Pivka-ii測(cè)定方法、測(cè)定試劑和測(cè)定試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了與以往的方法相比，血清/血漿相關(guān)性良好的PIVKA-II的測(cè)定方法、以及用于該測(cè)定的試劑和試劑盒。本發(fā)明的PIVKA-II的測(cè)定方法包括：通過(guò)使用與凝血酶原片段F1特異性結(jié)合的抗F1抗體或其抗原結(jié)合性片段、和與凝血酶原片段F2特異性結(jié)合的抗F2抗體或其抗原結(jié)合性片段的混合物，以及與PIVKA-II特異性結(jié)合的抗PIVKA-II抗體或其抗原結(jié)合性片段的免疫測(cè)定，來(lái)測(cè)定樣品中的PIVKA-II。
【專(zhuān)利說(shuō)明】PIVKA-I I測(cè)定方法、測(cè)定試劑和測(cè)定試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及與血清/血漿相關(guān)性良好的PIVKA-II測(cè)定方法、以及PIVKA-II免疫 測(cè)定試劑和試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] PIVKA-II (維生素 K 缺乏誘導(dǎo)的蛋白-II (Protein induced by vitamin K absence-II))是與血液凝固相關(guān)的、具有與凝血酶原類(lèi)似結(jié)構(gòu)的糖蛋白。凝血酶原是622 個(gè)殘基的蛋白質(zhì)，位于N末端附近的10個(gè)谷氨酸（Glu)殘基受到γ-羧基化，形成γ-羧 基谷氨酸（Gla)殘基。已知該凝血酶原在生物體內(nèi)產(chǎn)生時(shí)，由于維生素 K的缺乏，肝功能衰 竭、維生素 K拮抗劑的給予、肝細(xì)胞損傷等，γ -羧基化不完全，10個(gè)殘基中的全部或一部分 形成Glu殘基的糖蛋白出現(xiàn)在血液中。該蛋白質(zhì)是被稱(chēng)作異常凝血酶原的PIVKA-II。近年 來(lái)，有報(bào)道稱(chēng)在肝細(xì)胞癌患者血漿中高濃度檢出PIVKA-II，作為肝細(xì)胞癌的標(biāo)志被用于診 斷的監(jiān)測(cè)物。
[0003] 作為特異性檢出樣品中PIVKA-II的方法，有人報(bào)道了使用特異性識(shí)別PIVKA-II 的單克隆抗體和抗凝血酶原的多克隆抗體兩者，以其中一方作為固定抗體，以另一方作為 標(biāo)記抗體進(jìn)行測(cè)定的免疫測(cè)定法（專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。
[0004] 在測(cè)定來(lái)自血液的樣品中的被檢物質(zhì)時(shí)，主要使用血清或血漿。根據(jù)被檢物質(zhì)的 性質(zhì)或測(cè)定系統(tǒng)等，在由同一受試者得到的血清/血漿樣品對(duì)中，血清樣品和血漿樣品中 的被檢物質(zhì)的測(cè)定值不同，即血清/血漿相關(guān)性低，只能測(cè)定血清和血漿樣品中的一方。這 在同時(shí)測(cè)定兩種被檢物質(zhì)時(shí)特別成為問(wèn)題。例如，在同時(shí)測(cè)定兩種被檢物質(zhì)時(shí)，一種被檢物 質(zhì)只能用血清測(cè)定時(shí)，如果另一種被檢物質(zhì)也可以用血清測(cè)定，則由患者采集的樣品可以 只是血清樣品。但是，如果另一方的被檢物質(zhì)只能用血漿樣品測(cè)定時(shí)，則必須由患者采集血 清和血漿兩種樣品，樣品的取得或處理麻煩，并且也增加了患者的負(fù)擔(dān)。因此，人們希望可 以建立血清/血漿相關(guān)性高的測(cè)定系統(tǒng)。
[0005] 在采用ELISA法的PIVKA-II測(cè)定中，在以特異性識(shí)別PIVKA-II的單克隆抗體作 為固相抗體、以抗凝血酶原的多克隆抗體作為二次抗體使用時(shí)，已知，與凝血酶顯示反應(yīng)性 的抗體包含在二次抗體中，因此，血清樣品對(duì)測(cè)定系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響，無(wú)法獲得穩(wěn)定的測(cè)定 值（專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。專(zhuān)利文獻(xiàn)2中報(bào)道，為了解決該問(wèn)題，是使用不與人凝血酶反應(yīng)、而與人凝 血酶原特異性反應(yīng)的抗體作為二次抗體，由此，即使是血清樣品也可以穩(wěn)定測(cè)定PIVKA-II。 但是，專(zhuān)利文獻(xiàn)2所述的方法中，為了從抗人凝血酶原的多克隆抗體中除去抗凝血酶的抗 體，必須使用人凝血酶原親和柱，在取得與凝血酶原反應(yīng)的抗體后進(jìn)行透析，再進(jìn)一步使用 人凝血酶親和柱，取得不與凝血酶反應(yīng)的抗體，進(jìn)行透析，抗體的純化工序非常麻煩。另外， 專(zhuān)利文獻(xiàn)2的方法中，雖然血清/血漿相關(guān)性得到改善，但人們希望進(jìn)一步的改善。并且， 多克隆抗體因批次不同而出現(xiàn)偏差，因此為了嚴(yán)格確保特異性，與多克隆抗體相比，人們通 常希望采用單克隆抗體。專(zhuān)利文獻(xiàn)2中雖然記載，在采用ELISA法的PIVKA-II測(cè)定法中， 使用不與人凝血酶反應(yīng)、而與人凝血酶原特異性反應(yīng)的單克隆抗體，但是，對(duì)于使用這樣的 單克隆抗體時(shí)它們對(duì)血清/血漿相關(guān)性的影響或問(wèn)題則未有任何記載。
[0006] 專(zhuān)利文獻(xiàn)3中記載了，使用特異性識(shí)別PIVKA-II的單克隆抗體和抗凝血酶原的單 克隆抗體兩者，以其中一方作為固定抗體、另一方作為標(biāo)記抗體進(jìn)行測(cè)定的免疫測(cè)定法。還 記載了，將PIVKA-II特異性單克隆抗體混合使用。但是專(zhuān)利文獻(xiàn)3中仍然完全未記載免疫 測(cè)定系統(tǒng)中血清/血漿相關(guān)性的問(wèn)題，專(zhuān)利文獻(xiàn)3所述的方法對(duì)于血清/血漿相關(guān)性有何 影響是不清楚的。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 專(zhuān)利文獻(xiàn) 專(zhuān)利文獻(xiàn)1 :日本特開(kāi)昭60-60557號(hào)公報(bào) 專(zhuān)利文獻(xiàn)2 :日本特開(kāi)平5-249108號(hào)公報(bào) 專(zhuān)利文獻(xiàn)3 :日本特開(kāi)平9-43237號(hào)公報(bào)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 發(fā)明所要解決的課題 本發(fā)明的目的在于提供：與以往的方法相比，血清/血漿相關(guān)性良好的PIVKA-II的測(cè) 定方案。
[0009] 解決問(wèn)題的方案 本發(fā)明人對(duì)于PIVKA-II的測(cè)定進(jìn)行了深入的研宄，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過(guò)使用將與人凝血酶 原片段1特異性結(jié)合的抗體、和與人凝血酶原片段2特異性結(jié)合的抗體的混合而成的混合 抗體作為免疫測(cè)定中的抗體，與以往的方法相比，血清/血漿相關(guān)性大幅改善，從而完成了 本發(fā)明。
[0010] S卩，本發(fā)明提供PIVKA-II的測(cè)定方法，該測(cè)定方法包括：通過(guò)使用與凝血酶原片 段Fl特異性結(jié)合的抗Fl抗體或其抗原結(jié)合性片段、和與凝血酶原片段F2特異性結(jié)合的 抗F2抗體或其抗原結(jié)合性片段的混合物，以及與PIVKA-II特異性結(jié)合的抗PIVKA-II抗 體或其抗原結(jié)合性片段的免疫測(cè)定，來(lái)測(cè)定樣品中的PIVKA-II。本發(fā)明還提供樣品中的 PIVKA-II的免疫測(cè)定試劑，該免疫測(cè)定試劑包含：與PIVKA-II特異性結(jié)合的抗PIVKA-II 抗體或其抗原結(jié)合性片段、與凝血酶原片段Fl特異性結(jié)合的抗Fl抗體或其抗原結(jié)合性片 段、和與凝血酶原片段F2特異性結(jié)合的抗F2抗體或其抗原結(jié)合性片段。本發(fā)明進(jìn)一步提 供樣品中的PIVKA-II的免疫測(cè)定試劑盒，該試劑盒包括所述本發(fā)明的免疫測(cè)定試劑。
[0011] 發(fā)明效果 根據(jù)本發(fā)明，可提供血清/血漿相關(guān)性良好的PIVKA-II的測(cè)定方法、以及用于該測(cè)定 的試劑和試劑盒。本發(fā)明的方法與以往的方法相比，血清/血漿相關(guān)性進(jìn)一步得到大幅改 善，作為PIVKA-II測(cè)定方法，其實(shí)用性更高。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1是表示實(shí)施例1中制備的單克隆抗體與全長(zhǎng)人凝血酶原（I)、F1區(qū)⑵和F2 區(qū)（3)的反應(yīng)性的圖表。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 凝血酶原含有凝血酶原片段I(Fl)區(qū)和凝血酶原片段2(F2)區(qū)和凝血酶區(qū)。 PIVKA-II是因?yàn)镹末端附近的10個(gè)Glu殘基中的γ-羧基化不完全而10個(gè)殘基的全部或 一部分未形成Gla、仍為Glu的糖蛋白，PIVKA-II也含有凝血因酶原片段I(Fl)區(qū)和凝血酶 原片段2 (F2)區(qū)和凝血酶區(qū)。
[0014] SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列是PIVKA-II的氨基酸序列，第44號(hào)-第198號(hào) 氨基酸區(qū)是凝血酶原Fl區(qū)，第199號(hào)-第314號(hào)氨基酸區(qū)是凝血酶原F2區(qū)。含有Fl區(qū) 的一部分的第25號(hào)-第88號(hào)氨基酸區(qū)被稱(chēng)作Gla區(qū)。凝血酶原中，SEQ ID NO: 1中的 10個(gè)"Xaa"全部形成γ-羧基谷氨酸（Gla)殘基。該凝血酶原序列在GenBank中以登錄 號(hào)ΝΡ_000497登記。SEQ ID NO: 2所示的堿基序列是編碼SEQ ID NO: 1的PIVKA-II和 NP_000497的凝血酶原的序列，在GenBank中以登錄號(hào)NM_000506登記。SEQ ID NO: 2中 的第44號(hào)-第1912號(hào)的堿基區(qū)域是編碼區(qū)。
[0015] 本發(fā)明的測(cè)定方法中，使用抗Fl抗體和抗F2抗體的混合物、以及與PIVKA-II特 異性結(jié)合的抗PIVKA-II抗體進(jìn)行夾心免疫測(cè)定。通過(guò)使用抗Fl抗體和抗F2抗體的混合物 作為夾心法中抗體的一方，可以合乎需要地改善PIVKA-II測(cè)定值中的血清/血漿相關(guān)性。
[0016] 抗Fl抗體是與凝血酶原Fl特異性結(jié)合的抗體。即，在PIVKA-II的凝血酶原Fl區(qū) 內(nèi)具有表位，是識(shí)別該表位而與PIVKA-II結(jié)合的抗體。例如，只與凝血酶原或PIVKA-II的 Fl區(qū)片段結(jié)合、實(shí)質(zhì)上不與F2區(qū)片段以及凝血酶區(qū)片段的任意一方結(jié)合的抗體就是"與在 Fl區(qū)內(nèi)具有表位的凝血酶原Fl特異性結(jié)合的抗體"。這里所述的"實(shí)質(zhì)上不結(jié)合"是指：不 與F2區(qū)片段以及凝血酶區(qū)片段的任意一方以可檢測(cè)的水平結(jié)合（S卩，與F2區(qū)片段以及凝 血酶區(qū)片段的結(jié)合為背景噪聲以下），或者即使是以可檢測(cè)的水平結(jié)合，也僅以本領(lǐng)域技術(shù) 人員清楚的程度結(jié)合，即與它們結(jié)合的程度明顯少于與Fl區(qū)片段的結(jié)合，并非與F2區(qū)片段 或凝血酶區(qū)片段結(jié)合?？笷l抗體可以是可與PIVKA-II的Fl區(qū)、也與凝血酶原的Fl區(qū)結(jié) 合的抗體，可以不具有PIVKA-II分子特異性（S卩，不與凝血酶原結(jié)合而只與PIVKA-II結(jié)合 的結(jié)合性）。
[0017] 抗F2抗體是與凝血酶原F2特異性結(jié)合的抗體。即，在PIVKA-II的凝血酶原F2 區(qū)內(nèi)具有表位，是識(shí)別該表位而與PIVKA-II結(jié)合的抗體。例如，只與凝血酶原或PIVKA-II 的F2區(qū)片段結(jié)合、實(shí)質(zhì)上不與Fl區(qū)片段以及凝血酶區(qū)片段的任意一方結(jié)合的抗體是"與 凝血酶原F2特異性結(jié)合的抗體"。這里所述的"實(shí)質(zhì)上不結(jié)合"是指：不與Fl區(qū)片段以及 凝血酶區(qū)片段的任意一方以可檢測(cè)的水平結(jié)合（即，與Fl區(qū)片段以及凝血酶區(qū)片段的結(jié)合 為背景噪聲以下），或者即使是以可檢測(cè)的水平結(jié)合，也僅以本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的程度結(jié) 合，即與它們結(jié)合的程度明顯少于與F2區(qū)片段的結(jié)合，并非與Fl區(qū)片段或凝血酶區(qū)片段 結(jié)合。F2區(qū)的氨基酸序列在PIVKA-II和凝血酶原中均相同，因此抗F2抗體通常是可以與 PIVKA-II的F2區(qū)、也可以與凝血酶原的F2區(qū)結(jié)合的抗體。
[0018] 抗PIVKA-II抗體是只與PIVKA-II結(jié)合、實(shí)質(zhì)上不與凝血酶原結(jié)合的抗體。
[0019] 抗Fl抗體、抗F2抗體和抗PIVKA-II抗體各自可以是單克隆抗體，也可以是多克 隆抗體。從免疫測(cè)定的再現(xiàn)性等角度考慮，可優(yōu)選使用單克隆抗體。另外，這些抗體也可以 以保持與對(duì)應(yīng)抗原的結(jié)合性的抗體片段（抗原結(jié)合性片段）的形式使用。
[0020] 多克隆抗體、單克隆抗體和抗原結(jié)合性片段的制備方法本身是周知的常規(guī)方法， 抗Fl抗體、抗F2抗體、抗PIVKA-II抗體以及它們的抗原結(jié)合性片段可按照常規(guī)方法制備。 另外，這些抗體也存在市售商品，因此也可以使用市售的抗體。
[0021] 抗Fl多克隆抗體例如可如下獲得：將Fl多肽或其部分片段與適當(dāng)?shù)淖魟┮黄鹈?疫動(dòng)物（人除外），由從該動(dòng)物采集的血液獲得抗血清，純化該抗血清中的多克隆抗體。為 了使被免疫動(dòng)物中抗體效價(jià)升高，免疫通常需要花費(fèi)數(shù)周進(jìn)行多次?？寡逯械目贵w的純 化例如可通過(guò)用硫酸銨沉淀或采用陰離子色譜的分離、親和柱純化等進(jìn)行。抗F2多克隆抗 體也可以以F2多肽或其部分片段作為免疫原類(lèi)似地制備。
[0022] 抗Fl單克隆抗體例如可通過(guò)周知的雜交瘤法制備。具體來(lái)說(shuō)，可將Fl多肽（Fl 區(qū)片段）、凝血酶原、PIVKA-II或它們的部分片段與適當(dāng)?shù)淖魟┮黄鹈庖邉?dòng)物（人除外）， 從該動(dòng)物采集脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞等的抗體生成細(xì)胞，將其與骨髓瘤細(xì)胞融合，制備雜交瘤， 選擇生產(chǎn)與Fl多肽結(jié)合的抗體的雜交瘤，使其增殖，從培養(yǎng)上清中獲得抗Fl單克隆抗體。 抗F2單克隆抗體也同樣，以F2多肽、凝血酶原、PIVKA-II或其部分片段作為免疫原，通過(guò) 選擇生產(chǎn)與F2多肽結(jié)合的抗體的雜交瘤來(lái)制備。
[0023] 關(guān)于抗PIVKA-II抗體，多克隆抗體可使用羧基化不完全的Gla區(qū)部分片段作為免 疫原來(lái)制備，但本發(fā)明中，必須對(duì)PIVKA-II具有足夠的特異性，因此通常使用單克隆抗體。 對(duì)于PIVKA-II單克隆抗體，可使用PIVKA-II或其部分片段（含有受到羧基化的Gla區(qū)的 10個(gè)殘基中的至少一部分的部分片段）作為免疫原制備雜交瘤，然后選擇生產(chǎn)與PIVKA-II 結(jié)合而不與凝血酶原結(jié)合的抗體的雜交瘤，回收抗體?？筆IVKA-II抗體的制備方法的具體 例子可舉出日本特開(kāi)昭60-60557號(hào)公報(bào)、日本特開(kāi)平9-249699號(hào)公報(bào)所述的方法。
[0024] "抗原性結(jié)合性片段"只要可保持原本抗體與對(duì)應(yīng)抗原的結(jié)合性（抗原抗體反應(yīng) 性）即可，可以是任何抗體片段。具體例子可舉出：? &13、？(&13'）2、8(^ ￥等，但并不限于此。 眾所周知，F(xiàn)ab或F(ab'）2可通過(guò)將單克隆抗體用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等的蛋白質(zhì)分解 酶處理來(lái)獲得。scFv(單鏈可變區(qū)片段，單鏈抗體）的制備方法也是周知的，例如可提取如 上所述制備的雜交瘤的mRNA，制備單鏈cDNA，使用對(duì)免疫球蛋白H鏈和L鏈為特異性的引 物進(jìn)行PCR，使免疫球蛋白H鏈基因和L鏈基因擴(kuò)增，將它們用接頭連接，使其具有適當(dāng)?shù)南?制酶切位點(diǎn)，導(dǎo)入質(zhì)粒載體中，用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使scFv表達(dá)，將其從大腸桿菌中回 收，由此獲得scFv。
[0025] 作為免疫原使用的多肽或其部分片段可通過(guò)化學(xué)合成、遺傳工程學(xué)方法等常規(guī)方 法制備。或者可從新鮮人血漿等中提取凝血酶原或PIVKA-II并純化獲得（參照Thromb. Diath. Haemorph. I%6; I6:469_9〇 等）〇
[0026] 化學(xué)合成法的具體例子例如可舉出：Fmoc法（荷甲氧羰基法）、tBoc法（叔丁氧 基羰基法）等。還可以利用各種市售的肽合成儀，通過(guò)常規(guī)方法合成?；瘜W(xué)合成時(shí)，可以只 根據(jù)氨基酸序列合成所需的多肽。
[0027] 通過(guò)遺傳工程學(xué)方法制備多肽的方法也是周知的。具體來(lái)說(shuō)，例如可通過(guò)以下 所述的方法制備。首先，由來(lái)自人的培養(yǎng)細(xì)胞等中提取RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)由mRNA合成 cDNA。以該cDNA為模板，使用根據(jù)人凝血酶原的mRNA序列信息設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR，制備 編碼凝血酶原全長(zhǎng)或所需一部分（Fl區(qū)或F2區(qū)等）的多核苷酸。PCR中使用的引物可以根 據(jù)SEQ ID NO: 2所示的堿基序列或登記于GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)中的人凝血酶原序列信息等 適當(dāng)設(shè)計(jì)。或者，編碼所需多肽的多核苷酸可通過(guò)使用市售的核酸合成儀的常規(guī)方法制備。 編碼各氨基酸的密碼子是公知的，因此只要特定氨基酸序列，編碼該氨基酸序列的多核苷 酸的堿基序列也可確定。接著，將制備的多核苷酸摻入適當(dāng)?shù)妮d體，通過(guò)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)使 多肽表達(dá)，回收該多肽，由此可獲得所需的多肽。所使用的載體或各種表達(dá)系統(tǒng)（細(xì)菌表達(dá) 系統(tǒng)、酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等） 也是周知的，各種載體或宿主細(xì)胞、試劑類(lèi)、試劑盒均有市售，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng) 選擇使用。來(lái)自人的培養(yǎng)細(xì)胞也有市售/分開(kāi)出售，容易獲得。
[0028] 抗Fl抗體與抗F2抗體的混合比例只要是在PIVKA-II測(cè)定值中可得到良好的 血清/血漿相關(guān)性的范圍即可，沒(méi)有特別限定，以抗Fl抗體：抗F2抗體=1:0. 2-2、優(yōu)選 1:0. 3-1. 5、更優(yōu)選1:0. 5-1. 0的混合比例，尤其可獲得良好的血清/血漿相關(guān)性。如后述 實(shí)施例所示，在只使用抗F2抗體時(shí)，血漿樣品的PIVKA-II測(cè)定值比血清樣品的測(cè)定值高， 未能得到良好的血清/血漿相關(guān)性。只使用抗Fl抗體時(shí)，血清樣品的PIVKA-II測(cè)定值比 血漿樣品的測(cè)定值高，未能得到良好的血清/血漿相關(guān)性。而通過(guò)將抗Fl抗體和抗F2抗 體混合使用，可以改善血清/血漿相關(guān)性。
[0029] 夾心免疫測(cè)定本身是周知的常規(guī)方法。作為具體例子，可舉出化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè) 定法（CLEIA)、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)、放射免疫測(cè)定、電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法等各種方 法，本發(fā)明中可以采用任意方法。
[0030] 夾心測(cè)定系統(tǒng)中，通常使用2種抗體中的一方作為固定于固相上的固相抗體，使 用另一方作為標(biāo)記抗體。本發(fā)明中，使用抗Fl抗體/抗F2抗體混合物作為1種抗體，使用 抗PIVKA-II抗體作為另1種抗體，但是，可以使用任意一種作為固相抗體。下述實(shí)施例中， 使用抗PIVKA-II抗體作為固相抗體，使用抗體混合物作為標(biāo)記抗體，但并不限于此。
[0031] 以使用抗Fl抗體/抗F2抗體混合物作為標(biāo)記抗體的情形為例，具體說(shuō)明本發(fā)明 的PIVKA-II測(cè)定方法。首先，將PIVKA-II抗體（固相抗體）固定于載體上。使固定的 PIVKA-II抗體與樣品中所含的PIVKA-II接觸，由此使固相抗體與PIVKA-II特異性結(jié)合。 接著，用適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌除去未結(jié)合的樣品中成分，例如載體，然后使用標(biāo)記物標(biāo)記的抗 Fl抗體/抗F2抗體混合物（S卩，標(biāo)記抗Fl抗體和標(biāo)記抗F2抗體的混合物）與結(jié)合于固相 抗體上的PIVKA-II結(jié)合。反應(yīng)結(jié)束后，為了除去未反應(yīng)的成分，例如用適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌 載體后，用適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)來(lái)自標(biāo)記物的信號(hào)，由此可測(cè)定樣品中所含的PIVKA-II。
[0032] 固相沒(méi)有特別限定，可以與在公知的夾心免疫測(cè)定系統(tǒng)中使用的固相相同。固相 的材質(zhì)的具體例子可舉出：聚苯乙烯、聚乙烯、瓊脂糖等，但并不限于這些。固相的物理形狀 本質(zhì)上并不重要。所使用的固相優(yōu)選為抗體與其表面的固定容易且可容易地將測(cè)定中形成 的免疫復(fù)合物與未反應(yīng)的成分分離的材料。特別優(yōu)選在常規(guī)免疫測(cè)定法中使用的塑料板或 磁性粒子。從操作、保存和分離的容易性等考慮，最優(yōu)選使用如上所述材質(zhì)的磁性粒子?？?體與這些固相的結(jié)合可通過(guò)本領(lǐng)域周知的常規(guī)方法進(jìn)行。
[0033] 標(biāo)記物也沒(méi)有特別限定，可以使用與在公知的免疫測(cè)定系統(tǒng)中使用的標(biāo)記物同樣 的物質(zhì)。具體例子可舉出：酶、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、染色物質(zhì)、放射性物質(zhì)等。酶可以 使用堿性磷酸酶（ALP)、過(guò)氧化物酶、β半乳糖苷酶等公知的酶，但并不限于這些。為了提 供高檢測(cè)靈敏度的測(cè)定系統(tǒng)，優(yōu)選使用ALP。
[0034] 使用酶作為標(biāo)記物時(shí)，通過(guò)使與該酶對(duì)應(yīng)的顯色底物、熒光底物或發(fā)光底物等底 物與該酶反應(yīng)并測(cè)定由此產(chǎn)生的信號(hào)，可求出酶活性對(duì)測(cè)定對(duì)象物進(jìn)行測(cè)定。例如，使用 ALP作為標(biāo)記物時(shí)，可以使用3-(4-甲氧基螺（1，2-二氧環(huán)乙烷-3, 2'-三環(huán)[3. 3. 1. 13, 7] 癸烷）-4-基）苯基磷酸二鈉（例如商品名AMPPD)等的發(fā)光底物。
[0035] 使用生物素或半抗原作為標(biāo)記物時(shí)，可以使用結(jié)合了酶、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物 質(zhì)、染色物質(zhì)或放射性物質(zhì)等的鏈霉抗生物素或半抗原抗體等測(cè)定。
[0036] 信號(hào)的檢測(cè)可根據(jù)標(biāo)記物的種類(lèi)適當(dāng)選擇。例如信號(hào)如果是顯色，則可以使用 比色計(jì)或吸光光度計(jì)，如果是熒光則可以使用熒光光度計(jì)，如果是發(fā)光則可以使用光子計(jì) 數(shù)儀，如果是放射線(xiàn)則可以使用放射線(xiàn)測(cè)定裝置。對(duì)于以各種濃度含有PIVKA-II的濃度 已知的標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照本發(fā)明的方法測(cè)定PIVKA-II，由來(lái)自標(biāo)記的信號(hào)量和標(biāo)準(zhǔn)樣品中 PIVKA-II的濃度的相關(guān)關(guān)系制圖，制成校正曲線(xiàn)，對(duì)PIVKA-II濃度未知的樣品同樣進(jìn)行測(cè) 定操作，測(cè)定來(lái)自標(biāo)記的信號(hào)量，將測(cè)定值代入該校正曲線(xiàn)，由此可對(duì)樣品中PIVKA-II進(jìn) 行定量。
[0037] 本發(fā)明的方法所適用的樣品是從受試者分離的樣品，優(yōu)選血液樣品，特別優(yōu)選 血漿或血清。根據(jù)本發(fā)明的測(cè)定方法，不管是血漿樣品還是血清樣品，均可穩(wěn)定地測(cè)定 PIVKA-II。樣品可根據(jù)需要適當(dāng)稀釋后使用。
[0038] 本發(fā)明還提供樣品中的PIVKA-II的免疫測(cè)定試劑，該試劑含有：抗PIVKA-II抗體 或其抗原結(jié)合性片段（抗PIVKA-II抗體等）、抗Fl抗體或其抗原結(jié)合性片段（抗Fl抗體 等）、和抗F2抗體或其抗原結(jié)合性片段（抗F2抗體等）。該免疫測(cè)定試劑中，抗Fl抗體等 和抗F2抗體等可分別封裝入容器，或者預(yù)先混合后封裝入容器。還可以進(jìn)一步含有對(duì)這些 抗體或其抗原結(jié)合性片段的穩(wěn)定等有用的其它成分。這些抗體或其抗原結(jié)合性片段可以是 用標(biāo)記物標(biāo)記的形態(tài)，或固定在板、粒子等固相上的形態(tài)。
[0039] 上述免疫測(cè)定試劑可以與其它試劑類(lèi)等適當(dāng)組合，作為樣品中的PIVKA-II的免 疫測(cè)定試劑盒提供。免疫測(cè)定所必需的其它試劑類(lèi)是周知的。例如，除上述免疫測(cè)定試劑 之外，本發(fā)明的試劑盒中還可以進(jìn)一步含有樣品稀釋液、洗滌液、以及標(biāo)記抗體中使用的標(biāo) 記物為酶時(shí)的該酶的底物液等。 實(shí)施例
[0040] 以下通過(guò)實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明。當(dāng)然本發(fā)明并不受這些實(shí)施例等的限定。
[0041] 實(shí)施例1.標(biāo)記抗體的制備 (A)雜交瘤的制備 將純化凝血酶原（按照 Shapiro S.等人·，The purification of human prothrombin. Thromb. Diath. Haemorph. 1966; 16:469-90 所述的方法從新鮮人血衆(zhòng)中純 化而得）在含有〇· 15M NaCl的IOmM磷酸緩沖液（ρΗ7· 3)中稀釋?zhuān)K濃度為0· 2-1. 0mg/mL， 與等量的弗氏完全佐劑混合，制成油包水型乳液。將該乳液腹腔內(nèi)給予7周齡的BALB/c系 小鼠，之后將氟完全佐劑變更為弗氏不完全佐劑，每2周進(jìn)行同樣的免疫，進(jìn)行2到3次。進(jìn) 而在約2周后腹腔內(nèi)給予100 μ L溶解于生理鹽水的0. 2-1. 0mg/mL純化凝血酶原（最終追 加免疫）。
[0042] 最終追加免疫后第3天，由該免疫動(dòng)物無(wú)菌摘除脾臟，用剪刀剪成碎片，進(jìn)一步使 用篩網(wǎng)將脾臟拆解成單個(gè)細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次，計(jì)測(cè)細(xì)胞數(shù)。與上述同樣地 洗滌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞株P(guān)3X63Ag8-Ul，然后調(diào)節(jié)為所計(jì)測(cè)的脾細(xì)胞數(shù)的1至 1/10的細(xì)胞數(shù)，加入到50ml容量的離心管中混合。以200X g、5分鐘進(jìn)行離心，除去上清， 加入ImL聚乙二醇（PEG) 1500 ( y少夕制造）進(jìn)行細(xì)胞融合。然后加入15mL RPMI-1640培 養(yǎng)基，進(jìn)行聚乙二醇的稀釋。
[0043] 對(duì)于融合細(xì)胞，通過(guò)離心（200 X g，5分鐘）除去PEG，然后使用96孔板在含有10% 胎牛血清、次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷（HAT)的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)約10天，只使雜交 瘤增殖。然后取部分培養(yǎng)上清，通過(guò)將純化凝血酶原用作固相抗原的ELISA法，篩選各個(gè)生 產(chǎn)凝血酶原抗體的孔，得到多個(gè)生產(chǎn)對(duì)凝血酶原具有反應(yīng)性的單克隆抗體的雜交瘤。對(duì)于 所得雜交瘤，按照常規(guī)的極限稀釋法進(jìn)行單克隆。
[0044] (B)單克隆抗體的制備 將按照（A)所述的方法得到的雜交瘤移植到預(yù)先腹腔內(nèi)給予了 0.5mL降植烷的小鼠腹 腔內(nèi)，每只移植約IXlO7個(gè)，取得在腹水中產(chǎn)生的單克隆抗體。該單克隆抗體的純化是通 過(guò)利用結(jié)合了 A蛋白的瓊脂糖柱（才7 7卜''制造）分離IgG流分來(lái)進(jìn)行。
[0045] 接著，分別將凝血酶原多肽、Fl多肽和F2多肽分別固定在微量滴定板上，分別 對(duì)于得到的單克隆抗體研宄其對(duì)各多肽的反應(yīng)性。即，將全長(zhǎng)凝血酶原（Termo)、凝血 酶原-片段 I (Haematologic Technologies Inc.)、凝血酶原-片段 2 (Haematologic Technologies Inc.)分別用0. IM磷酸緩沖液（pH7. 0)制備成5 μ g/mL的溶液。將100 μ L 這些抗原溶液添加到微量板（Nunc，Maxisorp)的各孔中，在4°C下反應(yīng)12-18小時(shí)，然后除 去抗原溶液，將300 μ L含有1%BSA、0. 1%疊氮化鈉的50mM Tris-HCl緩沖液（pH7. 2)添加到 各孔中。在室溫下靜置2小時(shí)，然后封閉微量板的未反應(yīng)部位，用含有0. 01%TritonX-100、 0· 03M NaCl的IOmM Tris-HCl (ρΗ7· 2)(以下記為洗滌液）洗滌3次，由此得到各種多肽 固相板。制備單克隆抗體hPTN7-2、PT5-23和20Β8的5 μ g/mL抗體溶液，將100 μ L該溶液 添加到固定有上述3種多肽（全長(zhǎng)凝血酶原、凝血酶原-片段1、凝血酶原-片段2)的微量 板的各孔中，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)，然后除去抗體溶液，用洗滌液洗滌3次。將100 μ L稀釋 為一定濃度的堿性磷酸酶標(biāo)記抗小鼠 igG( 0々夕y X A y y寸一于制造）添加到各孔 中，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)，然后除去標(biāo)記抗體溶液，用洗滌液洗滌3次，添加100 μ L含有作 為顯色底物的IOmM 4-硝基苯基磷酸、ImM氯化鎂的IM二乙醇胺-鹽酸緩沖液（ρΗΙΟ. 5)， 進(jìn)行顯色反應(yīng)。在遮光下室溫靜置15分鐘，然后添加100 yL含有50mM EDTA的0. IM磷酸 緩沖液（ρΗ7· 0)，終止反應(yīng)，然后用微量板讀數(shù)儀（才7 7卜'、）測(cè)定450nm/630nm的吸 光度。
[0046] 測(cè)定結(jié)果如圖1所示。單克隆抗體hPTN7-2和PT5-23與凝血酶原多肽和Fl多肽 反應(yīng)，不與F2多肽反應(yīng)，因此，可確認(rèn)是特異性識(shí)別Fl的抗Fl單克隆抗體。而單克隆抗體 20B8與凝血酶原多肽和F2多肽反應(yīng)，不與Fl多肽反應(yīng)，因此，可確認(rèn)是特異性識(shí)別F2的抗 F2單克隆抗體。
[0047] (C)標(biāo)記抗體的制備 接著，取6mL 3mg/mL的hPTN7-2抗體溶液，添加到用0. IM檸檬酸緩沖液（pH3. 5)平衡 的G-25柱（7 7 Yシ7制造）中，進(jìn)行抗體溶液的緩沖液置換。向其中加入約100 μ L lmg/mL胃蛋白酶溶液，37°C放置1小時(shí)，用Tris緩沖液將pH調(diào)至中性附近，然后添加到只 - A-r 7夕只200柱（7 7 Yシ7制造）中，進(jìn)行抗體的凝膠過(guò)濾純化。合并所得流 分在吸光度280nm下的單峰，作為hPTN7-2抗體F(ab'） 2片段。在4mL該F(ab'）2片段溶 液中添加200 μ L 0. 2M 2-巰基乙胺（以下記為2-MEA)溶液，37°C放置2小時(shí)，進(jìn)行還原處 理。將其添加到G-25柱中，除去2-MEA，作為hPTN7-2抗體Fab'片段。
[0048] 將I. 5mL 10mg/mL的高比活性ALP溶液添加到用0· IM磷酸緩沖液（ρΗ7· 0)平衡 的G-25中，進(jìn)行ALP溶液的緩沖液置換。向其中添加70 μ L 10mg/mL N-(4-馬來(lái)酰亞胺基 丁基氧基）_琥珀酰亞胺（以下記為GMBS)的二甲基甲酰胺溶液，30°C放置1小時(shí)以進(jìn)行反 應(yīng)。將該溶液添加到用0. IM磷酸緩沖液（pH6. 3)平衡的G-25柱中，除去過(guò)量的GMBS，制 備馬來(lái)酰亞胺化ALP。將4mL之前制備的hPTN7-2抗體Fab'片段溶液、3mL馬來(lái)酰亞胺化 ALP溶液和13mL 0. IM磷酸緩沖液（pH6. 3)混合，在室溫下放置1小時(shí)，由此制備ALP標(biāo)記 抗體。向其中加入ImL 2M 2-MEA溶液，在室溫下放置30分鐘，將多余的馬來(lái)酰亞胺基封 閉，然后添加到只一，一r 7夕只200柱中，進(jìn)行純化。合并吸光度280nm的幾個(gè)峰中Fab' 和ALP為1:1的分子量的峰，作為純化ALP標(biāo)記hPTN7-2抗體（ALP標(biāo)記抗Fl抗體）。對(duì)于 PT5-23抗體和20B8抗體，也同樣地制備純化ALP標(biāo)記PT5-23抗體（ALP標(biāo)記Fl抗體）和 純化ALP20B8抗體（ALP標(biāo)記抗F2抗體）。
[0049] 實(shí)施例2.測(cè)定數(shù)據(jù) (D)PIVKA-II 的測(cè)定 樣品是由同一健康受試者得到的人血清/血漿（肝素鈉和EDTA-2鈉）樣品對(duì)。除了 使用酶標(biāo)抗體之外，測(cè)定中還使用少S スフ°レ只卜PIVKA-II工一寸、<(富士 U匕、才制 造）所附的試劑（抗體結(jié)合粒子、洗滌液）。
[0050] 首先，在50 μ L結(jié)合有與PIVKA-II特異性結(jié)合的抗PIVKA-II單克隆抗體（小鼠） 的抗體結(jié)合粒子（抗PIVKA-II單克隆抗體（小鼠）結(jié)合磁性粒子）中添加20 μ L樣品，攪 拌，然后在37°C下反應(yīng)8分鐘。通過(guò)磁力從磁性粒子中分離除去反應(yīng)殘余液，用洗滌液洗 滌。在洗滌后的粒子中添加在（C)中制備的ALP標(biāo)記抗Fl抗體（hPTN7-2抗體或PT5-23 抗體）（終濃度〇· 4 μ g/mL)和ALP標(biāo)記抗F2抗體（終濃度0· 2 μ g/mL)，攪拌后在37°C下 反應(yīng)8分鐘。比較例是使用ALP標(biāo)記抗凝血酶原多克隆抗體作為酶標(biāo)抗體。
[0051] 然后，再次通過(guò)磁力分離磁性粒子，除去反應(yīng)殘余液，用洗滌液洗滌。向該粒子中 添加200 μ L含有堿性磷酸酶的化學(xué)發(fā)光底物3-(2' -螺金剛烷）-4-甲氧基-4-(3' ' -磷 酰氧基）苯基-1，2-二氧環(huán)乙烷·2鈉鹽（AMPPD)的底物液，在37°C下進(jìn)行4分鐘的酶促反 應(yīng)。通過(guò)發(fā)光測(cè)定儀測(cè)定反應(yīng)后的化學(xué)發(fā)光量。測(cè)定儀器使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定裝 置;I/ Sパ；レスフ°レ只卜11(富士 U匕、才制造）。
[0052] 表1示出使用ALP標(biāo)記抗凝血酶原多克隆抗體作為酶標(biāo)抗體測(cè)定的9個(gè)血清/血 漿樣品對(duì)的結(jié)果。表2示出使用ALP標(biāo)記抗Fl抗體（hPTN7-2抗體）和ALP標(biāo)記抗F2抗 體（20B8抗體）的混合物作為酶標(biāo)抗體測(cè)定的9個(gè)血清/血漿樣品對(duì)的結(jié)果。結(jié)果，如表 1所示，在使用ALP標(biāo)記抗凝血酶原多克隆抗體時(shí)，肝素血漿中的血漿/血清比例平均約為 79%，可確認(rèn)血清/血漿相關(guān)性低。而將抗Fl抗體和抗F2抗體按照重量比2:1混合作為 ALP標(biāo)記抗體時(shí)，如表2所示，肝素血漿中的血漿/血清比例約為102%，EDTA血漿中的血漿 /血清比例約105%，每種情形的血清/血漿的相關(guān)性均得到改善。
[0053] [表 1]
[表2]

【權(quán)利要求】
1. PIVKA-II的測(cè)定方法，包括：通過(guò)使用與凝血酶原片段1特異性結(jié)合的抗Fl抗體 或其抗原結(jié)合性片段、和與凝血酶原片段2特異性結(jié)合的抗F2抗體或其抗原結(jié)合性片段的 混合物、以及與PIVKA-II特異性結(jié)合的抗PIVKA-II抗體或其抗原結(jié)合性片段的免疫測(cè)定， 來(lái)測(cè)定樣品中的PIVKA-II。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述抗Fl抗體是識(shí)別Fl區(qū)內(nèi)的表位而與PIVKA-II 結(jié)合的抗體，所述抗F2抗體是識(shí)別F2區(qū)內(nèi)的表位而與PIVKA-II結(jié)合的抗體。
3. 權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述抗Fl抗體、所述抗F2抗體和所述抗 PIVKA-II抗體均是單克隆抗體。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述免疫測(cè)定是通過(guò)使用所述混合物作 為標(biāo)記抗體、使用所述抗PIVKA-II抗體或其抗原結(jié)合性片段作為固相抗體的夾心法進(jìn)行。
5. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述混合物是以1:0. 2-2的比例含有抗 Fl抗體和抗F2抗體的混合物。
6. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述樣品是血清或血漿。
7. 樣品中的PIVKA-II的免疫測(cè)定試劑，包含：與PIVKA-II特異性結(jié)合的抗PIVKA-II 抗體或其抗原結(jié)合性片段、與凝血酶原片段Fl特異性結(jié)合的抗Fl抗體或其抗原結(jié)合性片 段、和與凝血酶原片段F2特異性結(jié)合的抗F2抗體或其抗原結(jié)合性片段。
8. 樣品中的PIVKA-II的免疫測(cè)定試劑盒，包括：權(quán)利要求7所述的免疫測(cè)定試劑。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK104520710SQ201380042250
【公開(kāi)日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月9日
【發(fā)明者】山口建太郎, 青柳克己, 寺尾梓 申請(qǐng)人:富士瑞必歐株式會(huì)社, 愛(ài)代爾株式會(huì)社