(jìn)行。
無(wú)菌海水的制備方法是取生海水(該生海水系冷卻到室溫的煮沸過(guò)的海水)，在超凈工作臺(tái)中，經(jīng)過(guò)121℃、1030帕斯卡(N/m2)高壓滅菌后的不銹鋼濾器進(jìn)行抽濾，該不銹鋼濾器與無(wú)油膈膜真空泵配套使用進(jìn)行抽濾，抽濾濾膜孔徑為0.22微米，通過(guò)抽濾獲得無(wú)菌海水。
(7)將大葉藻幼苗從無(wú)菌海水撈出后用無(wú)菌棉布吸干，然后將大葉藻幼苗放入離心管(EP管)中并加入酶液1.25毫升，再用剪刀(本實(shí)施例采用長(zhǎng)10厘米的醫(yī)用手術(shù)剪刀)，離心管傾斜45度角，離酒精燈5～10厘米，在離心管中將大葉藻幼苗剪碎，一般剪碎時(shí)間在15～20分鐘之間，剪到大葉藻幼苗組織塊1立方毫米為宜。然后將裝有剪碎的大葉藻幼苗和酶液的離心管置于15℃溫度下酶解48小時(shí)。
無(wú)菌棉布剪成5×5厘米大小的正方形。在本實(shí)施例中，無(wú)菌棉布及需要無(wú)菌的器具都要用高壓滅菌鍋在121℃、1030帕斯卡(N/m2)高壓下滅菌25分鐘。
酶液配方為海水1000重量份，纖維素470重量份，果膠酶5重量份，山梨醇90重量份，本實(shí)施例以配置1.25毫升酶液為例，需1.25毫升海水(即1.275克海水，海水的密度按1.02克/厘米3計(jì)算)，纖維素酶0.6克，果膠酶0.0062克，山梨醇0.115克，用移液槍取1.25毫升海水加入到試管中，然后分別加入纖維素酶0.6克，果膠酶0.0062克，山梨醇0.115克。搖勻后，用離心機(jī)在500r/min轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，去沉淀，將已去沉淀的上清液倒到新的離心管中，該上清液即為酶液。然后用濃度為1摩爾/升(即1N HCL)的鹽酸將酶液調(diào)成pH值為4，配制好的酶液通過(guò)針頭濾器，在操作凈工作臺(tái)抽濾，制成無(wú)菌酶液，針頭濾器濾膜孔徑為0.22微米。酶液保存溫度不要超過(guò)20℃，避免酶液失活。本實(shí)施例采用將制備好的酶液暫放到4℃冰箱冷藏保存，使用時(shí)從冰箱拿出，在無(wú)菌室內(nèi)恢復(fù)到常溫使用，酶液最好是當(dāng)天配當(dāng)天用。
(8)酶解結(jié)束后，向酶液中加入與含有剪碎的大葉藻幼苗組織的酶液相同體積，濃度為2摩爾/立方厘米(2mol/dm3)的葡萄糖液體，使大葉藻幼苗原生質(zhì)體漂浮在液體表面，加入葡萄糖液體后蓋好離心管的蓋子，然后緩慢搖勻，搖勻時(shí)間為1分鐘，搖勻后樹立靜置20分鐘，等單個(gè)的游離大葉藻幼苗原生質(zhì)體細(xì)胞漂浮在液體上層，大的組織塊沉在底部。通過(guò)移液槍取1.5毫升上清液，這時(shí)上清液有些渾濁，用300目的尼龍材質(zhì)過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾上清液以去除沉淀雜物，該沉淀雜物主要成分為未酶解的組織塊、細(xì)胞碎片。過(guò)濾后的上清液主要成分為大葉藻幼苗原生質(zhì)體。
(9)配置高滲海水，在過(guò)濾后的上清液中加入與上清液等體積高滲海水，用高滲海水洗3次在上清液中加入等體積的高滲海水搖勻后，在離心機(jī)2000r/min轉(zhuǎn)速(即每分鐘2000轉(zhuǎn))下旋轉(zhuǎn)5分鐘，離心后棄上清液，獲得沉淀物；在沉淀物中再次加入同樣體積的高滲海水搖勻后，在離心機(jī)2000r/min轉(zhuǎn)速下旋轉(zhuǎn)5分鐘，離心后棄上清液，獲得沉淀物；在沉淀物中再次加入同樣體積的高滲海水搖勻后，在離心機(jī)2000r/min轉(zhuǎn)速下旋轉(zhuǎn)5分鐘，離心后棄上清液，獲得沉淀物。這時(shí)沉淀物的主要成分就是大葉藻幼苗原生質(zhì)體。加高滲海水的目的是洗去多余的酶液、葡萄糖等雜質(zhì)，同時(shí)高滲海水對(duì)原生質(zhì)體是一種保護(hù)，使原生質(zhì)體處于一種脫水狀態(tài)，這樣可以減少離心對(duì)原生質(zhì)體的機(jī)械損傷。最后一次獲得的沉淀物中加入1毫升的MS液體培養(yǎng)液懸浮原生質(zhì)體，利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行血球計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果為19.5×105個(gè)/毫升，400×鏡下每個(gè)視野大葉藻原生質(zhì)體數(shù)在40個(gè)左右，單個(gè)大葉藻幼苗原生質(zhì)體直徑為12～15微米，如圖3所示。通過(guò)甲基藍(lán)和中性紅檢測(cè)活性，大葉藻幼苗原生質(zhì)體存活率為80～90％，如圖4和圖5所示。
本實(shí)施例高滲海水配制比例為消毒海水100毫升，氯化鈉(Nacl)1.5克，氯化鈣(CaCl2)0.11克，氯化鈉、氯化鈣全部溶解在消毒海水后，通過(guò)不銹鋼濾器在超凈工作臺(tái)進(jìn)行抽濾，不銹鋼濾器濾膜孔徑為0.22微米。這里的消毒海水為煮沸過(guò)的海水，消毒海水煮沸時(shí)間為10分鐘。
MS液體培養(yǎng)液配制比例為100毫升海水需0.48g(80萬(wàn)單位)青霉素0.006克，100萬(wàn)單位的鏈霉素0.01克，MS培養(yǎng)基3.474克，濃度為2毫克/升的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.25毫升。用量筒量取100毫升海水，依次添加MS培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、2，4-二氯苯氧乙酸，搖均或攪拌均勻即可得到MS液體培養(yǎng)液。
(10)將溶解大葉藻幼苗原生質(zhì)體物的MS液體培養(yǎng)液用離心機(jī)在2000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心5分鐘即可收集到大葉藻幼苗原生質(zhì)體，此時(shí)的大葉藻幼苗原生質(zhì)體為略微發(fā)白的沉淀物。
本實(shí)施例重量通過(guò)電子天平稱得。
圖2為本發(fā)明在PH4、15℃、0.6克纖維素酶濃度條件下處理48小時(shí)后400×鏡下視野的照片，圖2中的橢圓球?yàn)榇笕~藻幼苗原生質(zhì)體，近似透明的不規(guī)則體是死掉的原生質(zhì)體進(jìn)水后膨脹留下的殘骸，即細(xì)胞碎片。每個(gè)視野下大葉藻幼苗原生質(zhì)體個(gè)體數(shù)目為40個(gè)左右，本發(fā)明大葉藻幼苗原生質(zhì)體個(gè)體數(shù)量是通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，在纖維素酶濃度、酶解時(shí)間、PH值、溫度上分別作了梯度實(shí)驗(yàn)，纖維素酶濃度、酶解時(shí)間、PH值、溫度與大葉藻幼苗原生質(zhì)體釋放量關(guān)系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果折線統(tǒng)計(jì)圖分別見圖6、圖7、圖8、圖9。
圖3是本發(fā)明酶解處理48小時(shí)后測(cè)定大葉藻幼苗原生質(zhì)體直徑的照片。本發(fā)明大葉藻幼苗原生質(zhì)體直徑是通過(guò)倒置攝像顯微鏡上配置測(cè)量細(xì)胞大小的計(jì)算機(jī)利用軟件進(jìn)行測(cè)量。圖3中的藍(lán)線是電腦測(cè)定原生質(zhì)體直徑的線段，藍(lán)線上面有顯示原生質(zhì)體直徑的數(shù)字，圖3右下角有紅色標(biāo)尺，紅色標(biāo)尺長(zhǎng)度為100微米。通過(guò)計(jì)算機(jī)測(cè)量，單個(gè)大葉藻幼苗原生質(zhì)體直徑為12～15微米。
圖4是大葉藻幼苗原生質(zhì)體在PH4、15℃、0.6克纖維素酶濃度條件下，酶解48小時(shí)后通過(guò)中性紅和甲基藍(lán)混合染色后，普通顯微鏡視野下拍照的照片，圖4照片中粉紅色的物質(zhì)為有活性的大葉藻幼苗原生質(zhì)體，深藍(lán)色的物質(zhì)為沒(méi)有活性的大葉藻幼苗原生質(zhì)體，其它的東西為雜質(zhì)。
圖5是大葉藻幼苗原生質(zhì)體在PH4、15℃、0.6克纖維素酶濃度條件下，酶解48小時(shí)后通過(guò)中性紅和甲基藍(lán)混合染色后，在相差顯微鏡下拍照的照片。圖4照片中黑色物質(zhì)為沒(méi)有活性的大葉藻幼苗原生質(zhì)體，粉紅色物質(zhì)為有活性的大葉藻幼苗原生質(zhì)體，白色外殼的長(zhǎng)條物和小灰黑點(diǎn)物質(zhì)為雜質(zhì)和死掉的原生質(zhì)體分解后的殘骸，即細(xì)胞碎片。
本發(fā)明通過(guò)中性紅和甲基藍(lán)染色后，隨機(jī)照取100張照片，按照公式存活率＝活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)算出大葉藻幼苗原生質(zhì)體存活率平均值。通過(guò)中性紅和甲基藍(lán)混合染色后，有活性的原生質(zhì)體淺染，在顯微鏡下為粉紅色；失活的原聲質(zhì)體深染，在顯微鏡下為深藍(lán)色。通過(guò)活性檢測(cè)，大葉藻幼苗原生質(zhì)體存活率為80～90％。
本發(fā)明所述PH4表示酶液的酸堿值，即PH值為4；所述15℃表示酶液保持的溫度；0.6克纖維素酶濃度表示0.6克纖維素酶溶于1.25毫升海水中纖維素酶的濃度，1.0克纖維素酶濃度表示1.0克纖維素酶溶于1.25毫升海水中纖維素酶的濃度，其它纖維素酶濃度的含義依次類推。
圖6為纖維素酶濃度與大葉藻幼苗原生質(zhì)體釋放量關(guān)系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果折線統(tǒng)計(jì)圖。通過(guò)圖6可以看到，在0.075克～1.0克纖維素酶濃度范圍內(nèi)，隨著纖維素酶濃度的升高獲得大葉藻幼苗原生質(zhì)體的數(shù)量逐漸提高。大葉藻幼苗原生質(zhì)體數(shù)量與纖維素酶濃度呈正相關(guān)。在0.6克至1.0克纖維素酶濃度下，得到較高數(shù)量的大葉藻幼苗原生質(zhì)體。由于海水量是固定的，隨著纖維素酶濃度的增加，酶液逐漸趨于粘稠狀，在1.0克纖維素酶濃度下大部分纖維素酶都沒(méi)有溶解，并且得到的大葉藻幼苗原生質(zhì)體數(shù)量與0.6克纖維素酶濃度相差不多。所以本發(fā)明選0.6克的纖維素酶濃度為最佳酶解濃度。此外，隨著纖維素酶濃度的升高，酶液中所含對(duì)原生質(zhì)體具有毒性的物質(zhì)增多，導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂，也是影響大葉藻幼苗原生質(zhì)體數(shù)量的一個(gè)因素。
圖7為酶解時(shí)間與大葉藻幼苗原生質(zhì)體釋放量關(guān)系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果折線統(tǒng)計(jì)圖。通過(guò)圖7可知，在0～80小時(shí)的時(shí)間范圍內(nèi)，大葉藻幼苗原生質(zhì)體產(chǎn)量開始隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)達(dá)到48小時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到最大值，為3.9×106個(gè)/毫升，隨后，大葉藻幼苗原生質(zhì)體產(chǎn)量隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而開始下降，當(dāng)酶解超過(guò)60小時(shí)后，原生質(zhì)體數(shù)量趨于平穩(wěn)。因此，酶解48小時(shí)是最佳酶解時(shí)間。
圖8為PH值與大葉藻幼苗原生質(zhì)體釋放量關(guān)系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果折線統(tǒng)計(jì)圖。從圖8可知，隨pH值增加，大葉藻幼苗原生質(zhì)體釋放量也逐步增加，在pH值為3～4時(shí)，適合大葉藻幼苗原生質(zhì)體的產(chǎn)生。當(dāng)pH值為4.0時(shí)，大葉藻幼苗原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為1.3×106個(gè)/毫升，當(dāng)pH值大于4，大葉藻幼苗原生質(zhì)體釋放量大幅度降低。
圖9為溫度與大葉藻幼苗原生質(zhì)體釋放量關(guān)系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果折線統(tǒng)計(jì)圖。從圖9可知，酶解溫度15～20℃時(shí)，適合大葉藻幼苗原生質(zhì)體的產(chǎn)生。在15℃時(shí)，大葉藻幼苗原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，達(dá)4.4×106個(gè)/毫升，酶解溫度低于或者高于15℃時(shí)，大葉藻幼苗原生質(zhì)體產(chǎn)量均下降。可見，15℃是酶解的最適溫度。低于或高于此溫度，大葉藻幼苗原生質(zhì)體產(chǎn)量均受影響。本發(fā)明選用15℃，該溫度低于大葉藻的生活溫度，從而不影響后續(xù)大葉藻幼苗原生質(zhì)體的再生。
本實(shí)施例所用儀器均可在市場(chǎng)上購(gòu)買，其來(lái)源及規(guī)格型號(hào)見下表 本實(shí)施例所用試劑均可在市場(chǎng)上購(gòu)買，所用原料來(lái)源及規(guī)格見下表
權(quán)利要求
1.一種無(wú)菌大葉藻幼苗原生質(zhì)體的制備方法，其特征在于，其步驟是
(1)將大葉藻幼苗放入雙抗海水中暫養(yǎng)2天；
(2)選取剛萌發(fā)的大葉藻幼苗；
(3)將暫養(yǎng)后的大葉藻幼苗浸泡在75％濃度的酒精10秒；
(4)將大葉藻幼苗浸泡在1％濃度的次氯酸鈉溶液5分鐘；
(5)將大葉藻幼苗浸泡在1.5％濃度的碘化鉀溶液10分鐘；
(6)將大葉藻幼苗用無(wú)菌海水沖洗3次，再用無(wú)菌海水浸泡10分鐘，然后用無(wú)菌海水恢復(fù)浸泡20分鐘；
(7)將大葉藻幼苗從無(wú)菌海水撈出后用無(wú)菌棉布吸干，然后將大葉藻幼苗放入離心管中并加入酶液，酶液配方為海水1000重量份，纖維素酶470重量份，果膠酶5重量份，山梨醇90重量份，再用剪刀在離心管中將大葉藻幼苗剪碎，剪碎的大葉藻幼苗在酶液中進(jìn)行酶解；
(8)酶解結(jié)束后，向酶液中加入等體積葡萄糖液體，靜置，取上清液，然后過(guò)濾；
(9)配置高滲海水，在過(guò)濾后的上清液中加入等體積高滲海水，用高滲海水洗3次在上清液中加入等體積的高滲海水搖勻后，在離心機(jī)2000r/min轉(zhuǎn)速下旋轉(zhuǎn)5分鐘，離心后棄上清液，獲得沉淀物；在沉淀物中再次加入等體積的高滲海水搖勻后，在離心機(jī)2000r/min轉(zhuǎn)速下旋轉(zhuǎn)5分鐘，離心后棄上清液，獲得沉淀物；在沉淀物中再次加入等體積的高滲海水搖勻后，在離心機(jī)2000r/min轉(zhuǎn)速下旋轉(zhuǎn)5分鐘，離心后棄上清液，獲得沉淀物；
(10)第3次離心獲得的沉淀物中加入培養(yǎng)液，搖勻后用離心機(jī)在2000r/min的轉(zhuǎn)速下離心，即可收集到大葉藻幼苗原生質(zhì)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種無(wú)菌大葉藻幼苗原生質(zhì)體的制備方法，其特征在于步驟(7)的酶解條件為酶液PH值為4，溫度保持15℃，0.6克纖維素酶濃度，酶解時(shí)間48小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種無(wú)菌大葉藻幼苗原生質(zhì)體的制備方法，其特征在于步驟(8)所述葡萄糖液體濃度為2摩爾/立方厘米，所述過(guò)濾的網(wǎng)孔徑為300目。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種無(wú)菌大葉藻幼苗原生質(zhì)體的制備方法，其具體步驟是將大葉藻幼苗放入雙抗海水中暫養(yǎng)2天；選取剛萌發(fā)的大葉藻幼苗；依次通過(guò)75％濃度的酒精、1％濃度的次氯酸鈉溶液、1.5％濃度的碘化鉀溶液消毒；用無(wú)菌海水沖洗、浸泡和恢復(fù)；大葉藻幼苗在離心管中加入酶液并剪碎，然后進(jìn)行酶解；酶解結(jié)束后加入葡萄糖液體并過(guò)濾；用高滲海水洗3次并離心獲得沉淀物；沉淀物中加入培養(yǎng)液離心獲得原生質(zhì)體。本發(fā)明能夠克服污染，獲得無(wú)菌大葉藻幼苗原生質(zhì)體，為原生質(zhì)體融合，遺傳轉(zhuǎn)化，植株再生，新品種培育等工作打下基礎(chǔ)，另外，本發(fā)明也能為建立大葉藻細(xì)胞工程繁殖技術(shù)，快速繁育優(yōu)良大葉藻品系，改良大葉藻遺傳工程提供技術(shù)儲(chǔ)備。
文檔編號(hào)C12N5/04GK101768568SQ20101013259
公開日2010年7月7日 申請(qǐng)日期2010年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月28日
發(fā)明者錢冠蘭, 李曉捷, 羅世菊, 張壯志, 劉延嶺, 王宏梅, 李志凌, 趙楠, 賽珊, 宋少峰 申請(qǐng)人:山東東方海洋科技股份有限公司