心肌肌鈣蛋白i均相酶免疫法測(cè)定試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及心肌肌鈣蛋白I均相酶免疫法測(cè)定試劑盒。本發(fā)明是應(yīng)用作用于人心 肌肌鈣蛋白I(CTnI)單肽鏈特定位點(diǎn)的抗體，及采用該抗體制備測(cè)定血清中心肌肌鈣蛋白 I(cTnl)含量的均相酶聯(lián)免疫試劑的方法。該發(fā)明制備的試劑盒可用于半自動(dòng)或全自動(dòng)生 發(fā)分析儀器，屬于醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 心肌肌鈣蛋白I(CTnI)是心肌損傷敏感及特異性最強(qiáng)的標(biāo)志物之一，在急性心 肌損傷及心肌炎中作為判斷心肌細(xì)胞損傷的金標(biāo)準(zhǔn)，也作為冠動(dòng)脈綜合征危險(xiǎn)分層及預(yù) 后的關(guān)鍵生化標(biāo)志物。肌鈣蛋白屬于調(diào)節(jié)蛋白，分子呈球形，由肌鈣蛋白T(TnT)、肌鈣蛋 白I(Tnl)、肌鈣蛋白C(TnC)三條肽段組成，其中肌鈣蛋白I(cTnl)屬于一種堿性蛋白， 共210個(gè)氨基酸，在血清中游離形式只占4. 1 %，大部分與肌鈣蛋白T及C亞單位結(jié)合在 一起，以復(fù)合體形式存在（Ward DG, Cornes MP, Trayer IP. Structural consequences of cardiac troponin I phosphorylation. J Biol Chem, 2002, 277 (44): 41795·)，此外還有可 能以氧化型、還原型、磷酸化、去磷酸化及蛋白降解形式釋放（Ward DG, Ashton PR, Trayer HR, et al. Additional PKA phosphorylation sites in human cardiac troponin I. Eur J Biochem, 2001，268 (I) : 179.)，屬于心肌損傷高敏感指標(biāo)性物質(zhì)，在"微型心肌損傷"中肌鈣 蛋白I即可出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，因此是臨床上作為心肌細(xì)胞損傷的標(biāo)志性生化檢測(cè)項(xiàng)目之一。
[0003] 由于肌鈣蛋白I(CTnI)在血清中存在的形式多樣，而且衰減周期短，因此 對(duì)識(shí)別肌鈣蛋白I(cTnl)的抗體有很高要求，且不同方法制備的抗體在測(cè)定肌鈣蛋 白I(cTnl)含量時(shí)，所得結(jié)果也完全不同，使得臨床上對(duì)肌鈣蛋白I(cTnl)含量測(cè) 定無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)化(KatrukhaA, BereznikovaA, Filatov V, et al. Biochemical factos influencing measurement ofcardiac troponin I in serum.Clin ChemLab Med, 1999, 37(11/12) :1091.)。
[0004] 臨床上對(duì)肌鈣蛋白I (CTnI)的檢測(cè)靈敏度及特異性要求很高，雖然測(cè)定肌鈣蛋白 I(cTnl)的方法很多，但是定量測(cè)定受到許多因素的影響，從而導(dǎo)致各種檢測(cè)結(jié)果之間相差 很大。其中最主要原因是在患者血清中肌鈣蛋白I(cTnl)會(huì)有不同程度的降解、游離、復(fù)合 物形式及不同的清除率，形成肌鈣蛋白I(cTnl)在血清中的不同半衰期，因此各種檢測(cè)方 法中分別使用針對(duì)上述不同抗原決定簇的抗體，其免疫反應(yīng)必然有很大差異。
[0005] 目前關(guān)于比濁測(cè)定法測(cè)定肌鈣蛋白I(CTnI)的試劑有很多廠家，但是不管是試劑 靈敏度，還是特異性都很難滿足臨床檢測(cè)要求，這是因?yàn)榧♀}蛋白I(cTnl)在正常人血清 中含量極低，在〇. 〇8ng/ml以下，而大多比濁法檢測(cè)極限在lng/ml，而且在此檢測(cè)極限情況 下，影響測(cè)定結(jié)果的因素也被成倍放大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)一組cTnl的微型肽段，將該組微型肽段分別標(biāo)記于載體酶 上(Friguet B, Djavadi-Ohaniance L, Pages J, Bussard A, Goldberg M. A convenient enzyme-linked immunosorbent assay for testing whether monoclonal antibodies recognize the same antigenic site.Application to hybridomas specific for the beta 2-subunit ofEscherichia coli tryptophan synthase. J Tmmunol Methods, 1983Jun 10:60(3) :351-8.)，與作用于該組肽段抗體共同組成一個(gè)測(cè)定樣本cTnl 的檢測(cè)試劑，該試劑可用于半自動(dòng)或全自動(dòng)生化分析儀器準(zhǔn)確、特異性的測(cè)定血清中心肌 肌鈣蛋白I(cTnl)含量。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案
[0008] 1. -種肌鈣蛋白I均相酶免疫法檢測(cè)試劑盒，其特征在于該檢測(cè)試劑盒包括：根 據(jù)肌鈣蛋白I全氨基酸序列合成相應(yīng)抗體作用位點(diǎn)10-30個(gè)氨基酸的微型肽段，將合成肽 段共價(jià)標(biāo)記于載體（酶蛋白）并制備反應(yīng)試劑；同時(shí)采用肽段作用的抗體制備成免疫酶試 劑和純化人心肌肌1丐蛋白I (cTnl)制備而成的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0009] 2.如權(quán)利要求1所述肌鈣蛋白I均相酶免疫法檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒 中的免疫酶試劑是按以下方法制備的：
[0010] ⑴據(jù)肌鈣蛋白I(cTnl)氨基酸序列，分別選取氨基端（序列2)，羧基端（序列4) 和中心區(qū)（序列3)氨基酸序列，獲得其相應(yīng)肽段（序列5或8, 7或10和6或9)，一般氨基 殘基數(shù)在5-30個(gè)，采用多肽合成儀進(jìn)行合成，反相高效液相色譜法進(jìn)行分離純化；
[0011] (2)選用酶蛋白作為載體，采用碳化二亞胺將獲取肽段與載體共價(jià)偶聯(lián)；并將上 述肽段混合后與載體進(jìn)行標(biāo)記，或分別與載體進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記完成后，對(duì)混合體系進(jìn)行分離 純化，獲得標(biāo)記量均一的肽段-酶標(biāo)記物；
[0012] (3)分別將上述作用位點(diǎn)的cTnl多克隆抗體與酶相應(yīng)底物制備成免疫反應(yīng)試劑。
[0013] 3.如權(quán)利要求1所述肌鈣蛋白I均相酶免疫法檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒 中
[0014] 免疫酶試劑的配方是：緩沖液20mmol/L、酶底物10g/L、cTnl多克隆抗體lg/L加 純水至1000ml ;
[0015] 反應(yīng)試劑的配方是：緩沖液20mmol/L、cTnl肽段-酶標(biāo)記物0. lg/L加純水至 1000 rnl ；
[0016] 標(biāo)準(zhǔn)品：純化人心肌肌鈣蛋白I (cTnl) 5ng/ml、pH = 5. 8的PBS緩沖液。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 本發(fā)明是采用人工合成獲得所需人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的三條肽段，將獲得的 肽段分別與載體（酶蛋白）制備成肽段-酶標(biāo)記物。同時(shí)利用三條肽段作為配體，聚丙烯 酰胺為配基制備的親和層析柱，將獲得的高效價(jià)血清進(jìn)行免疫親和層析，從而獲得針對(duì)該 肽段特異性識(shí)別的多克隆抗體。該抗體其優(yōu)點(diǎn)是親和力高于相應(yīng)單克隆抗體，特異性與相 應(yīng)單克隆抗體相當(dāng)，且制備成本低，相對(duì)于單克隆抗體制備流程簡(jiǎn)單。
[0018] 將上述方法篩選獲得的抗體、酶底物和緩沖液制備成試劑1 (免疫酶試劑）；將肽 段-酶標(biāo)記物和緩沖液制備成試劑2 (反應(yīng)試劑）。
[0019] 具體操作步驟如下：
[0020] 1.肌鈣蛋白I (cTnl)不同肽段抗體的制備：
[0021] (1)按常規(guī)方法（D.R.馬歇克J.T.門(mén)永R.R.布格斯等著，朱厚礎(chǔ)譯.蛋白質(zhì)純化 與鑒定實(shí)驗(yàn)指南.科技出版社，2000版。）提取自人血清中的肌鈣蛋白I(cTnl)肽鏈，并進(jìn) 行氨基酸序列測(cè)序，所得氨基酸序列（序列1):
[0022] Met Ala Asp gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala Pro Ala Pro He Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys lie Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gln Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln He Ala Lys Gin Glu Leu Glu Arg Glu Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ser Thr Arg Cys Gin Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe Ala Glu Leu Gln Asp Leu Cys Arg Gln Leu His Ala Arg Val Asp Lys Val Asp Glu Glu Arg Tyr Asp He GLU Ala Lys Val Thr Lys Asn lie Thr Glu He Ala Asp Leu Thr Gln Lys He Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Thr Leu Arg Arg Val Arg He Ser Ala Asp Ala Met Met Gin Ala Leu Leu Gly Ala Arg Ala Lys Glu Ser Leu Asp Leu Arg Ala His Leu Lys Gln Val Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Asn Arg Glu Val Gly Asp Trp Arg Lys Asn He Asp Ala Leu Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys Lys Phe Glu Ser
[0023] (2)利用蛋白水解酶定點(diǎn)水解肌鈣蛋白I(cTnl)肽鏈，采用凝膠排阻色譜法和反 相高效液相色譜法進(jìn)行肽段分布測(cè)定和純化，收集需要的肽段。
[0024] 1)氨基端肽段：長(zhǎng)度為70個(gè)氨基酸殘基，氨基酸序列在氨基端1~70殘基之內(nèi) (序列2)
[0025] Met Ala Asp gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala Pro Ala Pro I Ie Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys I Ie Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gln Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln I Ie Ala Lys Gin Glu Leu Glu Arg Glu Ala Glu Glu Arg Arg Gly
[0026] 2)中心區(qū)肽段：長(zhǎng)度為82個(gè)氨基酸殘基，氨基酸序列在氨基端34~116殘基之 內(nèi)（序列3):
[0027] His Ala Lys Lys Lys Ser Lys I Ie Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gln Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln I Ie Ala Lys Gin Glu Leu Glu Arg Glu Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ser Thr Arg Cys Gin Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe Ala Glu Leu Gln Asp Leu Cys Arg Gln Leu His Ala Arg Val Asp Lys Val Asp Glu Glu Arg Tyr Asp I Ie Glu
[0028] 3)羧基端肽段：長(zhǎng)度為101個(gè)氨基酸殘基，氨基酸序列在氨基端110~210殘基 之內(nèi)（序列4):
[0029] Glu Arg Tyr Asp I Ie Glu Ala Lys Val Thr Lys Asn I Ie Thr Glu He Ala Asp Leu Thr Gln Lys I Ie Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Thr Leu Arg Arg Val Arg I Ie Ser Ala Asp Ala Met Met Gin Ala Leu Leu Gly Ala Arg Ala Lys Glu Ser Leu Asp Leu Arg Ala His Leu Lys Gln Val Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Asn Arg Glu Val Gly Asp Trp Arg Lys Asn I Ie Asp Ala Leu Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys Lys Phe Glu Ser
[0030] 上述水解用蛋白酶可以蛋白酶K，胰凝乳蛋白酶，無(wú)花果蛋白酶，胃蛋白酶，鏈霉蛋 白酶，菠蘿蛋白酶，羧肽酶Y。水解時(shí)間為〇. 5~4小時(shí)，本發(fā)明優(yōu)選蛋白酶K和羧肽酶Y， 水解時(shí)間為1小時(shí)。
[0031] (3)用牛血清白蛋白分別將以上氨基端肽段、中心區(qū)肽段和羧基端肽段進(jìn)行修飾， 與弗氏佐劑混合對(duì)兔進(jìn)行免疫，也可選用山羊，本發(fā)明優(yōu)選兔。
[0032] 上述選用的肽段修飾載體也可選用雞卵清蛋白，兔血清白蛋白，纖維蛋白原，優(yōu)選 牛血清白蛋白。
[0033] (4)獲取兔抗人肌鈣蛋白I(cTnl)各肽段的高效價(jià)混合免疫血清，采用高效液相 色譜分離純化獲得各區(qū)段目標(biāo)多肽為配體，聚丙烯酰胺為配基的親和層析柱，將多克隆抗 體血清進(jìn)行親和層析
[0034] 獲得的具有高親和力和特異性的抗體，分別編號(hào)：
[0035] 識(shí)別氨基端肽段的抗體為：cTnl-Ab-l
[0036] 識(shí)別中心區(qū)肽段的抗體為：cTnI-Ab-2
[0037] 識(shí)別羧基端肽段的抗體為：cTnI-Ab-3。
[0038] 2.該試劑盒cTnl肽段-酶試劑是按以下方法制備的：
[0039] (1)肽段的合成
[0040] 根據(jù)肌鈣蛋白I(CTnI)氨基酸序列，分別選取羧基端、氨基端和中心區(qū)氨 基酸序列，獲得其相應(yīng)肽段，一般氨基殘基數(shù)在5~20個(gè)。采用多肽合成儀進(jìn)行合 成（MACKIERK，SMITHDM. (editor)Guidebooktoorganic synthesis. CHEN SHAO，DING CHENYUAN，CEN RENWAN G(Translators) ,Beijing :Science Press，1988