專利名稱：一種西瓜枯萎病病原菌原生質體的制備方法
一種西瓜枯萎病病原菌原生質體的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種病原菌原生質體的制備方法，具體涉及一種用于綠色熒光蛋白標記的西瓜枯萎病病原菌原生質體的制備方法。
背景技術：
西瓜枯萎病由尖孢鐮刀菌西瓜?；?Fusarium oxysporum f.sp.niveum)侵染所致，是西瓜上為害最嚴重的病害，在世界各西瓜產(chǎn)區(qū)均造成較大損失。植株一旦發(fā)病即很難治愈，是嚴重制約西瓜生產(chǎn)的病害之一。綠色突光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)是已被廣泛應用的報告基因，1962年在發(fā)光水母中發(fā)現(xiàn)。由于其本身是一種發(fā)光蛋白，具有穩(wěn)定、直觀、操作方便的熒光性質和不需添加外源底物就可以在活細胞中直接進行定位檢測和觀察等優(yōu)點，克服了分子生物學研究中傳統(tǒng)報告基因的不足。將綠色熒光蛋白基因轉化西瓜枯萎菌，所獲得的轉化子接種西瓜，研究其侵染過程，對于香蕉枯萎菌的防治將會提供一定的理論基礎。原生質體轉化方法是GFP轉化的手段之一，相比基因槍法和電激法，其不受昂貴儀器使用的限制，僅需試驗室的一些常規(guī)儀器。但原生質體的制備是細胞融合和遺傳轉化的關鍵，高質量的原生質體可以提高轉化的成功率與效率。不同屬、種，甚至不同專化型菌株由于菌體自身存在差異，在新鮮菌絲的培養(yǎng)方法及裂解酶的選擇上會存在差異。`
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種西瓜枯萎病病原菌原生質體的制備方法，為西瓜枯萎病菌原生質體轉化、基因表達等遺傳操作奠定基礎，且大大縮短了研究所需時間，提高了轉化效率。本發(fā)明是通過以下技術方案解決上述技術問題的:一種西瓜枯萎病病原菌原生質體的制備方法，包括如下步驟:步驟一、將西瓜枯萎病病原菌接種到PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天；接著將PSA培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的分生孢子接種到150mL PDB培養(yǎng)基上；并將該PDB培養(yǎng)基置于恒溫搖床上進行振蕩培養(yǎng)24h，溫度設定為28°C，轉速180r/min，振蕩培養(yǎng)結束后將培養(yǎng)液經(jīng)4層紗布過濾獲得菌絲，且將獲得的菌絲采用0.8mol/L NaCl進行充分洗滌；步驟二、在50mL已滅菌的三角瓶中加入5mL預先配制好的10mg/mL溶壁酶酶液、250mg步驟一中洗滌后的菌絲，接著將該三角瓶置于恒溫搖床上進行振蕩培養(yǎng)3-4h，溫度設定為30°C，轉速80r/min ;振蕩培養(yǎng)結束后采用3層擦鏡紙對三角瓶內(nèi)的溶液進行過濾，將過濾獲得的濾液置于滅菌過的15mL尖底離心管中進行轉速4000rpm、溫度4°C、為時IOmin的初次離心以收集孢子，然后棄上清將孢子用Iml STC溶解之后再轉入滅菌過的15mL尖底離心管中進行二次離心以獲得2-5X IO7個/mL的孢子液，二次離心的轉速為3500rpm、溫度為常溫、時間為IOmin ；
步驟三、取5 μ g質粒DNA及200 μ I原生質體在離心管中混勻,之后將該離心管于室溫下靜置20min，接著加入1-1.25ml 40% PTC至該離心管中，輕輕混勻后于室溫下再放置20min以獲得反應液，接著將往該反應液中加入IOOmL冷卻至50°C的含0.9%瓊脂再生培養(yǎng)基混勻后，倒于含0.9%瓊脂的再生培養(yǎng)基上，28°C倒置培養(yǎng)3-5d后獲得轉化子，連續(xù)轉接4次至含150ug/ml潮霉素B的PDA上以篩選獲得性狀穩(wěn)定的轉化子，即獲得用于綠色熒光蛋白標記的西瓜枯萎病病原菌原生質體。本發(fā)明一種西瓜枯萎病病原菌原生質體的制備方法的有益效果在于:確定了原生質體形成的適宜條件，為西瓜枯萎病菌原生質體轉化、基因表達等遺傳操作奠定基礎，且大大縮短了研究所需時間，提高了轉化效率。
具體實施方式為了更好的對本發(fā)明一種西瓜枯萎病病原菌原生質體的制備方法進行闡述說明，申請了例舉了如下實施例。

實施例一1、菌源的準備將鑒定的西瓜枯萎病病原菌(137)接種到PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，備用。二、試驗試劑采用購自廣東省微生物研究所的溶壁酶(Lywallzyme)制備10mg/mL溶壁酶酶液，具體地，稱取所需的溶壁酶酶量，用0.8mol/L的滲透壓穩(wěn)定劑將其溶解，該滲透壓穩(wěn)定劑選用 NaCl、KCl、鹿糖(sucrose)和山梨醇(sorbitol)4 種。三、西瓜枯萎病病原菌原生質體的制備過程步驟一、將在PSA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天所獲得的分生孢子接種到150mLPDB培養(yǎng)基上；并將該PDB培養(yǎng)基置于恒溫搖床上進行振蕩培養(yǎng)24h，溫度設定為28°C，轉速180r/min,振蕩培養(yǎng)結束后將培養(yǎng)液經(jīng)4層紗布過濾獲得菌絲，且將獲得的菌絲采用0.8mol/LNaCl進行充分洗滌；步驟二、在50mL已滅菌的三角瓶中加入5mL預先配制好的10mg/mL溶壁酶酶液、250mg步驟一中洗滌后的菌絲，接著將該三角瓶置于恒溫搖床上進行振蕩培養(yǎng)3.5溫度設定為30°C，轉速80r/min ;振蕩培養(yǎng)結束后采用3層擦鏡紙對三角瓶內(nèi)的溶液進行過濾，將過濾獲得的濾液置于滅菌過的15mL尖底離心管中進行轉速4000rpm、溫度4°C、為時IOmin的初次離心以收集孢子，然后棄上清將孢子用Iml STC溶解之后再轉入滅菌過的15mL尖底離心管中進行二次離心以獲得2 X IO7個/mL的孢子液，二次離心的轉速為3500rpm、溫度為常溫、時間為IOmin ；步驟三、取5 μ g質粒DNA及200 μ I原生質體在離心管中混勻，之后將該離心管于室溫下靜置20min，接著加入Iml 40% PTC至該離心管中，輕輕混勻后于室溫下再放置20min以獲得反應液，接著將往該反應液中加入IOOmL冷卻至50°C的含0.9%瓊脂再生培養(yǎng)基混勻后，倒于含0.9%瓊脂的再生培養(yǎng)基上，28°C倒置培養(yǎng)5d后獲得轉化子，連續(xù)轉接4次至含150ug/ml潮霉素B的PDA上以篩選獲得性狀穩(wěn)定的轉化子，即獲得用于綠色熒光蛋白標記的西瓜枯萎病病原菌原生質體。為了簡化說明并便于比較本發(fā)明各實施例的相異處，在以下另外兩個實施例的說明中，僅針對相異處進行說明，而不再對相同處作重復贅述。實施例二本實施例與實施例一相比的不同點在于:在西瓜枯萎病病原菌原生質體的制備過程步驟二中振蕩培養(yǎng)的時間為4h ;步驟二中二次離心獲得的是3.5X IO7個/mL的孢子液；步驟三中加入離心管的40% PTC的量為1.25ml ;步驟三中倒于含9%瓊脂的再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)的時間為3d。實施例三本實施例與實施例一相比的不同點在于:在西瓜枯萎病病原菌原生質體的制備過程步驟二中振蕩培養(yǎng)的時間為3.5h，步驟二中二次離心獲得的是5X IO7個/mL的孢子液；步驟三中加入離心管的40% PTC的量為1.13ml ;步驟三中倒于含9%瓊脂的再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)的時間為4d。綜上，本發(fā)明確定了原生質體形成的適宜條件，為西瓜枯萎病菌原生質體轉化、基因表達等遺傳操作奠定基 礎，且大大縮短了研究所需時間，提高了轉化效率。
權利要求
1.一種西瓜枯萎病病原菌原生質體的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: 步驟一、將西瓜枯萎病病原菌接種到PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天；接著將PSA培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的分生孢子接種到150mL PDB培養(yǎng)基上；并將該PDB培養(yǎng)基置于恒溫搖床上進行振蕩培養(yǎng)24h，溫度設定為28°C，轉速180r/min，振蕩培養(yǎng)結束后將培養(yǎng)液經(jīng)4層紗布過濾獲得菌絲，且將獲得的菌絲采用0.8mol/L NaCl進行充分洗滌； 步驟二、在50mL已滅菌的三角瓶中加入5mL預先配制好的10mg/mL溶壁酶酶液、250mg步驟一中洗滌后的菌絲，接著將該三角瓶置于恒溫搖床上進行振蕩培養(yǎng)3-4h，溫度設定為30°C，轉速80r/min ;振蕩培養(yǎng)結束后采用3層擦鏡紙對三角瓶內(nèi)的溶液進行過濾，將過濾獲得的濾液置于滅菌過的15mL尖底離心管中進行轉速4000rpm、溫度4°C、為時IOmin的初次離心以收集孢子，然后棄上清將孢子用Iml STC溶解之后再轉入滅菌過的15mL尖底離心管中進行二次離心以獲得2-5 X 107個/mL的孢子液，二次離心的轉速為3500rpm、溫度為常溫、時間為IOmin ； 步驟三、取5 μ g質粒DNA及200 μ I原生質體在離心管中混勻，之后將該離心管于室溫下靜置20min，接著加入1-1.25ml 40% PTC至該離心管中，輕輕混勻后于室溫下再放置20min以獲得反應 液，接著將往該反應液中加入IOOmL冷卻至50°C的含0.9%瓊脂再生培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中含50ug/mlarmplin和100ug/ml hygromycin B混勻后，倒于含0.9%瓊脂的再生培養(yǎng)基上，28°C倒置培養(yǎng)3-5d后獲得轉化子，連續(xù)轉接4次至含150ug/ml潮霉素B的PDA上以篩選獲得性狀穩(wěn)定的轉化子，即獲得用于綠色熒光蛋白標記的西瓜枯萎病病原菌原生質體。
全文摘要
本發(fā)明西瓜枯萎病病原菌原生質體的制備方法，將在PSA培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的分生孢子接種到150mL PDB培養(yǎng)基上進行振蕩培養(yǎng)，接著將培養(yǎng)液過濾，把過濾獲得的菌絲采用0.8mol/L NaCl進行充分洗滌；之后將洗滌后的菌絲采用溶壁酶酶液溶解后依次經(jīng)初次離心、二次離心以獲得2-5×107個/mL的孢子液，然后將孢子液經(jīng)過系列操作以獲得性狀穩(wěn)定的轉化子，即獲得用于綠色熒光蛋白標記的西瓜枯萎病病原菌原生質體。本發(fā)明的優(yōu)點在于為西瓜枯萎病菌原生質體轉化、基因表達等遺傳操作奠定基礎，且大大縮短了研究所需時間，提高了轉化效率。
文檔編號C12N1/14GK103173358SQ20111043970
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月23日 優(yōu)先權日2011年12月23日 公開號201110439701.發(fā)明者肖榮鳳, 劉波, 朱育菁, 黃素芳, 陳燕萍 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物資源研究所