一種測定全量程?c反應蛋白的試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測定全量程?C反應蛋白的試劑盒及其制備方法，包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分：試劑R1：緩沖液、無機鹽離子、加速劑，試劑R2：緩沖液、穩(wěn)定劑、防腐劑、表面活性劑、助懸劑、膠乳包被抗C反應蛋白抗體，制備方法為：按照組分含量配制好試劑；將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應；用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值；根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中的全量程?C反應蛋白的試劑盒的濃度。本發(fā)明具有測定準確度高等優(yōu)點。
【專利說明】
一種測定全量程-C反應蛋白的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學及生物化學技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測定全量程-C反應蛋白的 試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] C反應蛋白（CRP)是指在機體受到感染或組織損傷時血漿中一些急劇上升的蛋白 質(zhì)，因其可以結(jié)合肺炎球菌細胞壁C-多糖的蛋白質(zhì)，故命名為C-反應蛋白，C反應蛋白（CRP) 可以激活補體和加強吞噬細胞的吞噬而起調(diào)理作用，從而清除入侵機體的病原微生物和損 傷，壞死，凋亡的組織細胞，在機體的天然免疫過程中發(fā)揮重要的保護作用，C反應蛋白 (CRP)由肝細胞所合成，具有激活補體和促進粒細胞及巨噬細胞的吞噬作用，C反應蛋白 (CRP)是第一個被認為是急性時相反應蛋白，正常情況下含量極微量，在急性床上和感染時 其血濃度急劇升高，是臨床上最常用的急性時相反應指標。
[0003] C反應蛋白（CRP)可用于細菌和病毒感染的鑒別診斷，C反應蛋白（CRP)升高與感染 的程度正相關(guān)，當病毒感染時，C反應蛋白（CRP)在絕大多數(shù)病毒感染中的血清濃度變化不 大或基本保持不變。CRP在急性局部缺血和心肌梗塞時升高。
[0004] C反應蛋白因檢測方法靈敏度的不同，可分為普通CRP、超敏CRP和全量程CRP。全量 程CRP的檢測和范圍均較為寬廣。
[0005] 目前，檢測全量程C反應蛋白（CRP)主要有酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫法、化學發(fā) 光、膠乳增強免疫比濁法等。酶聯(lián)免疫吸附法操作復雜、耗時長、對操作人員有較高的專業(yè) 技術(shù)要求，且無法完成定量檢測，檢測準確度也不高，放射免疫法有放射性元素，會對環(huán)境 產(chǎn)生污染，化學發(fā)光成本較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)操作復雜、具有環(huán)境污染以及測 定準確度低的缺陷，而提供一種測定全量程-C反應蛋白的試劑盒及其制備方法。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題提供的技術(shù)方案是:本發(fā)明公開了一種測定全量程-C反 應蛋白的試劑盒，包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: 緩沖液 20~180 mmol/L 無機鹽離子 15CK400 mmol/L 加速劑 10~70 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 20~180 mmol/L 穩(wěn)定劑 8~42 g/L 防腐劑 0.2~0.8 g/L 表面活性劑 1.0~3.0 mL/L 助懸劑 10~90 mmol/L 膠乳包被抗C反應蛋白抗體 1~8 g/L 其溶劑為純化水。
[0008] 作為優(yōu)選，本發(fā)明公開了一種測定全量程-C反應蛋白的試劑盒，包括彼此獨立的 試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: 緩沖液 100 mmol/L 無機鹽離子 220 mmol/L 加速劑 40g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 100 mmol/L 穩(wěn)定劑 25 g/L 防腐劑 0.5 g/L 表面活性劑 2.0 mL/L 助懸劑 50 mmol/L 膠乳包被抗C反應蛋白抗體 4 g/L 其溶劑為純化水。
[0009] 作為優(yōu)選，所述的試劑R1中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MES緩沖液、磷酸鹽緩 沖液、M0PS0緩沖液中的一種或多種的組合，所述的無機鹽離子采用氯化鉀、硫酸鉀、氯化鈉 中的一種或多種的組合，所述的加速劑采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷 酮中的一種或多種組合。
[0010]作為優(yōu)選，所述的試劑R2中，所述的緩沖液采用Tr i s緩沖液、MES緩沖液、磷酸鹽緩 沖液、M0PS0緩沖液中的一種或多種的組合，所述的穩(wěn)定劑采用牛血清白蛋白，所述的防腐 劑采用山梨酸鈉、苯甲酸鈉、疊氮鈉、硫柳汞、苯酚中的一種或多種的組合，所述的表面活性 劑為曲拉通-100,所述的助懸劑為甘油。
[0011]作為優(yōu)選，所述的膠乳包被抗C反應蛋白抗體的制備方法為：用50 mmol/L的MES緩 沖液將粒徑為80_500nm的聚苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為1%-5% 的溶液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸 鹽，在20-37 °C的條件下反應1小時，反應完成后加入2，2 硫代雙鎳，使用離心機，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液進行稀釋，再使用 離心機，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，再將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖 液進行稀釋，直至溶液中聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為〇.1%_2%，然后邊攪拌邊加入抗C反應 蛋白抗體，直至溶液中聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為0.5%-1.5%時為止，最后加入牛血清白蛋 白，直至牛血清白蛋白的濃度為15g/L為止，在4°C的條件下封閉16-24小時，即制備得到膠 乳包被抗C反應蛋白抗體。
[0012]作為優(yōu)選，本發(fā)明還公開了上述測定全量程-C反應蛋白的試劑盒的制備方法和使 用方法，包括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: 緩沖液 20~180 mmol/L 無機鹽離子 150~400 mmol/L 加速劑 10~70 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 20~180 mmol/L 穩(wěn)定劑 8~42 g/L 防腐劑 0.2~0.8 g/L 表面活性劑 1.0~3.0 mL/L 助懸劑 10~90 mmol/L 膠乳包被抗C反應蛋白抗體 1~8 g/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應； (c) 用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值； (d) 根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中的全量程-C反應蛋白的試劑盒的濃度。
[0013]作為優(yōu)選，步驟(b)中，所述的試劑R1和試劑R2的體積比為2:1。
[0014]作為優(yōu)選，步驟(b)中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1: 10到1:150之間。
[0015]本發(fā)明的檢測原理是:本發(fā)明主要的是利用抗原抗體反應的原理，樣品中C-反應 蛋白與試劑中的抗C反應蛋白抗體結(jié)合形成抗原-抗體復合物產(chǎn)生一定濁度，該濁度的高低 與CRP抗原的含量成正比。在一定波長下測定濁度并通過多點定標曲線，進行C-反應蛋白的 定量測定。
[0016] 樣本中全量程-C反應蛋白（Hs-CRP)的活性
式中：A At以空白管吸光度作對照的樣品管吸光度值 A As以空白管吸光度作對照的校準管吸光度值 Cs校準液中Hs-CRP的濃度。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點:本發(fā)明在試劑R1液中添加了加速劑， 在試劑R2中采用膠乳包被抗C反應蛋白抗體，對C反應蛋白的檢測靈敏度更高，檢測準確性 更好，在助懸劑的作用下，膠乳包被抗C反應蛋白抗體穩(wěn)定懸浮于試劑R2中，當和樣本反應 時，在加速劑的作用下，可迅速發(fā)生反應，即使在較低量的樣本下，也可以發(fā)生較為明顯的 發(fā)生抗原抗體反應，因此檢測準確度高，而且不會產(chǎn)生環(huán)境污染，另外檢測也比較方便。
【具體實施方式】
[0018] 以下結(jié)合具體實施例進一步說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實施例。
[0019] 實施例1 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: Tris緩沖液 100 mmol/L 氯化鉀 220 mmol/L 聚乙二醇-2000 40g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: MES緩沖液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 25 g/L 苯甲酸鈉 0.5 g/L 曲拉通-100 2.0 mL/L 甘油 50 mmol/L 膠乳包被抗C反應蛋白抗體 4 g/L 其溶劑為純化水。
[0020] 實施例2 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: MES緩沖液 180 mmol/L 硫酸鉀 400 mmol/L 聚乙二醇-8000 10 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 磷酸鹽緩沖液 20 mmol/L 牛血清白蛋白 8 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 曲拉通-100 3.0 mL/L 甘油 10mmol /], 膠乳包被抗C反應蛋白抗體 5 g/L 其溶劑為純化水。 實施例3 試劑盒的制備和使用方法 1、膠乳包被抗C反應蛋白抗體的制備：用50 mmol/L的MES緩沖液將粒徑為120nm的聚苯 乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為3%的溶液，然后每毫升溶液中加入 1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在25°C的條件下反應1小時，反 應完成后加入2，2'_硫代雙鎳，使用離心機，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液進行稀釋，再使用離心機，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下 離心30分鐘，去上清，再將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液進行稀釋，直至溶液中聚苯乙烯微 球的質(zhì)量濃度為1%，然后邊攪拌邊加入抗C反應蛋白抗體，直至溶液中聚苯乙烯微球的質(zhì)量 濃度為〇. 5%時為止，最后加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白的濃度為15g/L為止，在4 °C 的條件下封閉16小時，即制備得到膠乳包被抗C反應蛋白抗體； 2、 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 100 mmol/L 氯化鉀 220 mmol/L 聚乙二醇-2000 40g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: MES緩沖液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 25 g/L 苯甲酸鈉 0.5 g/L 曲拉通-100 2.0 mL/L 甘油 50 mmol/L 膠乳包被抗C反應蛋白抗體 4 g/L 其溶劑為純化水； 3、 全自動生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長600nm; (c) 反應時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d) 反應方向：正反應； 4、 檢測步驟 (a) 取200yl試劑R1與3yl待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入lOOyl試劑R2，立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2，計算吸光度變化 A A = A2-A1； (d) 根據(jù)樣本中全量程-C反應蛋白（Hs-CRP)的活性
計算 出樣本中的全量程-C反應蛋白的濃度。
[0021] 實施例4 試劑盒的制備和使用方法 1、膠乳包被抗C反應蛋白抗體的制備：用50 mmol/L的MES緩沖液將粒徑為120nm的聚苯 乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為3%的溶液，然后每毫升溶液中加入 1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在25°C的條件下反應1小時，反 應完成后加入2，2'_硫代雙鎳，使用離心機，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液進行稀釋，再使用離心機，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下 離心30分鐘，去上清，再將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液進行稀釋，直至溶液中聚苯乙烯微 球的質(zhì)量濃度為1%，然后邊攪拌邊加入抗C反應蛋白抗體，直至溶液中聚苯乙烯微球的質(zhì)量 濃度為〇. 5%時為止，最后加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白的濃度為15g/L為止，在4 °C 的條件下封閉16小時，即制備得到膠乳包被抗C反應蛋白抗體； 2、 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: MES緩沖液 180 mmol/L 硫酸鉀 400 mmol/L 聚乙二醇-8000 10 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 磷酸鹽緩沖液 20 mmol/L 牛血清白蛋白 8 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 曲拉通-100 3.0 mL/L 甘油 10mmol /], 膠乳包被抗C反應蛋白抗體 5g/L 其溶劑為純化水； 3、 全自動生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長600nm; (c) 反應時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d) 反應方向：正反應； 4、 檢測步驟 (a) 取200yl試劑R1與3yl待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入100yl試劑R2，立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2，計算吸光度變化 AA = A2-A1; (d) 根據(jù)樣本中全量程-C反應蛋白（Hs-CRP)的活性
計算 出樣本中的全量程-C反應蛋白的濃度。
[0022] 表1為實施例1所制得的測定全量程-C反應蛋白的試劑盒以及實施例2所制得的測 定全量程-C反應蛋白的試劑盒分別對質(zhì)控品1進行測定的結(jié)果，其中質(zhì)控品1中的全量程-C 反應蛋白的濃度為8.6 mg/L，測定結(jié)果見表1: 表1
由表1可知，本發(fā)明所制得的測定全量程-C反應蛋白的試劑盒對質(zhì)控品1的測定結(jié)果偏 差較小，因此測定準確度高，而且實施例1為最優(yōu)的選擇。
[0023] 表2為實施例1所制得的測定全量程-C反應蛋白的試劑盒以及實施例2所制得的測定全 量程-c反應蛋白的試劑盒分別對質(zhì)控品2進行測定的結(jié)果，其中質(zhì)控品2中的全量程-c反應 蛋白的濃度為23.5 mg/L，測定結(jié)果見表2:
由表2可知，本發(fā)明所制得的測定全量程-C反應蛋白的試劑盒對質(zhì)控品2的測定結(jié)果偏 差較小，因此測定準確度高，而且實施例1為最優(yōu)的選擇。
[0024] 表3為實施例3所制得的測定全量程-C反應蛋白的試劑盒對同一待測樣本進行的 多次反復測定以及實施例4所制得的測定全量程-C反應蛋白的試劑盒對同一待測樣本進行 的多次反復測定，對所得的結(jié)果進行SD和CV的計算，結(jié)果如下：
由表3可知本發(fā)明所制得的測定全量程-C反應蛋白的試劑盒的精密度比較好，而且由 表3可知，實施例3為最優(yōu)的選擇。
[0025] 上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項】
1. 一種測定全量程-c反應蛋白的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨立的試劑R1和試劑 R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: 緩沖液 20~180 mmol/L 無機鹽離子 150~400 mmol/L 加速劑 10~70 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 20~180 mmol/L 穩(wěn)定劑 8~42 g/L 防腐劑 0.2~0.8 g/L 表面活性劑 1.0~3.0 mL/L 助懸劑 10~90 mmol/L 膠乳包被抗C反應蛋白抗體 1~8 g/L 其溶劑為純化水。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定全量程-C反應蛋白的試劑盒，其特征在于:包括彼此 獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: 緩沖液 100 mmol/L 無機鹽離子 220 mmol/L 加速劑 40g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 100 mmol/L 穩(wěn)定劑 25 g/L 防腐劑 0.5 g/L 表面活性劑 2.0 mL/L 助懸劑 50 mmol/L 膠乳包被抗C反應蛋白抗體 4 g/L 其溶劑為純化水。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測定全量程-C反應蛋白的試劑盒，其特征在于:所述 的試劑R1中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MES緩沖液、磷酸鹽緩沖液、M0PS0緩沖液中的 一種或多種的組合，所述的無機鹽離子采用氯化鉀、硫酸鉀、氯化鈉中的一種或多種的組 合，所述的加速劑采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一種或多種組 合。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測定全量程-C反應蛋白的試劑盒，其特征在于:所述 的試劑R2中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MES緩沖液、磷酸鹽緩沖液、M0PS0緩沖液中的 一種或多種的組合，所述的穩(wěn)定劑采用牛血清白蛋白，所述的防腐劑采用山梨酸鈉、苯甲酸 鈉、疊氮鈉、硫柳汞、苯酚中的一種或多種的組合，所述的表面活性劑為曲拉通-100,所述的 助懸劑為甘油。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測定全量程-C反應蛋白的試劑盒，其特征在于:所述 的膠乳包被抗C反應蛋白抗體的制備方法為：用50 mmol/L的MES緩沖液將粒徑為80-500nm 的聚苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為1%-5%的溶液，然后每毫升溶 液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在20-37Γ的條件下 反應1小時，反應完成后加入2,2'-硫代雙鎳，使用離心機，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心 30分鐘，去上清，將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液進行稀釋，再使用離心機，在25000 rpm/ min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，再將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液進行稀釋，直至溶液 中聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為0.1%-2%，然后邊攪拌邊加入抗C反應蛋白抗體，直至溶液中 聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為0.5%-1.5%時為止，最后加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白 的濃度為15g/L為止，在4 °C的條件下封閉16-24小時，即制備得到膠乳包被抗C反應蛋白抗 體。6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測定全量程-C反應蛋白的試劑盒的制備方法和使用 方法，其特征在于:包括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: 緩沖液 20~180 mmol/L 無機鹽離子 150~400 mmol/L 加速劑 10~70 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 20~180 mmol/L 穩(wěn)定劑 8~42 g/L 防腐劑 0.2~0.8 g/L 表面活性劑 1.0~3.0 mL/L 助懸劑 10~90 mmol/L 膠乳包被抗C反應蛋白抗體 1~8 g/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應； (c) 用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值； (d) 根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中的全量程-C反應蛋白的試劑盒的濃度。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種測定全量程-C反應蛋白的試劑盒的制備方法和使用方 法，其特征在于:步驟(b)中，所述的試劑R1和試劑R2的體積比為2:1。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種測定全量程-C反應蛋白的試劑盒的制備方法和使用方 法，其特征在于:步驟(b)中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1:10 至ljl:150之間。
【文檔編號】G01N33/68GK106053828SQ201610358115
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運
【申請人】安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司