人視黃醇結(jié)合蛋白的純化工藝及其多克隆抗體的制備工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人視黃醇結(jié)合蛋白的純化工藝及其多克隆抗體的制備工藝。本發(fā)明運用DEAE-Sepharose?Fast?Flow(DEAE-S)離子交換柱、分子篩(Superdex?75、Sephacryls-200)及疏水柱Phenyl?SepharoseTM?High?Performance(PHSP)等多種色譜柱分離技術，成功地從腎臟損傷患者的尿液中進行人源視黃醇結(jié)合蛋白的純化，最大程度地保留了RBP蛋白的免疫原性。將獲得的人源RBP抗原用于免疫動物，從而獲得抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體。所得抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體可應用于免疫比濁試劑盒。
【專利說明】人視黃醇結(jié)合蛋白的純化工藝及其多克隆抗體的制備工藝

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學免疫【技術領域】，具體涉及人視黃醇結(jié)合蛋白的純化工藝及其多克 隆抗體的制備工藝。

【背景技術】
[0002] 視黃醇結(jié)合蛋白（Retinol Binding Protein, RBP)為血液中視黃醇（維生素 A) 的轉(zhuǎn)運蛋白。1961年Berggard在免疫電泳中發(fā)現(xiàn)在α 2-球蛋白區(qū)域能形成一條長沉淀線 的蛋白質(zhì)，曾稱為長α 2-球蛋白。在以后幾十年中，人們對這種蛋白質(zhì)的分子結(jié)構、生物學 特性等進行了全面研究，發(fā)現(xiàn)這種蛋白質(zhì)廣泛地分布于正常人體液中，屬α 1-球蛋白，具 有從肝細胞中轉(zhuǎn)運視黃醇至周圍組織的功能。目前，認為血液中RBP主要以視黃醇、前白蛋 白結(jié)合的復合物形式存在，當復合物中視黃醇與靶細胞結(jié)合后，RBP便與前白蛋白分離，自 腎小球濾出，由近端腎小管上皮細胞吸收、降解。因此正常人尿液中幾乎不含有RBP (含量 低于300ng/ml)，若腎小管病變，則重吸收功能下降，會導致尿液中的RBP大量上升。因此， 在腎小管操作病人尿液中RBP含量大于300ng/ml，一般可達到正常人的5倍以上，嚴重者其 尿液中的RBP含量甚至可以達到100000ng/ml以上。近年來的研究表明，RBP含量改變能 夠敏感地反映近端腎小管功能、肝功能損害程度，是反映腎臟、肝臟及營養(yǎng)性疾病發(fā)展、轉(zhuǎn) 歸的敏感指標。
[0003] 現(xiàn)有的對人源RBP純化技術，主要有：運用硫酸銨鹽析后，再通過DEAE-S印hadex A25 柱、SephadexG200、Ultrogel ACA44 柱和 Sephadex G100 柱層析分離純化人血楽 RBP， 或者是將血漿中RBP和前白蛋白的復合物通過含有前白蛋白抗體的S印harose 4B凝膠柱 進行純化獲得，此類方法得到的抗原產(chǎn)率較高，但是前白蛋白抗體的處理較為復雜，并且需 要大量實驗來尋找最佳洗脫液的成分，不易于產(chǎn)業(yè)化。另一種是將來源于尿液的RBP蛋白 液經(jīng)過乙?；?葡聚糖凝膠柱層析和DEAE-葡聚糖凝膠柱層析，獲得人源RBP抗原，而此提 取效果不夠理想。再有就是在變性條件下，應用Sephacryl-100凝膠過濾和Source_30Q陰 離子交換兩步分離獲得RBP,但該方法主要應用于重組RBP的純化。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種人視黃醇結(jié)合蛋白的純化工藝及其多克隆 抗體的制備工藝。
[0005] 本發(fā)明的第一方面，提供一種從尿液中提取純化人視黃醇結(jié)合蛋白的工藝，包括 以下步驟：
[0006] 1)從腎臟損傷患者的尿液中獲取尿蛋白液；
[0007] 2)所得的尿蛋白液過DEAE-Sepharose Fast Flow凝膠柱層析，用緩沖液B1平衡 后再用緩沖液B2洗脫，收集洗脫峰，對洗脫峰進行檢測，合并含RBP的部分，得到RBP組分 1 ;其中：
[0008] 緩沖液 B1 :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8. 0+40 ?50mM NaCl+0. 01 ?0· 03% NaN3+l ?2mM EDTA ;
[0009] 緩沖液 B2 :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8. 0+250 ?350mM NaCl+0. 01 ?0· 03% NaN3+l ?2mM EDTA ;
[0010] 3)將RBP組分1用硫酸銨鹽析，使其中硫酸銨的飽和度為55?65%，離心，收集 蛋白沉淀，所得蛋白沉淀用緩沖液C復溶，離心，取上清液經(jīng)Sephacryls-200分子篩凝膠層 析，用緩沖液C洗脫，收集洗脫峰，對洗脫峰進行檢測，合并純度大于等于80 %的部分，得到 RBP組分2 ;其中：
[0011] 緩沖液 C :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8. 0+100 ?150mM NaCl+0. 01 ?0· 03% NaN3+l ?2mM EDTA ;
[0012] 4)向RBP組分2中添加飽和硫酸銨溶液直至其中硫酸銨的飽和度為25?30%， 然后過Phenyl Sepharose? High Performance疏水柱，用流動相梯度洗脫，收集洗脫峰，對 洗脫峰進行檢測，合并純度大于等于90%的部分，得到RBP組分3 ;其中：所述的流動相由 緩沖液A和緩沖液D組成，
[0013] 緩沖液 A :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8. 0+0· 01 ?0· 03% NaN3+l ?2mM EDTA ;
[0014] 緩沖液 D :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8· 0+25 ?30 % SAS+0. 01 ?0· 03 % NaN3+l ?3mM EDTA ;
[0015] 5)將RBP組分3用硫酸銨鹽析，使其中硫酸銨的飽和度為55?65%，離心，收集 蛋白沉淀，所得蛋白沉淀用緩沖液C復溶，離心，取上清液經(jīng)Sup erdeX75分子篩凝膠層析， 用緩沖液C洗脫，收集洗脫峰，對洗脫峰進行檢測，合并純度大于等于97 %的部分，得到RBP 組分4 ;
[0016] 6)取RBP組分4上偶聯(lián)α丨-MG多抗的CNBr-activated Sepharose 4B柱層析，收 集流出液，WB檢測，得到RBP抗原。
[0017] 上述技術方案的步驟1)中，用現(xiàn)有常規(guī)方法從尿液中獲取尿蛋白液，具體可以 按以下方法獲?。喝∧蛞弘x心，上清液加入硫酸銨使其中硫酸銨的飽和度為55?65%， 靜置過夜，離心，收集沉淀，沉淀用緩沖液復溶后再用緩沖液A透析，透析完成后再離心， 收集上清液即為尿蛋白液。其中，所述緩沖液的組成為：15?25mM Tris-HCl pH7. 5? 8. 0+120mM-250mM NaCl+0. 01 ?0· 03% NaN3+l ?2mM EDTA(請?zhí)峁?，緩沖液 A 的組成為： 15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8· 0+0· 01 ?0· 03% NaN3+l ?2mM EDTA。優(yōu)選是從腎臟損 傷患者24h的尿液中獲取尿蛋白液。
[0018] 上述技術方案的步驟2)中，所述緩沖液B1和緩沖液B2的組成優(yōu)選為：
[0019] 緩沖液 B1 :20mM Tris-HCl pH 8. 0+40 ?50mM NaCl+0. 02% NaN3+lmM EDTA ;
[0020] 緩沖液 B2 :2〇mM Tris-HCl pH8· 0+3〇OmM NaCl+0. 〇2% NaN3+lmM EDTA。
[0021] 上述技術方案的步驟4)中，所述緩沖液A和緩沖液D的組成優(yōu)選為：
[0022] 緩沖液 A :20mM Tris-HCl ρΗ8· 0+0· 02% NaN3+lmM EDTA ;
[0023] 緩沖液 D :20mM Tris-HCl ρΗ8· 0+25 ?30% SAS+0. 02% NaN3+lmM EDTA。
[0024] 上述技術方案的步驟4)中，過Phenyl Sepharose? High Performance疏水柱層 析時，流動相的洗脫條件優(yōu)選為：
[0025] 在收集10倍柱體積洗脫液的時間內(nèi)：緩沖液D : 100 - 0%，緩沖液A :0 - 100%。
[0026] 上述技術方案中，所述緩沖液C的組成優(yōu)選為：
[0027] 緩沖液 C :20mM Tris-HCl pH 8. 0+120mM NaCl+0. 02% NaN3+lmM EDTA。
[0028] 本發(fā)明的第二方面，提供一種抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體的制備工藝，包括 以下步驟：
[0029] I )選取合適的動物，以權利要求1制得的RBP抗原為免疫原對其進行皮下免疫 注射，直至動物的特異性抗血清滴度達標；
[0030] II )采集動物的抗血清，所得抗血清進行免疫電泳，如存在免疫球蛋白類及白蛋 白雜帶，將抗血清過偶聯(lián)正常人血清的CNBr-activated Sepharose4B柱去除免疫球蛋白類 及白蛋白雜帶，收集流出液，得到除雜后的抗血清；
[0031] III)用飽和度為40?60%的硫酸銨溶液沉淀除雜后的抗血清中的動物抗人腹水 球蛋白，離心，收集沉淀，沉淀透析脫鹽后過DEAE-Sepharose Fast Flow凝膠柱層析，用緩 沖液E洗脫，收集洗脫峰，對洗脫峰進行檢測，得到抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體；所述 緩沖液E的組成為：
[0032] 緩沖液 E :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8. 5+90 ?110mM NaCl。
[0033] 上述抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體的制備工藝的步驟I )中，在注射免疫原的 同時還需要注射一些必不可少的現(xiàn)有常規(guī)的佐劑，如弗氏佐劑等。
[0034] 上述抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體的制備工藝的步驟III)中，緩沖液E的組成 優(yōu)選為：20mM Tris-HCl pH8.0+100mM NaCl。
[0035] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明運用DEAE-Sepharose Fast Flow (DEAE-S)離子交 換柱、分子篩（Superdex 75、Sephacryls-200)及疏水柱 Phenyl Sepharose? High Performance (PHSP)等多種色譜柱分離技術，成功地從腎臟損傷患者的尿液中進行人源視 黃醇結(jié)合蛋白的純化，最大程度地保留了 RBP蛋白的免疫原性。將獲得的人源RBP抗原用 于免疫動物，從而獲得抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體。所得抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆 抗體可應用于免疫比濁試劑盒。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 圖1為實施例一所得的RBP抗原、實施例二所得的RBP抗原與leebio的RBP的 SDS-PAGE對比檢測結(jié)果；
[0037] 圖2為RBP對照品的高效液相色譜圖（對照品購自Leebio公司）；
[0038] 圖3為實施例一所得的RBP抗原的高效液相色譜圖；
[0039] 圖4為實施例一所得的RBP抗原的質(zhì)譜圖；
[0040] 圖5為實施例二所得的RBP抗原的高效液相色譜圖；
[0041] 圖6為以實施例三獲得的抗體為一抗，實施例一獲得的RBP及實施例二獲得的RBP 與Leebio的RBP的WB檢測譜圖；
[0042] 圖7為以實施例四獲得的抗體為一抗，實施例一獲得的RBP及實施例二獲得的RBP 與Leebio的RBP的WB檢測譜圖。

【具體實施方式】
[0043] 下面以具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不局限于這些實施例。
[0044] 實施例一免疫原（RBP抗原）的純化
[0045] 1、使用的儀器及柱子：
[0046] 1. 1儀器：簡易蛋白純化系統(tǒng)（包含恒流泵、紫外檢測器、記錄儀）（Amersham Pharmacia Biotech Inc)、GradiFrac TM Programming(Amersham Pharmacia Biotech Inc)，Waters600高相液相色譜儀（美國Waters公司）等。
[0047] 1. 2 柱子：離子交換柱 DEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-S)、分子篩（Superdex 75、 Sephacryls-200)、疏水柱 Phenyl Sepharose? High Performance(PSHP)、 CNBr-activated Sepharose 4B 均為 GE Healthcare 公司產(chǎn)；Protein Pak Glass 300SW 為 waters 產(chǎn)。
[0048] 2、腎損傷患者尿液的預處理
[0049] 2. 1取患者的尿液離心30min(4000r/min)，取上清液；
[0050] 2. 2上清液中加入固體SAS(硫酸銨）使飽和度達60%，靜置過夜；
[0051] 2. 3將上述靜置過夜的蛋白液離心30min(8000r/min)，取沉淀用緩沖液（組成為： 20mM Tris-HCl pH8. 0+200mM NaCl+0. 02%NaN3+lmM EDTA)復溶，并將復溶后的蛋白液用 緩沖液A(緩沖液A組成為：20mM Tris-HCl pH8. 0+0. 02%NaN3+lmM EDTA)充分透析，透析 完成后8000r/min離心30min，收集上清液，即為尿蛋白液，以其作為上樣品。
[0052] 3、分離純化：
[0053] 3.1流動相的準備：
[0054] 先配制 200mmol/L Tris (pH = 8. 0)、20 % (質(zhì)量）NaN3、4mol/L NaCl、飽和硫酸 銨作為儲備母液。其中：200mmol/L Tris(pH = 8. 0)的具體配制方法為：稱121. 14g Tris Base(國藥集團化學試劑有限公司），溶于超純水中，用濃鹽酸（西隴化工股份有限公司） 調(diào)pH，加超純水定容至5L，并且使溶液最終pH為8.0,0. 22um濾膜過濾，即得。20% (質(zhì) 量）NaN3的具體配制方法為：稱100g疊氮鈉（國藥集團化學試劑有限公司），加超純水溶 解，定容至500mL，混合均勻，用0. 22um濾膜過濾，即得。4mol/L NaCl的具體配制方法為： 稱1168. 8g固體NaCl (國藥集團化學試劑有限公司/西隴化工股份有限公司），加超純水 溶解，定容至5L，混合均勻，0. 22um濾膜過濾，即得。
[0055] 飽和硫酸銨的配制：往熱水中加入過量的固體硫酸銨，并用磁力攪拌器不斷攪拌， 溫度降下后即有大量的固體硫酸銨析出，說明已飽和。
[0056] 緩沖液 A :20mmol/L Tris pH = 8. 0+0· 02% NaN3+lmM EDTA ;
[0057] 量取 250mL 200mmol/L Tris pH = 8· 0、2· 5mL 20% NaN3、5mL 500mMEDTA 混合，力口 超純水定容至2. 5L，混勻，即得。
[0058] 緩沖液 B1 :20mmol/L Tris pH = 8. 0+40mmol/L NaCl+0. 03% NaN3+lmM EDTA ;
[0059] 量取250mL 200mmol/L Tris pH = 8. 0,25mL 4mol/L NaCl，3. 75mL 20%NaN3,5mL 500mMEDTA混合，加超純水定容至2. 5L，混勻，即得。
[0060] 緩沖液 B2:20mmol/L Tris pH = 8. 0+300mmol/L NaCl+0. 03% NaN3+lmM EDTA ;
[0061] 量取 250mL 200mmol/L Tris pH = 8. 0,187. 5mL 4mol/L NaCl，3. 75mL20% NaN3， 5mL 500mMEDTA混合，加超純水定容至2. 5L，混勻，即得。
[0062] 緩沖液 C:20mmol/L Tris pH = 8. 0+120mmol/L NaCl+0. 03% NaN3+lmM EDTA ;
[0063] 量取250mL 200mmol/L Tris pH = 8. 0,75mL 4mol/L NaCl，3. 75mL 20%NaN3,5mL 500mMEDTA混合，加超純水定容至2. 5L，混勻，即得。
[0064] 緩沖液 D :20mM Tris-HCl pH 8· 0+25% SAS+0. 02% NaN3+lmM EDTA
[0065] 量取 200mL 200mmol/L Tris pH = 8. 0,500mL 飽和硫酸銨，2mL 20% NaN3,4mL 500mMEDTA混合，加超純水定容至2. 0L，混勻，即得。
[0066] 3. 2 尿蛋白液（即尿液蛋白）過 DEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-S)層析柱
[0067] 3· 2. IDEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-S)層析柱的準備：選取合適色譜柱，裝入 DEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-S)填料，用緩沖液 B1 充分平衡。
[0068] 3. 2. 2上樣：將尿液蛋白上DEAE-S柱，上樣時，樣品液層高度應不大于柱床高度的 2/3。上樣前，接通紫外檢測器（405nm)、記錄儀，樣品全部入柱后：
[0069] a)上樣品過 DEAE-Sepharose Fast Flow (DEAE-S)層析柱；
[0070] b)用1倍柱體積緩沖液B1平衡；
[0071] C)用1.5倍柱體積緩沖液B2洗脫，收集洗脫峰，將收集到的樣進行SDS-PAGE檢 測，合并含RBP的部分，得到RBP組分1。
[0072] 3. 3RBP組分1過S印hacryls-200分子篩凝膠層析（分子篩S-200)
[0073] RBP組分1用SAS鹽析，在RBP組分1中添加固體SAS使溶液中硫酸銨的飽和度 達60%，之后8000r/min離心30min，獲得蛋白沉淀，用緩沖液C復溶。復溶后的蛋白液用 8000r/min，離心30min,去除難溶雜質(zhì)，取上清過分子篩S-200。上樣液體積應少于填料體 積的4%。收集洗脫液，每管收集的蛋白體積為約兩個柱橫截體積。將收集到的蛋白液進行 SDS-PAGE檢測，合并純度大于等于80 %的部分，得到RBP組分2。
[0074] 3. 4RBP 組分 2 過 Phenyl Sepharose? High Performance (PSHP)柱
[0075] 往RBP組分2中加飽和硫酸銨溶液使溶液中硫酸銨飽和度達25 %，然后過Phenyl Sepharose? High Performance(PSHP)疏水柱（事先用緩沖液D平衡柱子）。用由緩沖液 A和緩沖液D組成的流動相進行梯度洗脫，洗脫條件為：
[0076] 在10倍柱體積的時間里：緩沖液D由100%-0%，緩沖液A由0% - 100%，收集 洗脫峰，每管收集體積為一個柱橫截體積。將收集到的樣進行SDS-PAGE檢測，合并純度大 于等于90%的部分，得到RBP組分3。
[0077] 3. 5RBP組分3過Superdex 75分子篩膠（分子篩S-75)進一步精細純化
[0078] RBP組分3用SAS鹽析，在RBP組分3中添加 SAS使溶液中硫酸銨的飽和度達60%， 用8000r/min，離心30min，獲得蛋白沉淀，用緩沖液C復溶。復溶后的蛋白液用8000r/min, 離心30min,去除難溶雜質(zhì)，取上清過分子篩S-75。上樣液體積應少于填料體積的2%。收 集洗脫液，每管收集的蛋白體積為約兩個柱橫截體積。將收集到的蛋白液進行SDS-PAGE檢 測，合并純度大于等于97%的部分，得到RBP組分4。
[0079] 3. 6RBP組分4過a 1MG親和柱
[0080] 將 RBP 組分 4 過偶聯(lián) a fMG 多抗的 CNBr-activated Sepharose 4Β 柱去除 a fMG 雜質(zhì)，收集流出液，即得到RBP抗原。
[0081] 3. 7人視黃醇結(jié)合蛋白的驗證
[0082] 對所得的RBP抗原進行SDS-PAGE檢測并進行蛋白雜交印記，驗證結(jié)果顯示獲得的 抗原與抗RBP多克隆抗體有反應，并且與afMG多抗無反應。用Protein Pak Glass 300SW 柱HPLC進行檢測，以leebio的RBP為標品。獲得純度大于98%的RBP免疫原，其中，本實 施例所得RBP抗原與leebio的RBP的SDS-PAGE對比檢測結(jié)果如圖1所示，leebio的RBP 的高效液相色譜圖如圖2所示，本實施例所得RBP的高效液相色譜圖如圖3所示。用AXIMA Performance質(zhì)譜儀檢測分析獲得的RBP :質(zhì)譜掃描范圍：500?4000Da，將樣品按標準全 蛋白液態(tài)酶解流程酶解，檢測模式為反射正離子模式，視黃醇蛋白酶解片斷的一級質(zhì)譜圖 如圖4所示，由圖可知，樣品出峰良好，肽段數(shù)目較多。Mascot檢索結(jié)果顯示樣品為人源的 分子量為23337Da的蛋白。
[0083] 實施例二免疫原（RBP抗原）的純化
[0084] 1、腎損傷病人尿液的預處理與實例一相同
[0085] 2、分離純化：
[0086] 2.1流動相的準備：
[0087] 緩沖液 A :25mmol/L Tris pH = 7. 5+0. 01% NaN3+lmM EDTA ;
[0088] 量取 312. 5mL 200mmol/L Tris pH = 7. 5、L 25mL 20% aN3, 5mL 500mMEDTA 混合， 加超純水定容至2. 5L，混勻，即得。
[0089] 緩沖液 B1 :20mmol/L Tris pH = 8. 0+50mmol/L NaCl+0. 03% NaN3+lmM EDTA ;
[0090] 量取 250mL 200mmol/L Tris pH = 8. 0,31. 25mL 4mol/L NaCl，3. 75mL20% NaN3， 5mL 500mMEDTA混合，加超純水定容至2. 5L，混勻，即得。
[0091] 緩沖液 B2:15mmol/L Tris pH = 8. 0+250mmol/L NaCl+0. 01% NaN3+lmM EDTA ;
[0092] 量取 250mL 187. 5mmol/L Tris pH = 8. 0,156. 25mL 4mol/L NaCl，1. 25mL 20% NaN3, 5mL 500mMEDTA混合，加超純水定容至2. 5L，混勻，即得。
[0093] 緩沖液 C:20mmol/L Tris pH = 8. 0+120mmol/L NaCl+0. 03% NaN3+lmM EDTA ;
[0094] 量取250mL 200mmol/L Tris pH = 8. 0,75mL 4mol/L NaCl，3. 75mL 20%NaN3,5mL 500mMEDTA混合，加超純水定容至2. 5L，混勻，即得。
[0095] 緩沖液 D :25mM Tris-HCl pH 8. 5+30% SAS+0. 02% NaN3+lmM EDTA
[0096] 量取 200mL 312. 5mmol/L Tris pH = 8. 5,600mL 飽和硫酸銨，2. 0mL20% NaN3,4mL 500mMEDTA混合，加超純水定容至2. 0L，混勻，即得。
[0097] 3. 2 尿蛋白液（即尿液蛋白）過 DEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-S)層析柱
[0098] 3· 2. IDEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-S)層析柱的準備：選取合適色譜柱，裝入 DEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-S)填料，用緩沖液 B1 充分平衡。
[0099] 3. 2. 2上樣：將尿液蛋白上DEAE-S柱，上樣時，樣品液層高度應不大于柱床高度的 2/3。上樣前，接通紫外檢測器（405nm)、記錄儀，樣品全部入柱后：
[0100] a)上樣品過 DEAE-Sepharose Fast Flow (DEAE-S)層析柱；
[0101] b)用1倍柱體積緩沖液B1平衡；
[0102] c)用1. 5倍柱體積緩沖液B2洗脫，收集洗脫峰，將收集到的樣進行SDS-PAGE檢 測，合并含RBP的部分，得到RBP組分1。
[0103] 3. 3RBP組分1過S印hacryls-200分子篩凝膠層析（分子篩S-200)
[0104] RBP組分1用SAS鹽析，在RBP組分1中添加固體SAS使溶液中硫酸銨的飽和度 達65%，之后8000r/min離心30min，獲得蛋白沉淀，用緩沖液C復溶。復溶后的蛋白液用 8000r/min，離心30min,去除難溶雜質(zhì)，取上清過分子篩S-200。上樣液體積應少于填料體 積的4%。收集洗脫液，每管收集的蛋白體積為約兩個柱橫截體積。將收集到的蛋白液進行 SDS-PAGE檢測，合并純度大于等于80 %的部分，得到RBP組分2。
[0105] 3. 4RBP 組分 2 過 Phenyl Sepharose? High Performance (PSHP)柱
[0106] 往RBP組分2中加飽和硫酸銨溶液使溶液中硫酸銨飽和度達30%，然后過Phenyl Sepharose? High Performance(PSHP)疏水柱（事先用緩沖液D平衡柱子）。用由緩沖液 A和緩沖液D組成的流動相進行梯度洗脫，洗脫條件為：
[0107] 在10倍柱體積的時間里：緩沖液D由100%-0%，緩沖液A由0%- 100%，收集 洗脫峰，每管收集體積為一個柱橫截體積。將收集到的樣進行SDS-PAGE檢測，合并純度大 于等于90%的部分，得到RBP組分3。
[0108] 3. 5RBP組分3過Superdex 75分子篩膠（分子篩S-75)進一步精細純化
[0109] RBP組分3用SAS鹽析，在RBP組分3中添加 SAS使溶液中硫酸銨的飽和度達60 %， 用8000r/min，離心30min，獲得蛋白沉淀，用緩沖液C復溶。復溶后的蛋白液用8000r/min, 離心30min,去除難溶雜質(zhì)，取上清過分子篩S-75。上樣液體積應少于填料體積的2%。收 集洗脫液，每管收集的蛋白體積為約兩個柱橫截體積。將收集到的蛋白液進行SDS-PAGE檢 測，合并純度大于等于97%的部分，得到RBP組分4。
[0110] 3. 6RBP組分4過a 1MG親和柱
[0111] 將 RBP 組分 4 過偶聯(lián) a fMG 多抗的 CNBr-activated Sepharose 4Β 柱去除 a fMG 雜質(zhì)，收集流出液，即得到RBP抗原。
[0112] 3. 7人視黃醇結(jié)合蛋白的驗證
[0113] 進行SDS-PAGE檢測并進行蛋白雜交印記，驗證結(jié)果顯示獲得的抗原分子量在 23KD左右，與抗RBP多克隆抗體有反應，并且與h-MG多抗無反應。用Protein Pak Glass 300SW柱HPLC進行檢測，以leebio的RBP為標品。獲得純度大于98 %的RBP免疫原，其中， 本實施例所得RBP抗原與leebio的RBP的SDS-PAGE對比檢測結(jié)果如圖1所示，本實施例 所得RBP的高效液相色譜圖如圖5所示。
[0114] 實施例三羊抗人RBP多克隆抗體的制備
[0115] 1、山羊的免疫：選取波爾山羊進行皮下免疫（實施一制得的RBP抗原+弗氏佐劑） 注射。
[0116] 2、采集羊抗血清：采集羊抗血清，將抗血清進行免疫電泳，存在免疫球蛋白類及白 蛋白的雜帶，將采集的抗血清過偶聯(lián)正常人血清的CNBr-activated Sepharose 4B柱去除 免疫球蛋白類及白蛋白的雜帶，得到除雜后的羊抗血清。
[0117] 3、羊抗人RBP多克隆抗體的純化：用飽和度為50%硫酸銨溶液沉淀除雜后的羊抗 血清中的羊抗人腹水球蛋白，8000r/min，離心30min，取沉淀透析脫鹽，過DEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-S)離子交換柱（事先用緩沖液A平衡）純化，收集流出液，用20mM Tris-HCl pH8. O+lOOmM NaCl緩沖液洗脫。洗脫過程當出現(xiàn)洗脫峰開始收集，按照約柱長體 積的1/4進行分管收集，洗脫峰到達峰底時停止收集。收集液進行SDS-PAGE，根據(jù)SDS-PAGE 結(jié)果及抗體目的蛋白分子量，對含目的蛋白條帶且純度較高的管號進行合管。得到羊抗人 RBP多克隆抗體。
[0118] 實例四兔抗人RBP多克隆抗體的制備
[0119] 1、兔的免疫：選取波爾山羊進行皮下免疫（實施二制得的RBP抗原+弗氏佐劑） 注射。
[0120] 2、采集兔抗血清：采集兔抗血清，將抗血清進行免疫電泳，存在免疫球蛋白類及白 蛋白的雜帶，將采集的抗血清過偶聯(lián)正常人血清的CNBr-activated Sepharose 4B柱去除 免疫球蛋白類及白蛋白的雜帶，得到除雜后的兔抗血清。
[0121] 3、兔抗人RBP多克隆抗體的純化：用飽和度為50%硫酸銨溶液沉淀除雜后的兔抗 血清中的羊抗人腹水球蛋白，8000r/min，離心30min取沉淀透析脫鹽，過DEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-S)離子交換柱（事先用緩沖液A平衡）純化，收集流出液，用20mM Tris-HCl pH8. O+lOOmM NaCl緩沖液洗脫。洗脫過程當出現(xiàn)洗脫峰開始收集，按照約柱長體 積的1/4進行分管收集，洗脫峰到達峰底時停止收集。收集液進行SDS-PAGE，根據(jù)SDS-PAGE 結(jié)果及抗體目的蛋白分子量，對含目的蛋白條帶且純度較高的管號進行合管。得到兔抗人 RBP多克隆抗體。
[0122] 實例五抗血清（多克隆抗體）的免疫電泳、除雜
[0123] 一、免疫電泳
[0124] 1、制膠/打孔
[0125] 1. 1用微波爐或電爐加熱溶解配制好的瓊脂糖凝膠（1 %電泳級瓊脂糖（質(zhì)量體積 比），溶解液為0. 05M硼酸緩沖液（pH8. 6))。
[0126] 1. 2取玻璃板（或載玻片）平放在清潔的操作臺上，用移液管取瓊脂糖溶膠鋪滿整 個玻璃板，厚度約3mm，約15-18mL可鋪滿，待其凝固。
[0127] 1. 3凝固的瓊脂糖凝膠使用打孔開槽工具按照模板打孔和開槽
[0128] 2、加抗原樣品
[0129] 在孔內(nèi)加入已知抗原15uL(注：抗原濃度需根據(jù)抗體含量作相應的稀釋），再用小 吸頭吸取1?2μ 1溴酚藍指示劑至凝膠邊上的抗原孔旁邊。
[0130] 3、電泳
[0131] 3. 1加上電泳緩沖液（電泳的兩個槽勿加滿）
[0132] 3. 2把加好抗原的玻璃板移至電泳槽內(nèi)，用電動加樣把緩沖液加至玻璃面，液面勿 與膠面接觸。
[0133] 3. 3用薄濾紙蓋在凝膠上與緩沖液液面下，薄濾紙的長與玻璃板同等，寬約1. 5? 2cm。蓋上蓋子。
[0134] 3.4插上電源、電極，設定電壓約60V/板，注意電極的方向（電流"一"一" + "）。 電泳時間約1. 5?2. 0h，由于電泳時間長，電流大，凝膠會產(chǎn)生熱量，對于一些熱較敏感的 抗體，需在蓋上或是電泳槽邊加上冰。
[0135] 3. 5待溴酚藍提示劑跑至加樣槽底端時，即可斷電取出凝膠板，置37°C濕盒內(nèi)。
[0136] 4加待測抗體
[0137] 將待測樣品加至對應的槽內(nèi)，150 μ 1/槽。過夜或24小時后讀取結(jié)果。
[0138] 4. 3觀看結(jié)果
[0139] 在光線充足且黑色背景下觀看沉淀線，如有沉淀線說明有雜帶；無沉淀線則代表 無大分子量雜帶。
[0140] 二、親和柱除雜
[0141] 將正常人血清中主要含免疫球蛋白的組分、主要含白蛋白的組分、主要含除白蛋 白和免疫球蛋白外的其他組分，這三個組分分別偶聯(lián)至CNBr-activated Sepharose 4B(GE 產(chǎn)品），將包被以上所述的三個組分的CNBr-activated Sepharose 4B用緩沖液20mmol/L Tris pH = 8. 0+500mmol/LNaCl+0. 03% NaN3充分平衡后，抗血清或純化得到的多克隆抗體 過CNBr-activated Sepharose 4B柱進行除雜，收集流出液，即得目的蛋白液。將收集的目 的蛋白液進行免疫電泳驗證是否有雜帶。看到沉淀線則說明有雜帶，無沉淀線無大分子量 雜帶。如果看到沉淀線需繼續(xù)過CNBr-activatedSepharose 4B柱純化，直至無沉淀線。
[0142] 實施例六多克隆抗體的驗證
[0143] 一、檢測其蛋白濃度及Elisa檢測
[0144] 1、用UV (P360德國頂PLEN)檢測蛋白濃度；
[0145] 2、Elisa 檢測：
[0146] 2. 1、用進口 RBP抗原按50ng/孔置Costa板過夜包被；加入2 %脫脂奶粉置于微 量振蕩器上振動封閉一個小時后，1*PBS洗滌三次，每次間隔lmin。
[0147] 2. 2、將樣品（實施例三所得的羊抗人RBP多克隆抗體或者實施例四所得的兔抗人 RBP多克隆抗體）按1:10, 1:100稀釋后，取90ull*PBS至Costa板第一個孔，其余的孔分別 加入50ull撲BS，在第一個孔中加10ul已稀釋100倍的樣品液，混勻，接著從1:1000的稀釋 倍數(shù)開始稀釋樣品，即從第一個孔中取出50樣品液加至第二個孔，混勻，再從第二個孔中 取出取出50樣品液加至第三個孔，混勻，以此類推，直至按梯度對倍稀釋樣品至1:64000 ;
[0148] 2. 3、在室溫條件下放置于微量振蕩器上振動反應2h后，1*PBST洗滌三次，每次間 隔lmin ;然后再用1*PBST洗滌兩次，將板拍干；
[0149] 2. 4、加二抗（兔抗羊 IgG/HRP A89191:30000 或者羊抗兔 IgG/HRPl :30000)在室 溫條件下放置于微量振蕩器上振動反應lh后，1*PBST洗滌三次，每次間隔lmin ;然后再用 1*PBST洗滌兩次，將板拍干；
[0150] 2. 5、每孔加入A+B混合液100ul，置微量振蕩器上振動10s后，放入37°C恒溫箱 內(nèi)，20min后置于酶標儀（BioTek)上讀取0D值。并進行數(shù)值換算，結(jié)果如下述表1所示。
[0151] 表1:
[0152]
[0153]

【權利要求】
1. 從尿液中提取純化人視黃醇結(jié)合蛋白的工藝，包括以下步驟： 1) 從腎臟損傷患者的尿液中獲取尿蛋白液； 2) 所得的尿蛋白液過DEAE-Sepharose Fast Flow凝膠柱層析，用緩沖液B1平衡后再 用緩沖液B2洗脫，收集洗脫峰，對洗脫峰進行檢測，合并含RBP的部分，得到RBP組分1 ;其 中： 緩沖液 B1 :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8. 0+40 ?50mM NaCl+0. 01 ?0· 03 % NaN3+l ?2mM EDTA ; 緩沖液 B2 :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8· 0+250 ?350mM NaCl+0. 01 ?0· 03 % NaN3+l ?2mM EDTA ; 3) 將RBP組分1用硫酸銨鹽析，使其中硫酸銨的飽和度為55?65%，離心，收集蛋白 沉淀，所得蛋白沉淀用緩沖液C復溶，離心，取上清液經(jīng)Sephacryls-200分子篩凝膠層析， 用緩沖液C洗脫，收集洗脫峰，對洗脫峰進行檢測，合并純度大于等于80 %的部分，得到RBP 組分2 ;其中： 緩沖液 C :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8. 0+100 ?150mM NaCl+0. 01 ?0· 03 % NaN3+l ?2mM EDTA ; 4) 向RBP組分2中添加飽和硫酸銨溶液直至其中硫酸銨的飽和度為25?30%，然后 過Phenyl Sepharose? High Performance疏水柱，用流動相梯度洗脫，收集洗脫峰，對洗脫 峰進行檢測，合并純度大于等于90%的部分，得到RBP組分3 ;其中：所述的流動相由緩沖 液A和緩沖液D組成， 緩沖液 A :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8. 0+0· 01 ?0· 03% NaN3+l ?2mM EDTA ; 緩沖液 D :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8· 0+25 ?30% SAS+0. 01 ?0· 03% NaN3+l ? 3mM EDTA ； 5) 將RBP組分3用硫酸銨鹽析，使其中硫酸銨的飽和度為55?65%，離心，收集蛋白 沉淀，所得蛋白沉淀用緩沖液C復溶，離心，取上清液經(jīng)Superdex 75分子篩凝膠層析，用 緩沖液C洗脫，收集洗脫峰，對洗脫峰進行檢測，合并純度大于等于97 %的部分，得到RBP組 分4 ; 6) 取RBP組分4上偶聯(lián)a fMG多抗的CNBr-activated Sepharose 4B柱層析，收集流 出液，WB檢測，得到RBP抗原。
2. 根據(jù)權利要求1所述的工藝，其特征在于：步驟2)中，所述緩沖液B1和緩沖液B2的 組成為： 緩沖液 B1 :20mM Tris-HCl pH 8. 0+40 ?50mM NaCl+0. 02% NaN3+lmM EDTA ; 緩沖液 B2 :20mM Tris-HCl pH8. 0+300mM NaCl+0. 02% NaN3+lmM EDTA。
3. 根據(jù)權利要求1所述的工藝，其特征在于：步驟4)中，所述緩沖液A和緩沖液D的 組成為： 緩沖液 A :20mM Tris-HCl ρΗ8· 05+0. 02% NaN3+lmM EDTA ; 緩沖液 D :20mM Tris-HCl ρΗ8· 0+25 ?30% SAS+0. 02% NaN3+lmM EDTA。
4. 根據(jù)權利要求1所述的工藝，其特征在于：步驟4)中，過Phenyl Sepharose? High Performance疏水柱層析時，流動相的洗脫條件為： 在收集10倍柱體積洗脫液的時間內(nèi)：緩沖液D : 100 - 0%，緩沖液A :0 - 100%。
5. 根據(jù)權利要求1所述的工藝，其特征在于：所述緩沖液C的組成為： 緩沖液 C :20mM Tris-HCl pH 8. 0+120mM NaCl+O. 02% NaN3+lmM EDTA。
6. 抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體的制備工藝，包括以下步驟： I )選取合適的動物，以權利要求1制得的RBP抗原為免疫原對其進行皮下免疫注射， 直至動物的特異性抗血清滴度達標； Π )采集動物的抗血清，所得抗血清進行免疫電泳，如存在免疫球蛋白類及白蛋白雜 帶，將抗血清過偶聯(lián)正常人血清的CNBr-activated Sepharose 4B柱去除免疫球蛋白類及 白蛋白雜帶，收集流出液，得到除雜后的抗血清； III)用飽和度為40?60%的硫酸銨溶液沉淀除雜后的抗血清中的動物抗人腹水球蛋 白，離心，收集沉淀，沉淀透析脫鹽后過DEAE-Sepharose Fast Flow凝膠柱層析，用緩沖液E 洗脫，收集洗脫峰，對洗脫峰進行檢測，得到抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體；所述緩沖液 E的組成為： 緩沖液 E :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8. 5+90 ?110mM NaCl。
7. 根據(jù)權利要求6所述的工藝，其特征在于：步驟III)中，緩沖液E:20mM Tris-HCl pH8. O+lOOmM NaCl。
【文檔編號】C07K1/16GK104193817SQ201410452198
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月5日 優(yōu)先權日:2014年9月5日
【發(fā)明者】蔡豪斌, 李玨燕, 粟曉玲 申請人:桂林英美特生物技術有限公司