專利名稱：檢測(cè)肌鈣蛋白i的試劑盒及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白檢測(cè)方法及試劑盒，具體涉及檢測(cè)檢測(cè)肌鈣蛋白I的試劑盒及其制備方法，還涉及用該試劑盒檢測(cè)肌鈣蛋白I的方法。
背景技術(shù)：
心肌損傷標(biāo)志物是指在循環(huán)血液中可測(cè)出的生物化學(xué)物質(zhì)并能夠敏感、特異地反映心肌損傷(異常)及其嚴(yán)重程度的標(biāo)志物，因而其可以用于心肌損傷(異常)的篩查、診斷、評(píng)定預(yù)后和隨訪治療效果。在正常情況下，心肌損傷標(biāo)志物主要或僅存在于心臟(心 肌)，在心臟或心血管異常情況下由心臟大量釋放。心臟標(biāo)志物主要包括肌紅蛋白、肌鈣蛋白(cTn I和cTn T)、肌酸激酶同功酶(CK-MB)等。其中cTn I和cTn T被美國和歐洲心臟病協(xié)會(huì)一致評(píng)為診斷急性心肌梗塞的高特異性和高敏感性的確診標(biāo)志物。在心肌細(xì)胞損傷早期，游離于胞漿內(nèi)的cTn I和cTn T快速釋放出來，在血清/血漿中，3_6h升高，8_14h達(dá)到高峰，1-2周降至正常。因而對(duì)于早期cTn I/cTn T的檢測(cè)有助于為患者的治療贏得寶貴時(shí)間，并且對(duì)發(fā)病后較晚就診的病人也有很大意義。近年來，研究表明，當(dāng)骨骼肌損傷和腎功能衰弱時(shí)也會(huì)有cTn T的顯著升高，而cTn I則不會(huì)，因而cTn I更適宜于作為心肌梗塞的診斷標(biāo)志物，特異性更強(qiáng)。當(dāng)前檢測(cè)cTn I的常用方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、化學(xué)發(fā)光法、膠體金免疫層析(GICA)等。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的檢測(cè)靈敏度較高，但操作過程相對(duì)比較復(fù)雜，檢測(cè)所需時(shí)間較長；需要專門的儀器設(shè)備如酶標(biāo)儀來配合使用，操作人員需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)；檢測(cè)所需費(fèi)用較高，不能實(shí)現(xiàn)單人份檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光法精密度和靈敏度好，但需要專用設(shè)備，且儀器與試劑價(jià)格均較為昂貴，不適宜于小型醫(yī)院及醫(yī)療點(diǎn)。膠體金免疫層析操作簡單，檢測(cè)所需時(shí)間短，不需要專業(yè)技術(shù)人員操作，檢測(cè)費(fèi)用低，但該法只能實(shí)現(xiàn)定性或半定量檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度較低，不能檢測(cè)到超低濃度下的肌鈣蛋白I。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)在推廣使用中的局限性，本發(fā)明提供一種采用便攜式熒光檢測(cè)儀便可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)的高靈敏檢測(cè)試劑盒，其使用簡單、檢測(cè)速度快、成本低，可用于床邊診斷。本發(fā)明的檢測(cè)肌鈣蛋白I的試劑盒包括底板，從所述底板上的一端至另一端設(shè)置有依次連接的樣品墊、交聯(lián)物墊、連結(jié)墊、硝酸纖維素膜、吸水紙，交聯(lián)物墊包被了熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體的交聯(lián)物，所述硝酸纖維素膜設(shè)置有檢測(cè)條帶和質(zhì)控條帶，所述檢測(cè)條帶設(shè)置于靠近連結(jié)墊的一側(cè)并含有抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，所述質(zhì)控條帶設(shè)置于遠(yuǎn)離連結(jié)墊的一側(cè)并含有羊抗鼠IgG。優(yōu)選地，所述樣品墊、交聯(lián)物墊、連結(jié)墊、硝酸纖維素膜、吸水紙分別在各自連接處
相互重疊。優(yōu)選地，所述交聯(lián)物墊覆蓋在所述樣品墊與連結(jié)墊上。優(yōu)選地，所述樣品墊與連結(jié)墊對(duì)接在一起，所述交聯(lián)物墊覆蓋在所述樣品墊與連結(jié)墊上。本發(fā)明還提供所述試劑盒的制備方法，包括如下步驟(I)制備二氧化硅納米顆粒用含有環(huán)己烷、正己醇、Triton X-100的油包水微乳體系制備二氧化硅納米顆粒；(2)制備熒光二氧化硅納米顆粒用3-氨丙基三甲氧基硅烷將所述二氧化硅納米顆粒表面氨基化，再通過共價(jià)交聯(lián)的方式在其表面交聯(lián)上稀土熒光螯合物；(3)制備熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體交聯(lián)物用高碘酸鈉將標(biāo)記用抗肌鈣蛋白I單克隆抗體氧化，再將所述抗體與表面氨基化的熒光二氧化硅納米顆粒混勻，發(fā)生共價(jià)反應(yīng)而形成熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體交聯(lián)物；(4)制備交聯(lián)物墊將所述熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體交 聯(lián)物包被于玻璃纖維上制成交聯(lián)物墊；(5)制備硝酸纖維素膜用噴膜儀分別將抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和羊抗鼠IgG設(shè)置且包被于硝酸纖維素膜的檢測(cè)條帶和控制條帶上，37°C下充分干燥。(6)依次將樣品墊、交聯(lián)物墊、連結(jié)墊、硝酸纖維素膜和吸水紙相互連接地粘貼至聚氯乙烯底板上。優(yōu)選地，在所述步驟(I)中，將比例為3 I I的環(huán)己烷、Triton X-100、正己醇混勻，在攪拌下依次加入超純水、氨水和四乙基原硅酸鹽，攪拌24h，用丙酮封閉，采用無水乙醇和超純水洗滌，即制得二氧化硅納米顆粒；在所述步驟(2)中，將步驟(I)所得的二氧化硅納米顆粒采用3-氨丙基三甲氧基硅烷進(jìn)行氨基化，用無水乙醇洗滌后再加入BHHCT反應(yīng)2h，用無水乙醇洗滌后懸浮于50mmol/L、pH值為7. 8的Tris，加入EuCl3使其螯合于顆粒表面的BHHCT上，再經(jīng)無水乙醇洗滌即獲得熒光二氧化硅納米顆粒；在所述步驟(3)中，采用高碘酸鈉將標(biāo)記用抗肌鈣蛋白I單克隆抗體糖鏈分子的羥基氧化為醛基，再將該抗體與表面氨基化的所述熒光二氧化硅納米顆?；靹颍l(fā)生共價(jià)反應(yīng)而形成熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體交聯(lián)物。優(yōu)選地，在所述步驟(4)和(5)中，將所述熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體交聯(lián)物噴灑于玻璃纖維上后，用凍干機(jī)冷凍干燥后作為交聯(lián)物墊；用Biodot點(diǎn)膜儀將包被用抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和羊抗鼠IgG噴至硝酸纖維素膜的檢測(cè)條帶和控制條帶上，充分干燥。優(yōu)選地，進(jìn)一步將所述聚氯乙烯底板分切成單人份試紙條，將單人份試紙條裝入配套的試劑盒條卡內(nèi)，將試劑盒條卡和干燥劑放入鋁箔袋內(nèi)，封口，最終獲得檢測(cè)肌鈣蛋白I的突光二氧化娃納米顆粒試劑盒。本發(fā)明還提供一種采用所述的試劑盒測(cè)定肌鈣蛋白I的方法，包括以下步驟(I)將樣品滴加至所述樣品墊上并滴加稀釋液；(2)所述樣品中的肌鈣蛋白I經(jīng)過所述交聯(lián)物墊的過程中與熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體特異性結(jié)合形成復(fù)合物；(3)所述復(fù)合物在經(jīng)過所述硝酸纖維素膜的過程中依次與相對(duì)于所述復(fù)合物不足量的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和羊抗鼠IgG異性結(jié)合；
(4)用熒光檢測(cè)儀測(cè)量熒光值；(5)如果質(zhì)控條帶的熒光值大于預(yù)設(shè)值，則表明檢測(cè)結(jié)果有效；如果質(zhì)控條帶的熒光值小于預(yù)設(shè)值，則表明樣品失效或者實(shí)驗(yàn)操作有誤，檢測(cè)結(jié)果無效；(6)如果檢測(cè)條帶和質(zhì)控條帶的熒光值均大于所述預(yù)設(shè)值，表明樣品中存在肌鈣蛋白I，為陽性；如果檢測(cè)條帶的熒光值小于所述預(yù)設(shè)值，質(zhì)控條帶的熒光值大于預(yù)設(shè)值，表明樣品中不存在肌鈣蛋白I，為陰性。本發(fā)明還提供另一種采用所述的試劑盒測(cè)定肌鈣蛋白I的方法，包括以下步驟(I)將樣品滴加至所述樣品墊上并滴加稀釋液；(2)所述樣品中的肌鈣蛋白I經(jīng)過所述交聯(lián)物墊的過程中與熒光二氧化硅納米顆 粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體特異性結(jié)合形成復(fù)合物；(3)所述復(fù)合物在經(jīng)過所述硝酸纖維素膜的過程中依次與相對(duì)于所述復(fù)合物不足量的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和羊抗鼠IgG異性結(jié)合；(4)用紫外燈采集熒光圖像；(5)如果質(zhì)控條帶出現(xiàn)熒光，則表明檢測(cè)結(jié)果有效；如果質(zhì)控條帶未出現(xiàn)熒光，則表明樣品失效或者實(shí)驗(yàn)操作有誤，檢測(cè)結(jié)果無效；(6)如果檢測(cè)條帶和質(zhì)控條帶均質(zhì)控條帶，表明樣品中存在肌鈣蛋白I，為陽性；如果檢測(cè)條帶未出現(xiàn)熒光而質(zhì)控條帶出現(xiàn)熒光，表明樣品中不存在肌鈣蛋白I，為陰性。本發(fā)明的有益效果如下。該試劑盒價(jià)格低廉，制備過程簡單，檢測(cè)速度快，15分鐘即可判斷結(jié)果。采用便攜式熒光檢測(cè)儀，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物的精確定量。其操作方便，可進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，且操作人員不需經(jīng)過培訓(xùn)；靈敏度高，特異性好，結(jié)果準(zhǔn)確，方便推廣使用。該試劑盒中的連結(jié)墊起到緩沖作用。使已包被(尤其是凍干)于交聯(lián)物墊上的納米顆粒標(biāo)記物充分溶解、釋放，否則會(huì)有部分殘留而致檢測(cè)信號(hào)減弱。


圖I為本發(fā)明的試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。其中，I、底板；2、樣品墊；3、交聯(lián)物墊；4、連結(jié)墊；5、硝酸纖維素膜；6、吸水紙；7、檢測(cè)條帶；8、質(zhì)控條帶。圖2為用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)肌鈣蛋白I的結(jié)果示意圖。其中圖2A為紫外光下熒光拍攝結(jié)果，圖2B為熒光檢測(cè)儀檢測(cè)后所作定量分析曲線圖；其中上方的熒光線為檢測(cè)條帶，下方的熒光線為質(zhì)控條帶。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方案進(jìn)行說明。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包括底板，從所述底板上的一端至另一端設(shè)置有依次連接的樣品墊、交聯(lián)物墊、連結(jié)墊、硝酸纖維素膜、吸水紙。交聯(lián)物墊包被了熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體的交聯(lián)物，所述硝酸纖維素膜設(shè)置有檢測(cè)條帶和質(zhì)控條帶，所述檢測(cè)條帶設(shè)置于靠近連結(jié)墊的一側(cè)并含有抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，所述質(zhì)控條帶設(shè)置于遠(yuǎn)離連結(jié)墊的一側(cè)并含有羊抗鼠IgG。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，參照附圖I中，所述樣品墊與連結(jié)墊對(duì)接在一起，所述交聯(lián)物墊覆蓋在所述樣品墊與連結(jié)墊上。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，按以下步驟制備試劑盒。(I)制備二氧化硅將30mL環(huán)己燒、IOmL Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)、IOmL正己醇混勻，在磁力攪拌下依次加入適量的超純水、氨水和四乙基原硅酸鹽(TEOS)，攪拌24h后，丙酮封閉，采用無水乙醇和超純水洗滌若干次，即可獲得二氧化硅納米顆?；鞈乙?。(2)制備熒光二氧化硅納米顆粒取上述ImL 二氧化硅納米顆?；鞈乙翰捎?-氨丙基三甲氧基硅烷進(jìn)行氨基化，用無水乙醇洗滌后再加入適量BHHCT (氯磺?；?鄰二苯基苯)反應(yīng)2h，用無水乙醇洗滌后懸浮于50mmol/L Tris7. 8，加入EuCl3 (三氯化銪)使其螯合于顆粒表面的BHHCT上，再經(jīng)無水乙醇洗滌即獲得熒光二氧化硅納米顆粒。(3)熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體交聯(lián)物的制備采用0. 5mol/L高碘酸鈉將0. 4mg標(biāo)記用抗肌I丐蛋白I單克隆抗體糖鏈分子的羥基氧化為醛基，再將該抗體與2mg表面氨基化的熒光二氧化硅納米顆?；靹?，發(fā)生共價(jià)反應(yīng)而形成熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體交聯(lián)物。(即，抗體的Fe端被氧化產(chǎn)生醛基，能夠和熒光二氧化硅納米顆粒表面的氨基交聯(lián)，從而被定向固定到顆粒表面。)(4)將適量的熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體交聯(lián)物 噴灑于玻璃纖維上，于凍干機(jī)冷凍干燥后作為交聯(lián)物墊，用Biodot點(diǎn)膜儀將包被用2mg/mL抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和2mg/mL羊抗鼠IgG噴至硝酸纖維素膜的檢測(cè)條帶和控制條帶上，充分干燥。(5)將交聯(lián)物墊、硝酸纖維素膜與未經(jīng)處理的樣品墊、連結(jié)墊、吸水紙粘貼至PVC底板上。(6)將上述粘貼好的PVC底板置于切條機(jī)上，分切成單人份試紙條。(7)將單人份試紙條裝入配套的試劑盒條卡內(nèi)。(8)將試劑盒條卡和干燥劑放入鋁箔袋內(nèi)，封口，常溫保存。(9)測(cè)試待檢的試紙條，考察其靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。最終獲得檢測(cè)肌鈣蛋白I的熒光二氧化硅納米顆粒試紙條成品。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述熒光二氧化硅納米顆粒采用油包水微乳體系合成空白二氧化硅納米顆粒后，再通過共價(jià)交聯(lián)的方式在其表面上修飾稀土螯合物(如BHHCT-Eu3+)，在紫外燈下可觀測(cè)到強(qiáng)烈熒光的稀土熒光納米顆粒。所述標(biāo)記用抗肌I丐蛋白I抗體購于美國Fitzgerald公司的單克隆抗體(批號(hào)M8010509)，所述捕獲用(試紙條的檢測(cè)線處固定抗肌鈣蛋白I抗體，用于層析時(shí)捕獲樣品中的肌鈣蛋白分子)抗肌鈣蛋白I抗體指購于美國Fitzgerald公司的單克隆抗體(批號(hào)M8010521，M0110609，M0110510)，三者按2 2 I混勻后噴于硝酸纖維素膜作為檢測(cè)條帶。靈敏度實(shí)驗(yàn)中cTn I購于美國Fitzgerald公司的標(biāo)準(zhǔn)抗原(批號(hào)A01101802)。采用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法及結(jié)果判斷如下，參見附圖2。從鋁箔袋中取出檢測(cè)試紙卡，平放于操作臺(tái)上，將70微升待檢樣品加入加樣孔中，再加入50微升緩沖液，15min后插入熒光檢測(cè)儀測(cè)量熒光值。如果樣品中有要檢測(cè)的肌鈣蛋白I存在，則檢測(cè)條帶處的熒光值會(huì)大于10，同時(shí)控制條帶的熒光值也會(huì)大于10，此時(shí)結(jié)果為陽性；如果樣品中沒有要檢測(cè)的肌鈣蛋白I存在，則檢測(cè)條帶處的熒光值小于10，但控制條帶處的熒光值大于10，此時(shí)結(jié)果為陰性；如果控制條帶處熒光值小于10，則產(chǎn)品無效。在本發(fā)明的檢測(cè)方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，采用紫外光下熒光成像的方式判斷結(jié)果?？蓪⒃嚰垪l放置紫外燈下，采用帶有濾光片的數(shù)碼相機(jī)采集熒光圖像。熒光圖像上，若檢測(cè)條帶與控制條帶均有熒光條帶，則結(jié)果為陽性；若僅控制帶出現(xiàn)熒光條帶，則結(jié)果為陰性；若檢測(cè)條帶與控制條帶均未出現(xiàn)熒光條帶，則產(chǎn)品無效。
所述紫外光下熒光成像是在中心波長為312nm和360nm的紫外燈下，采用鏡頭帶有濾光片(濾光范圍584-664nm)的數(shù)碼相機(jī)所進(jìn)行的突光拍攝。所述熒光檢測(cè)儀的激發(fā)波長為365nm，發(fā)射波長為625nm的可對(duì)試劑盒條卡進(jìn)行突光掃描的定量儀器。在本發(fā)明的另一個(gè)制備試劑盒的實(shí)施方式中，向帶有磁石的三角瓶于磁力攪拌下加入30mL環(huán)己烷、IOmL Triton X-100、IOmL正己醇，再依次于攪拌下加入500 y L超純水、60 ii L氨水和IOOii LTE0S,攪拌24h后加入等體積丙酮封閉反應(yīng),再用無水乙醇和超純水洗滌若干次，最后懸浮至ImL無水乙醇中，得到乳白色渾濁液即為合成的粒徑為SOnm左右的二氧化娃納米顆粒混懸液。再將此ImL 二氧化娃納米顆?；鞈乙恨D(zhuǎn)移至帶有磁石的圓底小瓶中，于磁力攪拌下加入3-氨丙基三甲氧基硅烷將二氧化硅納米顆粒表面修飾上氨基官能團(tuán)，反應(yīng)過夜后用無水乙醇洗滌后再加入120 ii L BHHCT (4mg/mL)反應(yīng)2h，經(jīng)無水乙醇洗滌后再懸浮于50mmol/LTris7. 8，加入30 y L EuCl3 (0. 04mol/L)使其螯合于顆粒表面的BHHCT上，再用乙醇洗滌即獲得熒光二氧化硅納米顆粒。此后再將該熒光二氧化硅納米顆粒微球進(jìn)行氨基化從而進(jìn)一步與抗體交聯(lián)，使其具有生物活性。在與抗體交聯(lián)時(shí)首先采 用0. 5mol/L高碘酸鈉將0. 4mg抗肌鈣蛋白I單克隆抗體糖鏈分子的羥基氧化為醛基，再將該抗體與2mg上述表面氨基化的熒光二氧化硅納米顆?；靹颍磻?yīng)過夜，熒光二氧化硅納米顆粒與抗體發(fā)生共價(jià)反應(yīng)而形成熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體交聯(lián)物。將該交聯(lián)物均勻得噴灑在玻璃纖維上，每毫升噴灑16平方厘米，冷凍干燥后封入鋁箔袋，室溫下保存?zhèn)溆?。在硝酸纖維素膜上用機(jī)器劃兩條平行帶，兩條帶間隔8mm，其中靠近玻璃纖維一端的條帶噴上抗肌I丐蛋白I單克隆抗體(用10mmol/L pH 7. 4PBS稀釋至2mg/mL)形成檢測(cè)帶；另一條帶噴上羊抗鼠二抗形成控制帶，37°C下烘干6h，封入鋁箔袋于干燥環(huán)境下室溫保存?zhèn)溆?。在單面塑料板上，先于中央貼好已平行包被抗體的硝酸纖維素膜(長30cm，寬2. 5cm)，再依次貼上加樣墊玻璃纖維(長30cm，寬I. 4cm)、噴有熒光二氧化硅納米顆?？贵w交聯(lián)物的交聯(lián)物墊玻璃纖維膜(長30cm，寬0. 8cm)、連結(jié)墊玻璃纖維(長30cm，寬0. 8cm)，最后貼上吸水紙(長30cm，寬3. 4cm)，膜與膜之間均重疊0. 2cm,以使其相互之間緊密相連，制成免疫層析試紙板。再用切條機(jī)將粘貼好的塑料板縱向切成4_寬的免疫層析試紙條，裝入紙條卡槽中，再封裝入鋁箔袋，室溫下保存?zhèn)溆?。在本發(fā)明的另一個(gè)使用試劑盒檢測(cè)的實(shí)施方式中，取出袋裝封裝的紙條卡，加入701^血清樣本于加樣孔中，再加入501^緩沖液(10臟01/1 Tris-HCl 9. 1,0. 5% BSA,0.4% NaCl, 0. 25%,0.6% Triton-X 100)，僅需層析15min，然后將試紙卡插入熒光紙條檢測(cè)儀進(jìn)行熒光信號(hào)采集，實(shí)現(xiàn)定量分析。如果膜上檢測(cè)帶與控制帶處的熒光讀值都大于10，則說明為陽性結(jié)果，檢測(cè)帶的熒光讀值越高則心肌標(biāo)志物cTn I的含量越高；如果只有控制帶處的熒光讀值大于10，則說明待測(cè)樣本中沒有cTn I，為陰性結(jié)果。如果檢測(cè)帶與控制帶處的熒光信號(hào)讀值都小于10，說明檢測(cè)無效。該檢測(cè)方法的靈敏度為2ng/mL，批內(nèi)與批間重復(fù)性較好。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)肌鈣蛋白I的試劑盒，所述試劑盒包括底板，從所述底板上的一端至另一端設(shè)置有依次連接的樣品墊、交聯(lián)物墊、連結(jié)墊、硝酸纖維素膜、吸水紙，其特征在于，交聯(lián)物墊包被了熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體的交聯(lián)物，所述硝酸纖維素膜設(shè)置有檢測(cè)條帶和質(zhì)控條帶，所述檢測(cè)條帶設(shè)置于靠近連結(jié)墊的一側(cè)并含有抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，所述質(zhì)控條帶設(shè)置于遠(yuǎn)離連結(jié)墊的一側(cè)并含有羊抗鼠IgG。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述樣品墊、交聯(lián)物墊、連結(jié)墊、硝酸纖維素膜、吸水紙分別在各自連接處相互重疊。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述交聯(lián)物墊覆蓋在所述樣品墊與連結(jié)墊上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述樣品墊與連結(jié)墊對(duì)接在一起，所述交聯(lián)物墊覆蓋在所述樣品墊與連結(jié)墊上。
5.一種制備權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述試劑盒的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)制備二氧化硅納米顆粒用含有環(huán)己烷、正己醇、TritonX-100的油包水微乳體系制備二氧化硅納米顆粒； (2)制備熒光二氧化硅納米顆粒用3-氨丙基三甲氧基硅烷將所述二氧化硅納米顆粒表面氨基化，再通過共價(jià)交聯(lián)的方式在其表面交聯(lián)上稀土熒光螯合物； (3)制備熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體交聯(lián)物用高碘酸鈉將標(biāo)記用抗肌鈣蛋白I單克隆抗體氧化，再將所述抗體與表面氨基化的熒光二氧化硅納米顆?；靹颍l(fā)生共價(jià)反應(yīng)而形成熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體交聯(lián)物； (4)制備交聯(lián)物墊將所述熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體交聯(lián)物包被于玻璃纖維上制成交聯(lián)物墊； (5)制備硝酸纖維素膜用噴膜儀分別將抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和羊抗鼠IgG設(shè)置且包被于硝酸纖維素膜的檢測(cè)條帶和控制條帶上，37°C下充分干燥； (6)依次將樣品墊、交聯(lián)物墊、連結(jié)墊、硝酸纖維素膜和吸水紙相互連接地粘貼至聚氯乙烯底板上。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于， 在所述步驟⑴中，將比例為3 I I的環(huán)己烷、Triton X-100、正己醇混勻，在攪拌下依次加入超純水、氨水和四乙基原硅酸鹽，攪拌24h，用丙酮封閉，采用無水乙醇和超純水洗滌，即制得二氧化硅納米顆粒； 在所述步驟(2)中，將步驟(I)所得的二氧化硅納米顆粒采用3-氨丙基三甲氧基硅烷進(jìn)行氨基化，用無水乙醇洗漆后再加入BHHCT反應(yīng)2h,用無水乙醇洗漆后懸浮于50mmol/L、pH值為7. 8的TrisJPA EuCl3使其螯合于顆粒表面的BHHCT上，再經(jīng)無水乙醇洗滌即獲得熒光二氧化硅納米顆粒； 在所述步驟(3)中，采用高碘酸鈉將標(biāo)記用抗肌鈣蛋白I單克隆抗體糖鏈分子的羥基氧化為醛基，再將該抗體與表面氨基化的所述熒光二氧化硅納米顆?；靹?，發(fā)生共價(jià)反應(yīng)而形成熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體交聯(lián)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，在所述步驟(4)和(5)中，將所述熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體交聯(lián)物噴灑于玻璃纖維上后，用凍干機(jī)冷凍干燥后作為交聯(lián)物墊；用Biodot點(diǎn)膜儀將包被用抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和羊抗鼠IgG噴至硝酸纖維素膜的檢測(cè)條帶和控制條帶上，充分干燥。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步將所述聚氯乙烯底板分切成單人份試紙條，將單人份試紙條裝入配套的試劑盒條卡內(nèi)，將試劑盒條卡和干燥劑放入鋁箔袋內(nèi)，封口，最終獲得檢測(cè)肌鈣蛋白I的熒光二氧化硅納米顆粒試劑盒。
9.一種采用權(quán)利要求1-4所述的試劑盒測(cè)定肌鈣蛋白I的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將樣品滴加至所述樣品墊上并滴加稀釋液； (2)所述樣品中的肌鈣蛋白I經(jīng)過所述交聯(lián)物墊的過程中與熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體特異性結(jié)合形成復(fù)合物； (3)所述復(fù)合物在經(jīng)過所述硝酸纖維素膜的過程中依次與相對(duì)于所述復(fù)合物不足量的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和羊抗鼠IgG異性結(jié)合； (4)用熒光檢測(cè)儀測(cè)量熒光值； (5)如果質(zhì)控條帶的熒光值大于預(yù)設(shè)值，則表明檢測(cè)結(jié)果有效；如果質(zhì)控條帶的熒光值小于預(yù)設(shè)值，則表明樣品失效或者實(shí)驗(yàn)操作有誤，檢測(cè)結(jié)果無效； (6)如果檢測(cè)條帶和質(zhì)控條帶的熒光值均大于所述預(yù)設(shè)值，表明樣品中存在肌鈣蛋白I，為陽性；如果檢測(cè)條帶的熒光值小于所述預(yù)設(shè)值，質(zhì)控條帶的熒光值大于預(yù)設(shè)值，表明樣品中不存在肌鈣蛋白I，為陰性。
10.一種采用權(quán)利要求1-4所述的試劑盒測(cè)定肌鈣蛋白I的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將樣品滴加至所述樣品墊上并滴加稀釋液； (2)所述樣品中的肌鈣蛋白I經(jīng)過所述交聯(lián)物墊的過程中與熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體特異性結(jié)合形成復(fù)合物； (3)所述復(fù)合物在經(jīng)過所述硝酸纖維素膜的過程中依次與相對(duì)于所述復(fù)合物不足量的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和羊抗鼠IgG異性結(jié)合； (4)用紫外燈采集熒光圖像； (5)如果質(zhì)控條帶出現(xiàn)熒光，則表明檢測(cè)結(jié)果有效；如果質(zhì)控條帶未出現(xiàn)熒光，則表明樣品失效或者實(shí)驗(yàn)操作有誤，檢測(cè)結(jié)果無效； (6)如果檢測(cè)條帶和質(zhì)控條帶均質(zhì)控條帶，表明樣品中存在肌鈣蛋白I，為陽性；如果檢測(cè)條帶未出現(xiàn)熒光而質(zhì)控條帶出現(xiàn)熒光，表明樣品中不存在肌鈣蛋白I，為陰性。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)肌鈣蛋白I的試劑盒及其制備和使用方法，其中檢測(cè)肌鈣蛋白I的試劑盒包括底板，從所述底板上的一端至另一端設(shè)置有依次連接的樣品墊、交聯(lián)物墊、連結(jié)墊、硝酸纖維素膜、吸水紙，交聯(lián)物墊包被了熒光二氧化硅納米顆粒-抗肌鈣蛋白I單克隆抗體的交聯(lián)物，所述硝酸纖維素膜設(shè)置有檢測(cè)條帶和質(zhì)控條帶，所述檢測(cè)條帶設(shè)置于靠近連結(jié)墊的一側(cè)并含有抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，所述質(zhì)控條帶設(shè)置于遠(yuǎn)離連結(jié)墊的一側(cè)并含有羊抗鼠IgG。其采用便攜式熒光檢測(cè)儀便可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)的高靈敏檢測(cè)試劑盒，其使用簡單、檢測(cè)速度快、成本低，可用于床邊診斷。
文檔編號(hào)G01N33/533GK102680697SQ201110057358
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2011年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月10日
發(fā)明者雷文武 申請(qǐng)人:北京吉奧眾藝科技有限公司