一種測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒及其制備方法，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分組成試劑盒，包括的成分及相應(yīng)含量為：試劑R1：緩沖液、螯合劑、加速劑、穩(wěn)定劑、防腐劑，試劑R2：緩沖液、穩(wěn)定劑、表面活性劑、助懸劑、防腐劑、膠乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體，制備方法為：按照組分含量配制好試劑；將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)；用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值；根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中的視黃醇結(jié)合蛋白的濃度。本發(fā)明具有準(zhǔn)確度高等優(yōu)點。
【專利說明】
一種測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測定視黃醇結(jié)合蛋白的試 劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 視黃醇結(jié)合蛋白（Retinol-Binding Protein,RBP)分子由一條183個氨基酸殘基 組成的多肽鏈及少部分糖類組成，不含中性糖和氨基己糖，分子量為21000,沉降系數(shù)為3S， 等電點pH 4.4~4.8,半衰期為3~12小時。視黃醇結(jié)合蛋白經(jīng)硫酸乙基葡聚糖層析得到A、B兩 個峰，二乙氨基乙醇葡聚糖層析A、B兩部分后可獲得A1、A2與B1、B2四部分。免疫擴(kuò)散法顯示 視黃醇結(jié)合蛋白的四個部分抗原性是一致的。視黃醇結(jié)合蛋白有三種形式，即RBP、RBP1、 RPB2，RBP的多肽鏈?zhǔn)袇^(qū)C末端的亮氨酸殘基，為182殘基，則為RBP1;失去C末端的亮氨酸-亮 氨酸殘基，為181殘基，則生成RBP2,正常人體內(nèi)主要是RBP、RBP1形式，而慢性腎功能衰竭病 人體內(nèi)RBP2較多。RBP主要有肝細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，廣泛分布于人體血清、腦脊液、尿 液、及其它體液中，在肝內(nèi)與視黃醇1:1結(jié)合后，釋放入血，肝外組織發(fā)現(xiàn)大量的RBP-MRNA， 提示肝外組織也可合成RBP。在血液中，當(dāng)RBP與細(xì)胞表面的RBP受體結(jié)合時，視黃醇進(jìn)入細(xì) 胞內(nèi)，復(fù)合物解體，游離的RBP從腎小球濾出，其中絕大部分被近端腎小管上皮細(xì)胞重吸收 并被分解，供組織利用，僅有少量從尿中排出。
[0003] 視黃醇結(jié)合蛋白（Retinol-Binding Protein,RBP)是血液中維生素的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白， 由肝臟合成、廣泛分布于血液、腦脊液、尿液及其他體液中。
[0004] 測定視黃醇結(jié)合蛋白能早期發(fā)現(xiàn)腎小管的功能損害，并能靈敏反映腎近曲小管的 損害程度，還可作為肝功能早期損害和監(jiān)護(hù)治療的指標(biāo)。
[0005] 目前臨床上使用較為廣泛的視黃醇結(jié)合蛋白的檢測方法主要為酶聯(lián)免疫吸附法、 放射免疫法，但是酶聯(lián)免疫吸附法操作過程復(fù)雜，耗時長，而且準(zhǔn)確度不是很好，放射免疫 法具有放射性物質(zhì)，可能造成環(huán)境污染及人體損害，且需特殊儀器。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)操作復(fù)雜、存在放射性污染以及 準(zhǔn)確度差的缺陷，而提供一種測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒及其制備方法。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題提供的技術(shù)方案是:本發(fā)明公開了一種測定視黃醇結(jié)合 蛋白的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分組成試劑盒，包括的成分及相 應(yīng)含量為： 試劑R1: 緩沖液 50~150 mmol/L 整合劑 1CK50 mmol/L 加速劑 10~30 g/L 穩(wěn)定劑 20~60 g/L 防腐劑 0.3~1.1 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 50~150 mmol/L 穩(wěn)定劑 6~18 g/L 表面活性劑 0.5~1.0 mL/L 助懸劑 30~60 mmol/L 防腐劑 0.3~1.1 g/L 膠乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體 1~8g/L 其溶劑為純化水。
[0008] 作為優(yōu)選，本發(fā)明公開了一種測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試 劑R1和試劑R2雙液體組分組成試劑盒，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: 緩沖液 100 mmol/L 螯合劑 30 mmol/L 加速劑 20 g/L 穩(wěn)定劑 40 g/L 防腐劑 0.7 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 100 mmol/L 穩(wěn)定劑 12g/L 表面活性劑 0.7 mL/L 助懸劑 45 mmol/L 防腐劑 〇.7g/L 膠乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體 4g/L 其溶劑為純化水。
[0009] 作為優(yōu)選，所述的試劑R1中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MOPS緩沖液、PBS緩沖 液、MES緩沖液、甘氨酸緩沖液中的一種或多種的組合，所述的螯合劑采用雙硫腙、8-羥基喹 啉、酒石酸鉀鈉、乙二胺四乙酸中的一種或多種的組合，所述的加速劑采用聚乙二醇-2000、 聚乙二醇-6000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一種或幾種，所述的穩(wěn)定劑采用牛血 清白蛋白、蔗糖、海藻糖中的一種或多種的組合，所述的防腐劑采用苯酚、苯甲酸鈉、疊氮鈉 中的一種或多種的組合。
[0010] 作為優(yōu)選，所述的試劑R2中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MOPS緩沖液、PBS緩沖 液、MES緩沖液、甘氨酸緩沖液中的一種或多種的組合，所述的穩(wěn)定劑采用牛血清白蛋白、蔗 糖、海藻糖中的一種或多種的組合，所述的表面活性劑采用曲拉通-100,所述的助懸劑采用 阿拉伯膠、海藻酸鈉、膠體二氧化硅、甘油中的一種或多種的組合，所述的防腐劑采用苯酚、 苯甲酸鈉、疊氮鈉中的一種或多種的組合。
[0011] 作為優(yōu)選，所述的膠乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體的制備方法為：用50 mmol/L 的MES緩沖液將粒徑為50-500nm的聚苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度 為3%的溶液，然后每毫升溶液中加入0.5 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽 酸鹽，在20-37°C的條件下反應(yīng)2小時，使用離心機(jī)，在15000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘， 去上清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散，再使用離心機(jī)，在15000 rpm/ min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，使得聚苯乙烯 微球最終質(zhì)量濃度為2%，超聲分散，然后邊攪拌邊加入等體積的含抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗 體的MES緩沖液，混合攪拌，在20-37 °C的條件下反應(yīng)2小時，使得聚苯乙烯微球的最終質(zhì)量 濃度為1%，加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白的最終濃度為10 g/L為止，4°C的條件下 封閉12-16小時，即可制備得到膠乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體。
[0012] 作為優(yōu)選，所述的抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體為含有能與人視黃醇結(jié)合蛋白特異性 結(jié)合的Fab功能部位的完整抗體或抗體片段。
[0013] 作為優(yōu)選，本發(fā)明還公開了上述測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒的制備方法和使用 方法，包括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: 緩沖液 50~150 mmol/L 整合劑 10~50 mmol/L 加速劑 10~30 g/L 穩(wěn)定劑 20~60 g/L 防腐劑 0.3~1.1 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 50~150 mmol/L 穩(wěn)定劑 6~18 g/L 表面活性劑 0.5~1.0 mL/L 助懸劑 30~60 mmol/L 防腐劑 0.3~1.1 g/L 膠乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體 1~8g/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (c) 用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (d) 根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中的視黃醇結(jié)合蛋白的濃度。
[0014] 作為優(yōu)選，步驟(b)中，所述的試劑R1與試劑R2的體積比為3:1。
[0015] 作為優(yōu)選，步驟(b)中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1: 5到1:80之間。
[0016]本發(fā)明的檢測原理是:樣品中視黃醇結(jié)合蛋白（RBP)可與試劑中相應(yīng)的特異性抗-RBP抗體結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，產(chǎn)生一定池度，該池度高低在一定抗體存在時與抗原 的含量成正比，在一定波長下測定濁度并通過多點定標(biāo)曲線可進(jìn)行視黃醇結(jié)合蛋白的定量 測定。
式中：△ At以空白管吸光度作對照的樣品管吸光度值 ΔAs以空白管吸光度作對照的校準(zhǔn)管吸光度值 Cs校準(zhǔn)液中RBP的濃度。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點:本發(fā)明在試劑R2中添加了助懸劑，在 表面活性劑曲拉通X-100的作用下，增加了助懸劑在試劑R2中的溶解度，在助懸劑的作用 下，使得R2試劑中的膠乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體可均勻懸浮于試劑中，保證了試劑 的穩(wěn)定性，在試劑R1中的加速劑的作用下，反應(yīng)迅速，準(zhǔn)確度也就比較高。
【具體實施方式】
[0019] 以下結(jié)合具體實施例進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實施例。
[0020] 實施例1 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: Tris緩沖液 100 mmol/L 雙硫腙 30 mmol/L 聚乙二醇-8000 20 g/L 牛血清白蛋白 40 g/L 疊氮鈉 0.7 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 12g/L 曲拉通-100 0.7 mL/L 甘油 45 mmol/L 疊氮鈉 〇.7g/L 膠乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體 4g/L 其溶劑為純化水。
[0021] 實施例2 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: PBS緩沖液 150 mmol/L 8-羥基喹啉 10 mmol/L 聚乙二醇-6000 30 g/L 鹿糖 20 g/L 苯酸 1.1 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: PBS 緩沖液 50mmol/L 牛血清白蛋白 18 g/L 曲拉通-100 1.0 mL/L 海藻酸鈉 60 mmol/L 苯酚 0.3 g/L 膠乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體 8g/L 其溶劑為純化水。
[0022] 實施例3 試劑盒的制備和使用方法 1、 膠乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體的制備：用50 mmol/L的MES緩沖液將粒徑為 120nm的聚苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為3%的溶液，然后每毫升 溶液中加入0.5 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在25°C的條件下反 應(yīng)2小時，使用離心機(jī)，在15000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散，再使用離心機(jī)，在15000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘， 去上清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，使得聚苯乙烯微球最終質(zhì)量濃度為2%，超 聲分散，然后邊攪拌邊加入等體積的含抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體的MES緩沖液，混合攪拌， 在25°C的條件下反應(yīng)2小時，使得聚苯乙烯微球的最終質(zhì)量濃度為1%，加入牛血清白蛋白， 使得牛血清白蛋白的最終濃度為10 g/L為止，4°C的條件下封閉10小時，即可制備得到膠 乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體； 2、 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 100 mmol/L 雙硫腙 30 mmol/L 聚乙二醇-8000 20 g/L 牛血清白蛋白 40 g/L 疊氮鈉 0.7 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 12g/L 曲拉通-100 0.7 mL/L 甘油 45 mmol/L 疊氮鈉 〇.7g/L 膠乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體4g/L 其溶劑為純化水； 3、 全自動生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長600nm; (c) 反應(yīng)時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d)反應(yīng)方向：正反應(yīng)； 4、檢測步驟 (a) 取225μ1試劑R1與5μ1待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入75μ1試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化 ΔΑ = A2-A1; (d)根據(jù)樣本中視黃醇結(jié)合蛋白（RBP)的活性計算出樣 本中的抗角蛋白抗體的濃度。
[0023] 實施例4 試劑盒的制備和使用方法 1、 膠乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體的制備：用50 mmol/L的MES緩沖液將粒徑為 100nm的聚苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為3%的溶液，然后每毫升 溶液中加入0.5 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在25°C的條件下反 應(yīng)2小時，使用離心機(jī)，在15000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散，再使用離心機(jī)，在15000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘， 去上清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，使得聚苯乙烯微球最終質(zhì)量濃度為2%，超 聲分散，然后邊攪拌邊加入等體積的含抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體的MES緩沖液，混合攪拌， 在25°C的條件下反應(yīng)2小時，使得聚苯乙烯微球的最終質(zhì)量濃度為1%，加入牛血清白蛋白， 使得牛血清白蛋白的最終濃度為10 g/L為止，4°C的條件下封閉10小時，即可制備得到膠 乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體； 2、 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: PBS緩沖液 150 mmol/L 8-羥基喹啉 10 mmol/L 聚乙二醇-6000 30 g/L 鹿糖 20 g/L 苯酸 1.1 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: PBS 緩沖液 50mmol/L 牛血清白蛋白 18 g/L 曲拉通-100 1.0 mL/L 海藻酸鈉 60 mmol/L 苯酚 0.3 g/L 膠乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體 8g/L 其溶劑為純化水； 3、 全自動生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測溫度:37 °C; (b) 檢測波長:主波長600nm; (c) 反應(yīng)時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反應(yīng)方向：正反應(yīng)； 4、檢測步驟 (a) 取225μ1試劑R1與5μ1待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入75μ1試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化 Δ A = A2-A1； (d)根據(jù)樣本中視黃醇結(jié)合蛋白（RBP)的活性
計算出樣 本中的抗角蛋白抗體的濃度。
[0024] 表1為實施例1所制得的測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒以及實施例2所制得的測定 視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒分別對質(zhì)控品1進(jìn)行測定的結(jié)果，其中質(zhì)控品1中的視黃醇結(jié)合蛋 白的濃度為22 mg/L，測定結(jié)果見表1:
由表1可知，本發(fā)明所制得的測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒對質(zhì)控品1的測定結(jié)果偏差 較小，因此測定準(zhǔn)確度高，而且實施例1為最優(yōu)的選擇。
[0025] 表2為實施例1所制得的測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒以及實施例2所制得的測定視黃 醇結(jié)合蛋白的試劑盒分別對質(zhì)控品2進(jìn)行測定的結(jié)果，其中質(zhì)控品2中的視黃醇結(jié)合蛋白的 濃度為73.9 mg/L，測定結(jié)果見表2:
由表2可知，本發(fā)明所制得的測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒對質(zhì)控品2的測定結(jié)果偏差 較小，因此測定準(zhǔn)確度高，而且實施例1為最優(yōu)的選擇。
[0026] 表3為實施例3所制得的測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒對同一待測樣本進(jìn)行的多 次反復(fù)測定以及實施例4所制得的測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒對同一待測樣本進(jìn)行的多 次反復(fù)測定，對所得的結(jié)果進(jìn)行SD和CV的計算，結(jié)果如下： 表3
由表3可知本發(fā)明所制得的測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒的精密度比較好，而且由表3 可知，實施例3為最優(yōu)的選擇。
[0027]上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進(jìn)行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項】
1. 一種測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2 雙液體組分組成試劑盒，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: 緩沖液 50~150 mmol/L 整合劑 10~50 mmol/L 加速劑 10~30 g/L 穩(wěn)定劑 20~60 g/L 防腐劑 0.3~1.1 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 50~150 mmol/L 穩(wěn)定劑 6~18 g/L 表面活性劑 0.5~1.0 mL/L 助懸劑 30~60 mmol/L 防腐劑 0.3~1.1 g/L 膠乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體 1~8g/L 其溶劑為純化水。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú) 立的試劑R1和試劑R2雙液體組分組成試劑盒，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: 緩沖液 100 mmol/L 螯合劑 30 mmol/L 加速劑 20 g/L 穩(wěn)定劑 40 g/L 防腐劑 0.7 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 100 mmol/L 穩(wěn)定劑 12g/L 表面活性劑 0.7 mL/L 助懸劑 45 mmol/L 防腐劑 〇.7g/L 膠乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體4g/L 其溶劑為純化水。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R1中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MOPS緩沖液、PBS緩沖液、MES緩沖液、甘氨酸緩沖 液中的一種或多種的組合，所述的螯合劑采用雙硫腙、8-羥基喹啉、酒石酸鉀鈉、乙二胺四 乙酸中的一種或多種的組合，所述的加速劑采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-6000、聚乙二 醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一種或幾種，所述的穩(wěn)定劑采用牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖 中的一種或多種的組合，所述的防腐劑采用苯酚、苯甲酸鈉、疊氮鈉中的一種或多種的組 合。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R2中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MOPS緩沖液、PBS緩沖液、MES緩沖液、甘氨酸緩沖 液中的一種或多種的組合，所述的穩(wěn)定劑采用牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖中的一種或多種 的組合，所述的表面活性劑采用曲拉通-100,所述的助懸劑采用阿拉伯膠、海藻酸鈉、膠體 二氧化硅、甘油中的一種或多種的組合，所述的防腐劑采用苯酚、苯甲酸鈉、疊氮鈉中的一 種或多種的組合。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的 膠乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體的制備方法為：用50 mmol/L的MES緩沖液將粒徑為50-500nm的聚苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為3%的溶液，然后每毫升 溶液中加入0.5 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在20-37°C的條件 下反應(yīng)2小時，使用離心機(jī)，在15000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，將沉淀懸浮于 50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散，再使用離心機(jī)，在15000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分 鐘，去上清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，使得聚苯乙烯微球最終質(zhì)量濃度為 2%，超聲分散，然后邊攪拌邊加入等體積的含抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體的MES緩沖液，混合 攪拌，在20-37°C的條件下反應(yīng)2小時，使得聚苯乙烯微球的最終質(zhì)量濃度為1%，加入牛血清 白蛋白，使得牛血清白蛋白的最終濃度為10 g/L為止，4°C的條件下封閉12-16小時，即可 制備得到膠乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的抗人 視黃醇結(jié)合蛋白抗體為含有能與人視黃醇結(jié)合蛋白特異性結(jié)合的Fab功能部位的完整抗體 或抗體片段。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒的制備方法和使用方 法，其特征在于:包括以下步驟： (a)按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: 緩沖液 50~150 mmol/L 整合劑 10~50 mmol/L 加速劑 10~30 g/L 穩(wěn)定劑 20~60 g/L 防腐劑 0.3~1.1 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 50~150 mmol/L 穩(wěn)定劑 6~18 g/L 表面活性劑 0.5~1.0 mL/L 助懸劑 30~60 mmol/L 防腐劑 0.3~1.1 g/L 膠乳包被抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體 1~8g/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (c) 用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (d) 根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中的視黃醇結(jié)合蛋白的濃度。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒的制備方法和使用方法， 其特征在于:步驟(b)中，所述的試劑R1與試劑R2的體積比為3:1。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種測定視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒的制備方法和使用方法， 其特征在于:步驟(b)中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1:5到1: 80之間。
【文檔編號】G01N33/543GK106093423SQ201610376090
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月31日
【發(fā)明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運(yùn)
【申請人】安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司