肌鈣蛋白i競(jìng)爭(zhēng)比濁法檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種心肌肌鈣蛋白I競(jìng)爭(zhēng)免疫比濁法測(cè)定試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 心肌肌鈣蛋白I(cTnl)是心肌損傷敏感及特異性最強(qiáng)的標(biāo)志物之一，在急性心 肌損傷及心肌炎中作為判斷心肌細(xì)胞損傷的金標(biāo)準(zhǔn)，也作為冠動(dòng)脈綜合征危險(xiǎn)分層及預(yù) 后的關(guān)鍵生化標(biāo)志物。肌鈣蛋白屬于調(diào)節(jié)蛋白，分子呈球形，由肌鈣蛋白T(TnT)、肌鈣蛋 白I(Tnl)、肌鈣蛋白C(TnC)三條肽段組成，其中肌鈣蛋白I(cTnl)屬于一種堿性蛋白， 共210個(gè)氨基酸，在血清中游離形式只占4. 1 %，大部分與肌鈣蛋白T及C亞單位結(jié)合在 一起，以復(fù)合體形式存在（Ward DG, Cornes MP, Trayer IP. Structural consequences of cardiac troponin I phosphorylation. J Biol Chem, 2002, 277 (44): 41795.，此外還有可 能以氧化型、還原型、磷酸化、去磷酸化及蛋白降解形式釋放（Ward DG, Ashton PR, Trayer HR, et al. Additional PKA phosphorylation sites in human cardiac troponin I. Eur J Biochem, 2001，268 (1) : 179.)，屬于心肌損傷高敏感指標(biāo)性物質(zhì)，在"微型心肌損傷"中肌隹$ 蛋白I即可出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，因此是臨床上作為心肌細(xì)胞損傷的標(biāo)志性生化檢測(cè)項(xiàng)目之一。
[0003] 由于肌鈣蛋白I (cTnl)在血清中存在的形式多樣，而且衰減周期短，因此對(duì)識(shí)別肌 鈣蛋白I(cTnl)的抗體有很高要求，且不同方法制備的抗體在測(cè)定肌鈣蛋白I(cTnl)含量 時(shí)，所得結(jié)果也完全不同，使得臨床上對(duì)肌鈣蛋白I(cTnl)含量測(cè)定無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)化（Katrukha A,Bereznikova A, Filatov V, et al. Biochemical factos influencing measurement of cardiac troponin I in serum. Clin ChemLab-Med, 1999, 37(11/12):1091.)〇
[0004] 臨床上對(duì)肌鈣蛋白I (cTnl)的檢測(cè)靈敏度及特異性要求很高，雖然測(cè)定肌鈣蛋白 I(cTnl)的方法很多，但是定量測(cè)定受到許多因素的影響，從而導(dǎo)致各種檢測(cè)結(jié)果之間相差 很大。其中最主要原因是在患者血清中肌鈣蛋白I(cTnl)會(huì)有不同程度的降解、游離、復(fù)合 物形式及不同的清除率，形成肌鈣蛋白I(cTnl)在血清中的不同半衰期，因此各種檢測(cè)方 法中分別使用針對(duì)上述不同抗原決定簇的抗體，其免疫反應(yīng)必然有很大差異。
[0005] 目前關(guān)于比濁測(cè)定法測(cè)定肌鈣蛋白I(cTnl)的試劑有很多廠家，但是不管是試劑 靈敏度，還是特異性都很難滿足臨床檢測(cè)要求，這是因?yàn)榧♀}蛋白I(cTnl)在正常人血清 中含量極低，在〇.〇8ng/ml以下，而大多比濁法檢測(cè)極限在lng/ml，而且在此檢測(cè)極限情況 下，影響測(cè)定結(jié)果的因素也被成倍放大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)測(cè)定肌鈣蛋白I(cTnl)的試劑中存在靈 敏度，還是特異性都很難滿足臨床檢測(cè)要求的問(wèn)題，使得臨床上對(duì)肌鈣蛋白I(cTnl)含量 測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化；本發(fā)明是將待測(cè)樣本與免疫聚苯乙烯微球混合，待測(cè)樣本中的肌鈣蛋白I與 微球上抗體發(fā)生免疫復(fù)合反應(yīng)，由于抗體作用位點(diǎn)單一，避免形成具有濁度的大顆粒復(fù)合 物，當(dāng)加入2號(hào)試劑時(shí)，載體蛋白上的肌鈣蛋白I微型肽段與抗體發(fā)生免疫復(fù)合反應(yīng)，計(jì)算 濁度強(qiáng)度得出游離抗體濃度則可推算出待測(cè)物中心肌肌鈣蛋白I的濃度。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案
[0008] 1. 一種肌鈣蛋白I競(jìng)爭(zhēng)比濁法檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒包括：根據(jù)肌鈣蛋白I 全氨基酸序列合成相應(yīng)抗體作用位點(diǎn)的微型肽段（10-30個(gè)氨基酸），將合成肽段共價(jià)標(biāo)記 于惰性載體蛋白并制備成反應(yīng)試劑；同時(shí)采用肽段作用的抗體包被于聚苯乙烯微球上制備 成免疫乳膠試劑和純化人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)制備而成的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0009] 2.該試劑盒中的免疫膠乳試劑是按以下方法制備的：
[0010] (1)據(jù)肌鈣蛋白I(cTnl)氨基酸序列，分別選取氨基端（序列2)，羧基端（序列4) 和中心區(qū)（序列3)氨基酸序列，獲得其相應(yīng)肽段（序列5或8, 7或10和6或9)，一般氨基 殘基數(shù)在5-30個(gè)。采用多肽合成儀進(jìn)行合成，反相高效液相色譜法進(jìn)行分離純化；
[0011] (2)選用惰性蛋白作為載體，采用碳化二亞胺將獲取肽段與載體蛋白共價(jià)偶聯(lián)； 并將上述肽段混合后與載體蛋白進(jìn)行標(biāo)記，或分別與載體蛋白進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記完成后，對(duì)混 合體系進(jìn)行分離純化，獲得標(biāo)記量均一的肽段-載體蛋白標(biāo)記物；
[0012] (3)采用碳化二亞胺活化微球羧基，分別將上述作用位點(diǎn)的cTnl多隆抗體與活化 的羧基膠乳微球混合反應(yīng)，制備成免疫膠乳微球。
[0013] 3?該試劑盒中：
[0014] 試劑1 (免疫膠乳試劑）的配方是：緩沖液20mmol/L、促凝劑30g/L、氯化鈉9g/L、 cTnl單克隆抗體標(biāo)記微球cTnIAb-PS lg/L加純水至1000ml。
[0015] 試劑2(反應(yīng)試劑）的配方是：緩沖液20mmol/L、肽段-蛋白標(biāo)記物cTnl-BSA 0? 01g/L 加純水至 1000ml;
[0016] 標(biāo)準(zhǔn)品：純化人心肌肌媽蛋白I (cTnl) 5ng/ml、pH = 5. 8的PBS緩沖液。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 本發(fā)明是采用人工合成獲得所需人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的三條肽段，將獲得的 肽段分別與惰性載體蛋白制備成肽段-載體蛋白標(biāo)記物。同時(shí)利用三條肽段作為配體，聚 丙烯酰胺為配基制備的親和層析柱，將獲得的高效價(jià)血清進(jìn)行免疫親和層析，從而獲得針 對(duì)該肽段特異性識(shí)別的多克隆抗體。該抗體優(yōu)點(diǎn)是親和力高于相應(yīng)單克隆抗體，特異性與 相應(yīng)單克隆抗體相當(dāng)，且制備成本低，相對(duì)于單克隆抗體制備流程簡(jiǎn)單。
[0018] 將上述方法篩選獲得的抗體分別與羧基聚苯乙烯膠乳微球進(jìn)行化學(xué)固定，將獲得 的免疫聚苯乙烯微球與緩沖液制備成試劑1 (免疫乳膠試劑），將肽段-載體蛋白標(biāo)記物制 備成試劑2 (反應(yīng)試劑）。
[0019] 具體操作步驟如下：
[0020] 1.肌鈣蛋白I(cTnl)不同肽段抗體的制備：
[0021] (1)按常規(guī)方法（D.R.馬歇克J.T.門永R.R.布格斯等著，朱厚礎(chǔ)譯.蛋白質(zhì)純化 與鑒定實(shí)驗(yàn)指南.科技出版社，2000版。）提取自人血清中的肌鈣蛋白I(cTnl)肽鏈，并進(jìn) 行氨基酸序列測(cè)序，所得氨基酸序列（序列1):
[0022] Met Ala Asp gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala Pro Ala Pro lie Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys lie Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gin Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gin lie Ala Lys Gin Glu Leu Glu Arg Glu Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ser Thr Arg Cys Gin Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe Ala Glu Leu Gin Asp Leu Cys Arg Gin Leu His Ala Arg Val Asp Lys Val Asp Glu Glu Arg Tyr Asp lie Glu Ala Lys Val Thr Lys Asn lie Thr Glu 工le Ala Asp Leu Thr Gin Lys lie Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Thr Leu Arg Arg Val Arg lie Ser Ala Asp Ala Met Met Gin Ala Leu Leu Gly Ala Arg Ala Lys Glu Ser Leu Asp Leu Arg Ala His Leu Lys Gin Val Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Asn Arg Glu Val Gly Asp Trp Arg Lys Asn 工le Asp Ala Leu Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys Lys Phe Glu Ser
[0023] (2)利用蛋白水解酶定點(diǎn)水解肌鈣蛋白I(cTnl)肽鏈，采用凝膠排阻色譜法和反 相高效液相色譜法進(jìn)行肽段分布測(cè)定和純化，收集需要的肽段。
[0024] 1)氨基端肽段：長(zhǎng)度為70個(gè)氨基酸殘基，氨基酸序列在氨基端1~70殘基之內(nèi) (序列2)
[0025] Met Ala Asp gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala Pro
[0026] Ala Pro lie Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys lie Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gin Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gin lie Ala Lys Gin Glu Leu Glu Arg Glu Ala Glu Glu Arg Arg Gl