高密度脂蛋白中的膽固醇測定方法和該方法中使用的試劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及簡便且精確地測定高密度脂蛋白中的膽固醇的方法和該方法中使用 的試劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 作為生物體主要的脂質(zhì)的膽固醇、中性脂肪（以下，有時(shí)稱為甘油三酯或者TG)和 磷脂在血液中與載脂蛋白一起形成脂蛋白而存在。該脂蛋白，根據(jù)物理性狀的不同，分為乳 糜微粒、極低密度脂蛋白（以下，有時(shí)稱為VLDL)、低密度脂蛋白（以下，有時(shí)稱為LDL)、高密 度脂蛋白（以下，有時(shí)稱為HDL)等。已知其中的HDL因?yàn)閺纳矬w中的各組織接受膽固醇，關(guān) 系到積蓄在細(xì)胞內(nèi)的膽固醇的除去作用，是以冠狀動(dòng)脈硬化癥為代表的各種動(dòng)脈硬化癥的 危險(xiǎn)預(yù)防因素。因此，HDL中的膽固醇（以下，有時(shí)稱為HDL - C)的血中濃度的把握，對動(dòng)脈硬 化性疾病的發(fā)病預(yù)知有用而在臨床上廣泛測定。
[0003] 作為HDL-C的測定方法，不需要將測定試樣中的HDL與HDL以外的脂蛋白分離分級 的工序，分類為所謂的均相HDL - C直接測定法（以下，有時(shí)稱為以往方法）的臨床檢查用的 試劑大量市售，從而在程序檢查中使用（非專利文獻(xiàn)1、4)。然而，這些實(shí)用化的臨床檢查用 的方法?試劑也有測定精度方面的問題，特別是在血脂異常檢體中，以基準(zhǔn)測定法(非專利 文獻(xiàn)2、3)測定時(shí)的測定值與用各種試劑測定時(shí)的測定值的背離在國際上也一直是問題(非 專利文獻(xiàn)4)。
[0004] 許多以往方法可以分類為在HDL-C測定前，將HDL以外的脂蛋白中的膽固醇的全 部或者一部分從反應(yīng)液中消除以使得其不參與HDL - C測定的主反應(yīng)（以下，有時(shí)簡稱為主 反應(yīng))的方法(例如，專利文獻(xiàn)1、2);或者，在HDL-C的測定時(shí)，HDL以外的脂蛋白中的膽固醇 抑制HDL以外的脂蛋白中的膽固醇的反應(yīng)以使得其不參與HDL - C測定的主反應(yīng)的方法(例 如，專利文獻(xiàn)3~6)，該以往方法中，概括為HDL以外的脂蛋白VLDL與LDL的性狀并不相同，因 此由VLDL引起的測定誤差的消除成為課題。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0006] 專利文獻(xiàn)
[0007] 專利文獻(xiàn)1:國際公開第98/26090號小冊子 [0008] 專利文獻(xiàn)2:國際公開第2000/078999號小冊子 [0009] 專利文獻(xiàn)3:國際公開第95/24502號小冊子 [0010] 專利文獻(xiàn)4:國際公開第2004/035816號小冊子 [0011] 專利文獻(xiàn)5:國際公開第2005/100591號小冊子 [0012] 專利文獻(xiàn)6:國際公開第2006/118199號小冊子 [0013]非專利文獻(xiàn)
[0014] 非專利文獻(xiàn)l:Clinical Chemistry 47:9 1579 - 1596(2001)
[0015] 非專利文南犬2: European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry 29 269 -275(1991)
[0016] 非專利文獻(xiàn)3:Clinical Chemistry 45:10 1803 - 1812(1999)
[0017] 非專利文獻(xiàn)4:Clinical Chemistry 56:6 977 - 986(2010)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 因此，本發(fā)明的目的在于，找到即便以像血脂異常癥這樣的特殊的病癥的患者檢 體為測定試樣時(shí)，也能夠提高與DCM(指定比較法，Designated Comparison Method)等基準(zhǔn) 測定法的測定值的一致性的化合物，提供利用該化合物的HDL-C測定方法。
[0019] 本發(fā)明人等對上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HDL - C測定時(shí)，在#鹽和聚陰 離子的存在下將膽固醇氧化酶等膽固醇測定用酶和測定試樣混合時(shí)，能夠大幅抑制該膽固 醇測定用酶對VLDL的反應(yīng)性，更高精度地測定HDL-C。
[0020] 即，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容。
[0021 ] [ 1 ] -種高密度脂蛋白膽固醇測定方法，其特征在于，
[0022] 包含使測定試樣與膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶、或者與膽固醇酯水解酶和膽 固醇脫氫酶在通式(I)表示的化合物和聚陰離子的存在下反應(yīng)的工序，
[0023]
[0024] (式中，R1表示直鏈或支鏈狀的碳原子數(shù)8~22的烷基、或者直鏈或支鏈狀的碳原 子數(shù)8~22的烯基，R 2、R3以及R4相同或不同地表示直鏈或支鏈狀的碳原子數(shù)1~6的烷基、或 者直鏈或支鏈狀的碳原子數(shù)2~6的烯基，X-表示陰離子。）
[0025] [2]根據(jù)[1]所述的方法，其中，通式（I)表示的化合物中，R1表示直鏈或支鏈狀的 碳原子數(shù)8~16的烷基，R 2、R3以及R4為直鏈或支鏈狀的碳原子數(shù)1~4的烷基。
[0026] [3]根據(jù)[1]或[2]所述的方法，其中，通式（I)表示的化合物為選自三甲基辛基# 鹽、三甲基十二烷基I#鹽、三甲基十六烷基鹽、三乙基辛基#鹽、三乙基十二烷基I# 鹽、三乙基十六烷基I#鹽、三丁基辛基#鹽、三丁基十二烷基#鹽和三丁基十六烷基I# 鹽中的至少1種化合物。
[0027] [4]根據(jù)[1]~[3]中任1項(xiàng)所述的方法，其中，聚陰離子為磷鎢酸鈉或者硫酸葡聚 糖。
[0028] [5]根據(jù)[1]~[4]中任1項(xiàng)所述的方法，其中，在進(jìn)一步存在白蛋白的條件下進(jìn)行 上述工序。
[0029] [6]根據(jù)[1]~[5]中任1項(xiàng)所述的方法，其中，在進(jìn)一步存在選自聚氧乙烯烷基胺、 聚氧乙烯烯基胺、叔胺和季銨鹽中的至少1種化合物的條件下進(jìn)行上述工序。
[0030] [7] -種高密度脂蛋白膽固醇測定用試劑，含有下述(a)、（b)和(c): (a)通式(I)表 示的化合物，
[0031]
[0032] (式中，R1表示直鏈或支鏈狀的碳原子數(shù)8~22的烷基、或者直鏈或支鏈狀的碳原 子數(shù)8~22的烯基，R 2、R3以及R4相同或不同地表示直鏈或支鏈狀的碳原子數(shù)1~6的烷基、或 者直鏈或支鏈狀的碳原子數(shù)2~6的烯基，X-表示陰離子。）
[0033] (b)聚陰離子，
[0034] (c)膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶、或者膽固醇酯水解酶和膽固醇脫氫酶
[0035] [8]根據(jù)[7]所述的試劑，其中，通式（I)表示的化合物中，R1表示直鏈或支鏈狀的 碳原子數(shù)8~16的烷基，R2、R3以及R4為直鏈或支鏈狀的碳原子數(shù)1~4的烷基。
[0036] [9]根據(jù)[7]或者[8]所述的試劑，其中，通式（I)表示的化合物為選自三甲基辛基 |奔鹽、三甲基十二烷基#鹽、三甲基十六烷基I#鹽、三乙基辛基I#鹽、三乙基十二烷基 I#鹽、三乙基十六烷基I#鹽、三丁基辛基I#鹽、三丁基十二烷基I#鹽和三丁基十六烷基 _鹽中的至少1種化合物。
[0037] [10]根據(jù)[7]~[9]中任1項(xiàng)所述的試劑，其中，聚陰離子為磷鎢酸鈉或者硫酸葡聚 糖。
[0038] [11]根據(jù)[7]~[10]中任1項(xiàng)所述的試劑，其中，進(jìn)一步含有白蛋白。
[0039] [12]根據(jù)[7]~[11]中任1項(xiàng)所述的試劑，其中，進(jìn)一步含有選自聚氧乙烯烷基胺、 聚氧乙烯烯基胺、叔胺和季銨鹽中的至少1種化合物。
[0040] [13]根據(jù)[7]~[12]中任1項(xiàng)所述的試劑，其中，包含第1試劑組和第2試劑組，上述 第1試劑組含有(a)通式(I)和(b)聚陰離子，上述第2試劑組含有(c)膽固醇酯水解酶和膽固 醇氧化酶、或者膽固醇酯水解酶和膽固醇脫氫酶。
[0041] [14]一種試劑盒，在高密度脂蛋白膽固醇測定中使用，含有下述(a)、(b)和(c):
[0042] (a)通式（I)表示的化合物，
[0043]
[0044] (式中，R1表示直鏈或支鏈狀的碳原子數(shù)8~22的烷基、或者直鏈或支鏈狀的碳原 子數(shù)8~22的烯基，R 2、R3以及R4相同或不同地表示直鏈或支鏈狀的碳原子數(shù)1~6的烷基、或 者直鏈或支鏈狀的碳原子數(shù)2~6的烯基，X-表示陰離子。）
[0045] (b)聚陰離子，
[0046] (c)膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶、或者膽固醇酯水解酶和膽固醇脫氫酶。
[0047] [15]根據(jù)[14]所述的試劑盒，其中，通式（I)表示的化合物中，R1表示直鏈或支鏈 狀的碳原子數(shù)8~16的烷基，R 2、R3以及R4為直鏈或支鏈狀的碳原子數(shù)1~4的烷基。
[0048] [16]根據(jù)[14]或者[15]所述的試劑盒，其中，通式（I)表示的化合物為選自三甲基 辛基I#鹽、三甲基十二烷基#鹽、三甲基十六烷基#鹽、三乙基辛基f奔鹽、三乙基十二 烷基I#鹽、三乙基十六烷基I聲鹽、三丁基辛基I#鹽、三丁基十二烷基#鹽、以及三丁基 十六烷基I#鹽中的至少1種化合物。
[0049] [17]根據(jù)[14]~[16]中任1項(xiàng)所述的試劑盒，其中，聚陰離子為磷鎢酸鈉或者硫酸 葡聚糖。
[0050] [18]根據(jù)[14]~[17]中任1項(xiàng)所述的試劑盒，其中，進(jìn)一步含有白蛋白。
[0051] [19]根據(jù)[14]~[18]中任1項(xiàng)所述的試劑盒，其中，進(jìn)一步含有選自聚氧乙烯烷基 胺、聚氧乙烯烯基胺、叔胺和季銨鹽中的至少1種化合物。
[0052] [20]根據(jù)[14]~[19]中任1項(xiàng)所述的試劑盒，其中，包含第1試劑組和第2試劑組， 上述第1試劑組含有(a)通式(I)和(b)聚陰離子，上述第2試劑組含有(c)膽固醇酯水解酶和 膽固醇氧化酶、或者膽固醇酯水解酶和膽固醇脫氫酶。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明，不需要對測定試樣進(jìn)行離心分離等前處理，以簡便的操作高效地對 HDL - C進(jìn)行定量。另外，因?yàn)槟軌蛞陨倭康臏y定試樣進(jìn)行特異性測定，所以能夠用于各種自 動(dòng)分析裝置，在臨床檢查領(lǐng)域極其有用。另外，本發(fā)明的HDL-C測定因?yàn)闇y定中使用的試劑 的組成是不含有2價(jià)金屬作為必需成分的組成，所以還具有分析裝置不受到負(fù)荷的優(yōu)點(diǎn)。特 別是還具有以往方法中產(chǎn)生測定誤差的含有大量的VLDL的檢體，例如甘油三酯為高值、總 膽固醇和LDL膽固醇大體為正常值、IV型高血脂癥這樣的檢體的測定精度大幅改善的優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0054] -個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供高密度脂蛋白膽固醇(HDL - C)測定方法。本發(fā)明方 法通過在聚陰離子和#鹽化合物的存在下，使用公知的膽固醇測定用試劑對含有HDL的測 定試樣測定HDL-C來實(shí)施。
[0055] 作為供于本發(fā)明的方法的測定試樣，只要是可能包含HDL、LDL、VLDL和乳糜微粒等 脂蛋白的檢體，就可以是任意的，例如，可以舉出血清、血漿等體液及其稀釋物，不限定于這 止匕 -、〇
[0056]本說明書中，將HDL - C測定中使用的以膽固醇為基質(zhì)的酶通稱為膽固醇測定用 酶。作為膽固醇測定用酶，可舉出膽固醇酯水解酶(包含分類為脂肪酶的酶）、膽固醇氧化 酶