專利名稱：視黃醇結(jié)合蛋白單抗、其雜交瘤細胞及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領域，特別涉及一種視黃醇結(jié)合蛋白單克隆抗體、其雜交瘤 細胞及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
視黃醇結(jié)合蛋白(retinol-binding protein, RBP)為血中維生素A(VitA)的特 異轉(zhuǎn)運蛋白。RBP為低分子量蛋白，能自由濾過腎小球，近端腎小管幾乎完全重吸收，其在 血尿中變化與腎臟疾病密切相關。RBP以肝臟合成為主，血清、腦脊液、尿及其他體液為輔。 目前已發(fā)現(xiàn)七種不同的RBP亞型，主要分布于血液循環(huán)系統(tǒng)(RBP4，簡稱RBP)、細胞(RBP1， RBP2，RBP5, RBP6, RBP7，簡稱RBPs)和視網(wǎng)膜光感受器間(RBP3，簡稱IRBP)。RBP4 (NM_006744)為一種單一肽鏈蛋白質(zhì)，含有184個氨基酸殘基和3個二硫鍵， 有一個結(jié)合一分子全反式視黃醇的結(jié)合點。RBP4分子量為21000，沉降系數(shù)2. 13 2. 30， 等電點為PH 4. 4 4. 8，半衰期約為3 12小時，合成率為每天每公斤體重5mg。RBP4在 肝臟合成，受到全反式視黃醇刺激后分泌出來，釋放入血液后與視黃醇(retinol，R0H)、甲 狀腺素運載蛋白(transthretin，TTR)以1 1 1的比例形成三元復合物。分泌入血的 RBP4量受到視黃醇的嚴格調(diào)控。RBP受體在不同組織細胞的分布變化很大，其與RBP結(jié)合力 也不一致。在肝、脾、腸分布的受體有特殊的結(jié)合力，在視網(wǎng)膜色素上皮細胞、胎盤、腎臟、骨 髓其受體有高的結(jié)合力。不同組織RBP受體分布與VitA在不同組織的功能、代謝相一致。 RBP與ROH結(jié)合，將ROH從肝儲備區(qū)轉(zhuǎn)運至肝外的靶組織。RBP與TTR結(jié)合增加ROH-RBP的 穩(wěn)定性，并防止小分子的RBP從腎臟濾過。RBP-VitA依賴細胞的表面受體協(xié)助VitA的攝 入，當RBP-VitA結(jié)合到膜受體上后，RBP的構(gòu)象改變與TTR及膜受體親和力下降，促使視黃 醇從RBP結(jié)合位點釋放。血漿中的視黃醇結(jié)合蛋白4(Retinol-binding protein 4 ;RBP4)與甲狀腺素結(jié) 合前白蛋白(Thyroxine-binding prealbumin ；TBPA)結(jié)合形成復合物，并擔負維生素A運 載系統(tǒng)功能。RBP4最終由尿排出。同TBPA結(jié)合的RBP4其半壽期為12h，而游離的RBP4 半衰期僅3.5h。該復合物能穩(wěn)定特異地與ROH結(jié)合并進行細胞運轉(zhuǎn)。而RBP4僅僅是血漿 中ROH的攜帶者。多余的RBP4由腎小球濾過，再被近曲小管吸收(代謝降解)。腎小管 疾病導致腎小管蛋白重吸收功能下降時，尿液中RBP4含量就會上升，在病情進行的初期約 l-3mg/24h，嚴重時高于3mg/24h以上。(以正常人每天排尿量1. 5升計算，約為0. 67_2ug/ ml，為正常人的10倍以上)，故尿液中RBP4增高具有早期診斷意義，是一種評價腎臟疾病特 別是腎小管損傷疾病的良好指標。此外，肝膽系統(tǒng)疾病，如病毒性肝炎早期等、甲狀旁腺功 能亢進、營養(yǎng)不良均可引起血中RBP4降低，而慢性腎臟疾病時則升高。其檢測方法在臨床 運用中顯得尤為重要。目前檢測血尿中的RBP4方法較多，常用的有免疫濁度、免疫電泳、酶 聯(lián)免疫和放射免疫分析等，但是酶聯(lián)免疫具有高通量、可量化、精確度高、靈敏度高等優(yōu)點。Lucertini (Lucertini S, Valcavi P, Mutti A. ELISA of RBP in Serum and Urine[J], ClinChem,1984,30 149.)等建立 了酶聯(lián)免疫法(Enzyme-LinkedImmunosorbnent Assay,ELISA)檢測RBP4。ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或 抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或 抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本(測定其中的抗體或抗 原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復 合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結(jié)合在固相載 體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底 物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關，故可根據(jù)呈色的深 淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結(jié)果，使測定方 法達到很高的敏感度。
20世紀90年代，Wolff等偶然的發(fā)現(xiàn)了在小鼠肌肉中注射質(zhì)粒DNA后其在肌肉 組織中能進行表達之后，Williams和Tang等科學家進一步證實了給予加強劑量的質(zhì)粒后 可使免疫反應增強。以上的實驗結(jié)果表明直接給動物接種編碼抗原的基因可使該動物獲得 對該抗原的免疫力，一種嶄新的免疫接種技術(shù)應運而生，同時標志著DNA疫苗的誕生。所謂 DNA免疫，是通過基因重組技術(shù)，將編碼某種蛋白抗原的外源基因(DNA或是RNA)直接導入 動物體內(nèi)，通過宿主細胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導宿主細胞產(chǎn)生對該抗原蛋白的一 系列特異性免疫應答。目前研究使用得最多的是DNA或cDNA，所以又稱為DNA疫苗、核酸疫 苗或基因疫苗。DNA疫苗由病原抗原編碼基因及質(zhì)粒載體兩部分組成?？乖蚩梢允菃蝹€基因 或完整的一組基因，也可以是編碼抗原決定簇的一段核苷酸序列。DNA疫苗載體質(zhì)粒一般以 質(zhì)粒為基本骨架。DNA質(zhì)粒被導入宿主細胞后，病原體抗原的基因片段在宿主細胞內(nèi)得到表達并合 成抗原，再經(jīng)過加工、處理、修飾遞呈給免疫系統(tǒng)，激發(fā)免疫應答。這一過程類似于病原微生 物感染或減毒活疫苗接種，所以DNA疫苗能有效地激發(fā)體液免疫和細胞免疫，尤其是其具 有激活殺傷性T淋巴細胞的作用。DNA疫苗作為第3代疫苗，具有其自身的特點。DNA疫苗的優(yōu)點⑴易操作性和穩(wěn) 定性。不管其編碼序列如何，都可用相同的方法純化和處理，并且干燥的DNA質(zhì)粒在室溫下 相對穩(wěn)定。另外，DNA疫苗生產(chǎn)成本相對低廉，這就為DNA疫苗大規(guī)模使用提供了條件。(2) 免疫效果好。DNA疫苗在宿主細胞內(nèi)表達，其加工處理過程與病毒感染的自然過程相似，抗 原遞呈過程也相同，從而以自然的形式被加工后以天然構(gòu)象遞呈給宿主的免疫識別系統(tǒng)， 激發(fā)較強的免疫應答。(3)重組質(zhì)粒DNA在宿主體內(nèi)存在時間長持續(xù)刺激機體產(chǎn)生廣泛的 體液免疫應答和細胞免疫應答，產(chǎn)生持久免疫。(4)DNA疫苗可用于變異頻繁或血清型較多 的病原免疫預防DNA疫苗在對變異頻繁或血清型較多的病原免疫預防過程中，對于目前多 價活毒疫苗防治的疾病預防和治療有重要意義。(5)質(zhì)粒DNA無免疫原性，可以反復使用這 一特點對具有母源抗體的動物尤為重要。DNA疫苗具有傳統(tǒng)疫苗所沒有的優(yōu)越性，但是真正運用于人體還有許多問題有待 解決。載體DNA整合到宿主基因組內(nèi)，有導致不利轉(zhuǎn)化的可能。免疫效果有待提高。實驗 動物越大，基因免疫效果越差。 DNA疫苗開創(chuàng)了免疫學和疫苗學的新領域。越來越多的試驗研究發(fā)現(xiàn)，DNA疫苗在 免疫防御方面有良好的效果，但DNA疫苗還面臨著許多挑戰(zhàn)，比如DNA疫苗接種的免疫學機理，有關核酸疫苗在理論上的安全性問題等方面，還需要進一步的試驗加以闡明?，F(xiàn)在普遍 認為，DNA疫苗應先用在傳統(tǒng)方法無法對付的病原體和疾病上。在另一個方面，DNA疫苗的 優(yōu)勢是它的治療作用。相信隨著研究的深化，DNA疫苗將會逐一解決現(xiàn)有的問題，在更多的 領域中發(fā)揮作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種新的RBP4雜交瘤細胞系。 本發(fā)明的又一目的是提供RBP4單克隆抗體及其用途。本發(fā)明的第一方面，提供一種雜交瘤細胞系，所述雜交瘤細胞系的保藏號為CCTCC NO :-C200946。本發(fā)明的第二方面，提供一種抗RBP4單克隆抗體，所述單克隆抗體是由保藏號為 CCTCCNO :-C200946的雜交瘤細胞系產(chǎn)生。本發(fā)明的第三方面，提供一種上述單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟(a)擴增產(chǎn)生上述單克隆抗體的雜交瘤細胞株；(b)從擴增產(chǎn)物中回收抗RBP4單克隆抗體。本發(fā)明的第四方面，提供一種上述單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟(a)擴增保藏號為CCTCC NO :_C200946的雜交瘤細胞株；(b)腹腔注射動物；(c)回收腹水并從腹水中分離抗RBP4單克隆抗體。本發(fā)明的第五方面提供一種組合物，所述組合物包括上述單克隆抗體和藥學上可 接受的載體和/或賦形劑。本發(fā)明的第六方面，提供一種試劑盒，所述試劑盒含有上述單克隆抗體。本發(fā)明的第七方面，提供一種試劑盒，所述試劑盒包括上述單克隆抗體和保藏號 為CCTCCNO :-C200951的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的單克隆抗體。本發(fā)明的第八方面，提供一種試劑盒，所述試劑盒試劑盒包括上述單克隆抗體和 抗RBP4多克隆抗體。上述試劑盒還含有標記或顯色劑。上述標記選自；辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、β -D-半乳糖甘酶、葡萄糖氧化 酶、脲酶、過氧化氫酶或葡萄糖淀粉酶。上述標記為辣根過氧化物酶。本方面的第九方面，提供上述單克隆抗體在制備檢測RBP4蛋白的試劑盒中的應用。本領域技術(shù)人員可以根據(jù)上述標記的不同來選擇相應的顯色劑。如用于辣根過氧 化物酶的鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)；用于堿性磷酸酯酶的 對硝基苯磷酸酯(ρ-ΝΡΡ)等。上述試劑盒可以定性、半定量或定量檢測RBP4蛋白。HAT選擇性培養(yǎng)基主要成分為次黃嘌呤(hypoxanthine，H)、氨甲蝶呤 (aminopterin，Α)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，Τ)，簡稱HAT培養(yǎng)基。
本發(fā)明的雜交瘤細胞系RBP4-1(即SA-64-11)，RBP4-2 (即s-113-7)已分別于 2009年7月9日和2009年7月22日提交位于武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱 CCTCC)保藏，保藏號分別為 CCTCC-C200946 和 CCTCC-C200951。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于首次采用pBudCE4. 1-RBP4重組質(zhì)粒免疫小鼠，用該DNA疫苗的方法可獲得的抗 RBP4鼠單克隆抗體。本發(fā)明所制備的抗RBP4鼠單克隆抗體能靈敏的識別人體中天然的視黃醇結(jié)合蛋 白4。
使用GE Healthcare AKTA純化系統(tǒng)，從腎小管疾病病人尿液中提取了天然的視黃 醇結(jié)合蛋白4，從而確立了純化該蛋白的工藝流程。本發(fā)明所制備的抗RBP4鼠單克隆抗體中有兩株能配對，及識別天然視黃醇結(jié)合 蛋白4的不同位點，靈敏度高，從而可用于對相關疾病的診斷或檢測。本發(fā)明的其他方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1是pBudCE4. 1-RBP4重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞后Western Blotting檢測 RBP4-His融合蛋白結(jié)果圖；泳道1 :PBudCE4. 1-RBP4泳道2 :pBudCE4. 1圖2是腎小管損傷疾病病人尿液經(jīng)離子交換層析處理結(jié)果圖；圖3是腎小管損傷疾病病人尿液經(jīng)疏水層析處理結(jié)果圖；圖4是腎小管損傷疾病病人尿液經(jīng)分子篩處理結(jié)果圖；圖5是實施例3最終純化產(chǎn)物天然提純蛋白RBP4的SDS-PAGE電泳圖。泳道1是蛋白Marker ；泳道2_5是第一批腎小管損傷病人尿液樣品經(jīng)過離子交換 層析、疏水層析和分子篩后分管收集的蛋白樣品；泳道6-9是第二批腎小管損傷病人尿液 樣品經(jīng)過離子交換層析、疏水層析和分子篩后分管收集的蛋白樣品。圖6是實施例5中RBP定量檢測試劑盒標準曲線；圖7是用S-113-7對尿液中RBP4蛋白進行免疫印跡檢測的結(jié)果；1 純化的天然RBP蛋白(約25 μ g/ml)2 :P1病人尿液樣品3 :P2號病人尿液樣品4:1號正常人尿液樣品 5:2號正常人尿液樣品6 3號正常人尿液樣品 7 :P3號病人尿液樣品圖8是用SA-64-11對尿液中RBP4蛋白進行免疫印跡檢測的結(jié)果；1 純化的天然RBP蛋白(約25 μ g/ml)2:102號病人尿液樣品 3:37號病人尿液樣品4:41號病人尿液樣品 5:1號正常人尿液樣品6 2號正常人尿液樣品 7 3號正常人尿液樣品具體實施方式
本發(fā)明單克隆抗體的應用領域不受特別限制，如能用于免疫測定，包括定量或半 定量檢測。本發(fā)明的單克隆抗體可以檢測RBP4的表達異常，作為判斷慢性腎臟疾病或甲狀 旁腺功能亢進或營養(yǎng)不良等會導致RBP4表達水平升高或降低的疾病的依據(jù)。經(jīng)免疫產(chǎn)生本發(fā)明的雜交瘤的動物不受特別限制，包括例如小鼠、大鼠和大耳 兔。在其中優(yōu)選的是小鼠。本發(fā)明中所述RBP除非特別說明，否則和RBP4可以互換使用，均為視黃醇結(jié)合蛋白4。本發(fā)明的免疫測定法用至少一種本發(fā)明的單克隆抗體進行，方法可僅用一種抗體 進行，也可與RBP4多克隆抗體結(jié)合進行，或同時使用兩種以上單克隆抗體(如SA-64-11和 s-113-7)。作為本發(fā)明的免疫測定法，包括酶免疫測定(EIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、 放射免疫測定(RIA)、熒光免疫測定(FIA)、蛋白質(zhì)印跡、免疫層析等技術(shù)。上述各種免疫測 定法可用于以競爭法或夾心法，用標記物標記的抗原或抗體測定靶抗原或抗體。在上述各 種免疫測定法中，ELISA和免疫層析技術(shù)是優(yōu)選的。上述夾心法包括例如使RBP4夾在固定的一種本發(fā)明單克隆抗體(如RBP4-1)和 用標記劑標記的另一本發(fā)明單克隆抗體或抗RBP4多克隆抗體之間，然后加入針對標記物 (例如酶)的底物等，顯示顏色，從而檢測標本中的RBP4。通?？紤]靈敏度高超的單克隆抗 體作為優(yōu)選的標記抗體，因為與特異性低而背景噪聲高的多克隆抗體相比較，單克隆抗體 的特異性高而背景噪聲低，使檢測更為準確。而且本發(fā)明獲得的2株單克隆抗體可以識別 不同位點，特異性高，實驗結(jié)果穩(wěn)定可靠。上述競爭性方法基于例如測試標本中RBP4和已知量的標記的RBP4與本發(fā)明的 單克隆抗體定量競爭性結(jié)合反應。在上述特別提到的競爭性方法中，在含有RBP4的標本溶 液中加入預定量的固定在載體上的抗體和預定量的用標記劑標記的RBP4。然后，測定保留 在載體上的標記劑活性或未保留在載體上的標記劑活性。對此，優(yōu)選幾乎同時加入抗體和 標記抗原。對于上述標記劑，可使用放射性同位素或酶等，例如1251、酶、酶底物、磷光物質(zhì)、熒 光物質(zhì)、生物素和著色物質(zhì)。在將這些標記劑與抗原或抗體結(jié)合中，可使用馬來酰亞胺法 (J. Biochem. (1976)，79，233)，活化生物素法(J. Am. Chem. S0C. (1978)，100，3585)或疏水鍵法。對于上述提到的酶，包括例如過氧化物酶、堿性磷酸酶、β “半乳糖苷酶和葡萄 糖氧化酶。對于用于該場合的底物，可選擇適合該場合所用的酶的底物，包括例如ABTS、 TMB、魯米諾-H202、o-苯二胺一 H2O2 (針對過氧化物酶)、磷酸對硝基苯酯、磷酸甲基繳形酯、 3-(2’ 一螺環(huán)金剛烷)-4_甲氧基-4-(3’_磷酰氧基)苯基-1，，2-二氧雜環(huán)丁烷(針對堿 性磷酸酶)、對硝基苯基-BETA-D —半乳糖(針對β —半乳糖苷酶)?？稍?_40°C反應1分鐘-18小時，然后測定結(jié)果顯示的顏色或熒光、磷光或顯色 量，進行上述試驗。另外，可使用所謂的速率試驗，它在4-40°C范圍內(nèi)保溫進行。用市售的Bolton-Himter試劑可方便的進行對上述抗原或抗體的放射性標記。例 如，可通過將Bolton-Himter試劑加到溶液中(該溶劑是通過將抗原或抗體溶于0. IM碳酸 氫鈉水溶液中制備的)，然后經(jīng)過1-2小時，用G-25脫鹽柱等除去未反應的Bolton-Himter試劑部分。另外，可使用氯亞明T法、碘原法等，方便的進行125I放射性標記。上述熒光物質(zhì)，如熒光素和羅達明，可方便的使用活化酯法或異氰酸酯法(“酶免 疫測定技術(shù)”，Igaku Shoinl987年出版)進行標記。對于上述著色物質(zhì)，可使用著色乳膠 顆粒和膠體金。
本發(fā)明的免疫測定法使用本發(fā)明的單克隆抗體，因此具有杰出的特性，僅識別存 在于血液、組織或尿液中的RBP4，而不會由于交叉反應而錯誤檢測其他物質(zhì)和其他RBP，因 此可進行特異性非常高的測定。為了實施本發(fā)明的免疫測定法，可使用本發(fā)明的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒含有至 少一種本發(fā)明的單克隆抗體，并可只含一種單克隆抗體。在本發(fā)明的試劑盒中，本發(fā)明的單 克隆抗體可預先固定在固相上，本發(fā)明的單克隆抗體還可以用上述標記劑標記。本發(fā)明的試劑盒可用免疫學方法檢測含RBP4的標本，如血液，組織或尿液，因此 可以判斷RBP4的存在與否以及表達量的變化。用于本發(fā)明的試劑盒的固相不受特別限制，但包括例如聚合物，如聚苯乙烯、玻璃 珠、磁性顆粒、微量滴定板、免疫層析用濾紙、玻璃濾器或其他不溶性載體。本發(fā)明的試劑盒還可含有其他組件，如標記或顯色劑。上述標記或顯色劑可以是 標記用的酶、放射性同位素、磷光物質(zhì)、熒光物質(zhì)或著色物質(zhì)。本發(fā)明試劑盒的其他組件不 受特別限制，還可以包括洗滌液、終止液、增敏稀釋液等。本發(fā)明的試劑盒可以是用于實施上述競爭性方法或上述夾心法的試劑盒。然而優(yōu) 選的是使用夾心法的試劑盒。上述夾心法具有優(yōu)點，即靈敏度高，需要的反應時間短，準確 率高，操作方便。用上述免疫層析技術(shù)，可以制備一種試劑盒，它使得測試方法方便而簡單， 而且用它可以簡單的通過肉眼觀察判斷結(jié)果。當以ELISA技術(shù)并使用上述夾心法時，酶反 應產(chǎn)物的形成由試驗目標物質(zhì)的量決定，因此可建立一種系統(tǒng)，可方便的通過顯色等，以肉 眼觀察確定RBP4的存在與否，也可用儀器測試其OD值，進行定量和半定量的檢測。本發(fā)明試劑盒所用的標本不受特別限制，但包括例如血液、尿液或組織，優(yōu)選尿 液。本發(fā)明的診斷試劑盒使用單克隆抗體，具有高水平的檢測靈敏度，不產(chǎn)生假陰性 或假陽性問題，在批與批之間沒有任何差異。如標記的抗體優(yōu)選使用與固相載體上單抗不 同的單克隆抗體，則更便于控制產(chǎn)品質(zhì)量，和制定統(tǒng)一的標準。本發(fā)明RBP4多克隆抗體可通過常規(guī)的方法來制備，如用RBP4重組蛋白或天然蛋 白免疫動物獲得抗RBP4多克隆抗體。所述動物選自兔、羊、牛等，優(yōu)選采用兔來制備。在本 發(fā)明中可以按照專利200610117198. 7的方法制備該多克隆抗體，與本發(fā)明單克隆抗體配 對制備ELISA檢測試劑盒。RBP4檢測試劑盒檢測原理，用抗RBP4的單克隆抗體和抗RBP4的多克隆抗體或另 一抗RBP4單克隆抗體作為固相化抗體和酶標抗體，如果待測樣品中存在RBP4，則形成抗 體-抗原-酶標抗體復合物，加入底物，如四甲基聯(lián)苯胺(TMB)產(chǎn)生顯色反應，反之則無顯 色反應。雙抗體夾心ELISA法是一種非常靈敏的檢測技術(shù)，并且ELISA敏感性高、操作簡便， 配套儀器設備的發(fā)展使操作程序規(guī)范化和自動化，從而進一步提高了穩(wěn)定性。本發(fā)明提供特異產(chǎn)生抗RBP4單克隆抗體的雜交瘤細胞系，由這些細胞系可以產(chǎn)生抗人RBP4單克隆抗體，用該抗體可以制備試劑盒等。本發(fā)明的單克隆抗體可通過擴增本發(fā)明的雜交瘤細胞系來產(chǎn)生，如可以從體外培 養(yǎng)本發(fā)明的雜交瘤的培養(yǎng)液中獲得的。本發(fā)明的雜交瘤產(chǎn)生識別RBP4的單克隆抗體，并可 通過經(jīng)RBP4蛋白免疫的動物的脾細胞或淋巴結(jié)細胞與骨髓瘤細胞融合獲得。本發(fā)明的雜交瘤可以用本領域已知的細胞融合技術(shù)產(chǎn)生。因此，用RBP4重組質(zhì)粒免疫除了人以外的動物，將該動物的脾細胞或淋巴結(jié)細胞 與骨髓瘤細胞融合，產(chǎn)生雜交瘤，從其中選出產(chǎn)生識別RBP4的單克隆抗體的雜交瘤，從而 獲得了本發(fā)明的雜交瘤。本發(fā)明提供一種新的雜交瘤細胞的制備方法，包括如下步驟 (a)采用含有目的蛋白的多核苷酸的重組表達載體免疫動物；(b)將該動物的脾細胞或淋巴結(jié)細胞與骨髓瘤細胞融合；(c)篩選獲得產(chǎn)生目的蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞系。所述目的蛋白可以是任意蛋白，包括但不限于人RBP4蛋白。本發(fā)明RBP4雜交瘤細胞系的制備方法，包括步驟(a)采用含有RBP4蛋白的多核苷酸的重組表達載體免疫動物；(b)將該動物的脾細胞或淋巴結(jié)細胞與骨髓瘤細胞融合；(c)篩選獲得RBP4雜交瘤細胞系。上述RBP4雜交瘤細胞的制備方法，包括步驟(a)將含有人RBP4蛋白的多核苷酸的重組表達載體與佐劑按照質(zhì)量比3 1到 11的比例混合后免疫小鼠；(b)對該小鼠使用天然人RBP4蛋白做回憶刺激后3天，將該小鼠的脾細胞與骨髓 瘤細胞融合；(C)篩選獲得RBP4雜交瘤細胞系。
上述重組表達載體優(yōu)選pBudCE4. 1。上述動物優(yōu)選小鼠、山羊、大鼠等。優(yōu)選的，步驟(a)重復2-3次。上述RBP4重組表達載體與佐劑混合后進行動物免疫。上述RBP4重組質(zhì)粒與佐劑 的質(zhì)量比為3 1到1 1;優(yōu)選質(zhì)量比為3 1到2 1。優(yōu)選將上述混合物以肌肉注射 方式注射到動物肌肉處。在具體實施例中，肌肉注射后采用在注射部位做電穿孔。上述佐劑選自弗氏佐劑或佐劑CpG。優(yōu)選佐劑為全硫代的CpG ODN 1826。較佳的，在實施步驟(b)前進行回憶刺激。具體的，在融合前3天取純化的天然 RBP4蛋白進行皮下多點注射，作為回憶刺激。在具體實施例中，取免疫后小鼠的脾臟細胞和鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合。融合采 用聚乙二醇(PEG)常規(guī)融合法。步驟(c)中加HAT選擇性培養(yǎng)基，篩選采用ELISA法，所用篩選用抗原為純化好的 天然的RBP4蛋白。本發(fā)明的雜交瘤細胞系RBP4-1(即SA-64-11)已于2009年7月9日提交位于武 漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)保藏，保藏號分別為CCTCC-C200946。本發(fā)明 的雜交瘤細胞系RBP4-2(即s-113-7)已于2009年7月22日提交位于武漢的中國典型培 養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)保藏，保藏號分別為CCTCC-C200951。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明中未特別說明的試劑、儀器等為市售的常規(guī)產(chǎn)品。下 列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook、Russell等人，分 子克隆實驗室手冊 III (New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述 的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例IDNA疫苗的構(gòu)建以之前構(gòu)建好的pET28a-RBP4 (詳見專利200610117198. 7)的重組質(zhì)粒為 模板，以兩端添加Kpn I和Xho I酶切位點的引物正向引物RBP-Sp(SEQ ID NO 1) CGGGGTACCATGATGAAGTGGGTGTGGGCGCT 和反向引物 RBP-AS (SEQ ID NO 2) :CCGCTCGAGTCGCT ACAAAAGGTTTCTTTCTGATC，PCR擴增獲得視黃醇結(jié)合蛋白4的編碼序列，將獲得的視黃醇結(jié) 合蛋白4的編碼序列定向連接到pBudCE4. 1載體(Invitrogen公司)的Kpn I和Xho I位 點中，獲得pBudCE4. 1-RBP 4重組質(zhì)粒，此重組質(zhì)粒即為DNA疫苗?？寺〕龅幕蚪?jīng)測序(上 海英俊生物技術(shù)公司)驗證不含有義突變。實施例2pBudCE4. 1-RBP4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，RBP4_His融合蛋白檢測將構(gòu)建好的pBudCE4. 1-RBP4 重組質(zhì)粒通過 Iipofectamine 2000 (Invitrogen)瞬 時轉(zhuǎn)染入293T細胞中，Western Blotting檢測RBP4_His融合蛋白的表達(結(jié)果見圖1)。一抗anti-his tag(l 2000)(天根)二抗goat-anti-mouse HRP (1 1000)(中科英沐)圖1顯示，泳道1有RBP4_His融合蛋白的表達。實施例3天然視黃醇結(jié)合蛋白4的提取視黃醇結(jié)合蛋白4在腎小管損傷疾病病人的尿液中含量較之正常人尿樣中含量高 出10倍以上。故從腎小管損傷疾病病人的尿液中可以提取天然視黃醇結(jié)合蛋白4。純化采用 親和層析的方法，使用的是 Healthcare AKTA純化系統(tǒng)，采用的純化柱也是購自CiE公司。3.1尿樣的預處理由于尿液成分比較復雜，過層析柱前需用0. 45 μ m濾膜進行過濾。過濾后，對尿液 樣品進行鹽濃度測定，然后將樣品中的鹽濃度調(diào)整到5%左右。3. 2離子交換層析3. 2.1平衡離子交換柱采用的是Q-FF填料，裝柱量20ml，將A管道進樣端放入buffer A (1. 409g NaH2PO4 · 2Η20，4· 372g Na2HPO4 · 7H20 溶于 IL H2O, ρΗ8· 0)中，選擇 A 泵，設置最大耐壓為 0. 3MPa,流速為5ml/min，運行平衡柱子，當cond、UV、pH等穩(wěn)定后，設置UV吸收值anto zero。3. 2. 2上樣及沖洗將A管道進樣端放入樣品中，選擇A泵，設置流速為5ml/min，進行上樣。當UV吸 收值逐漸上升，在大于0. 05AU時，開始收集穿透。上樣完后，暫停，將A管道進樣端取出用 蒸餾水沖洗，放入buffer A中。用buffer A沖洗柱子，洗掉結(jié)合不緊密的雜質(zhì)，流速5ml/ min，運行至COnd、UV、pH等值降下來時停止收集穿透，當cond、UV、pH穩(wěn)定后，停止運行，開 始準備洗脫蛋白。3.2.3目的蛋白的洗脫
將A管道進樣端放入buffer A中，B管道進樣端放入buffer B中，設置洗脫梯度 為0-8% buffer B，80ml達到，流速為5ml/min。運行至UV吸收值上升至0. 05時，馬上 開始用IOml的EP管收集洗脫。當達到8%，cond開始穩(wěn)定后，馬上設置為100% buffer Β(1· 409g NaH2PO4 · 2Η20，4· 372g Na2HPO4 · 7Η20，溶于 IL H2O, ImM Nac 1)，ρΗ8· 0,0ml 達到 (參見圖2)。當洗脫的顏色很濃，呈深黃色時當停止收集，直接將出樣管放入廢液燒杯中。3. 2. 4柱子的清洗首先用100% buffer B進行清洗，穩(wěn)定后，用0. 5M的NaOH溶液進行清洗，再次穩(wěn) 定后用100% buffer B進行沖洗，穩(wěn)定后最后用buffer A平衡。平衡好后，用20%的乙醇 沖洗，待cond值降至0. 005以下時將柱子取下，上下接口用配套的螺絲帽擰死，保存于4°C 冰箱中。用20%的乙醇清洗機器。3. 3疏水層析 3. 3.1平衡疏水柱根據(jù)RBP蛋白的特性，選擇了 Butyle-FF Iml層析柱。將A管道進樣端放入HIC bufferA中，B管道進樣端放入HIC buffer B中，設置最大耐壓0. 3MPa，用HIC buffer A清 洗平衡疏水層析柱，流速為lml/min。當c0nd、UV、pH等穩(wěn)定后，設置UV吸收值auto zero。3. 3. 2 上樣將A管道進樣端放入樣品中，開始lml/min流速上樣，收集穿透峰，當UV吸收值>
0.05時，用IOml的EP管收集。當樣品上完后，將A管道進樣端放入HICbuffer A中，用 HIC bufferA沖洗柱子；當UV吸收值< 0. 1時，停止收集穿透，繼續(xù)運行至各項值穩(wěn)定。3.3.3目的蛋白的洗脫設置用100% HIC buffer B洗脫，為了使洗脫體積盡量的小(方便下一步分子篩 上樣)，先將柱子上面的毛細管卸下來，流速lml/min通100% HIC buffer B約l_2min，將 毛細管中的HIC buffer A排出。然后改流速為lml/min，進行洗脫，并馬上用5ml的EP管 盛接。當UV吸收值<0.1時，停止盛接，并對所接樣品進行標記(參見圖3)。3. 3. 4柱子的清洗設置改用0. 5M NaOH溶液進行清洗柱子，平穩(wěn)后改用HIC buffer B洗柱，平穩(wěn)后 改用100% HIC buffer A平衡柱子。平衡好后，用20%的乙醇沖洗，待cond值降至0. 005 以下時將柱子取下，上下接口用配套的螺絲帽擰死，保存于4°C冰箱中。用20%的乙醇清洗 機器。3. 4分子篩3. 4.1平衡分子篩柱使用的柱子是24ml supperdex-75 (GE Healthcare預裝柱)。設置最大耐壓為
1.8MPa，然后用流速為lml/min pH 8. 020mM Tris-Cl進行清洗柱子。當cond、UV、pH等穩(wěn) 定后，設置UV吸收值auto zero.,3. 4. 2 上樣采取從上樣環(huán)上樣。用注射器吸取樣品，暫停機器(pause)，設置成load狀態(tài)下注 射入1ml，再設置成inject，然后繼續(xù)(continue)。3.4.3目的蛋白的洗脫當UV吸收值大于0. 05時馬上用1. 5ml的EP管收集樣品，當UV吸收值低于0. 1時停止收集，并對EP管進行標記。繼續(xù)用Tris-Cl洗柱子，當出現(xiàn)鹽峰后并恢復平穩(wěn)，進行 第二次上樣，以此循環(huán)至樣品上完(參見圖4)。2. 3. 4. 4柱子的清洗當把洗脫全部收集完后，繼續(xù)用Tris-Cl洗柱子，平衡好后，將柱子取下，上下接 口用配套的螺絲帽擰死，保存于4°C冰箱中。用20%的乙醇清洗機器。2. 3. 5最終純化產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖檢測圖中箭頭所指的便是目的蛋白RBP4。從上圖(圖5)可以看到只有4、5、8、9樣品 中含有目的蛋白RBP4，而且很純。將純凈的樣品收集起來，封口，放入-20攝氏度冰箱中冷 凍保存。 泳道1是蛋白Marker ；泳道2_5是第一批腎小管損傷病人尿液樣品經(jīng)過離子交換 層析、疏水層析和分子篩后分管收集的蛋白樣品；泳道6-9是第二批腎小管損傷病人尿液 樣品經(jīng)過離子交換層析、疏水層析和分子篩后分管收集的蛋白樣品。實施例4抗視黃醇結(jié)合蛋白4單克隆抗體的制備4.1動物的免疫選取4-6周Balb/c雌性小鼠，每組4只，使用構(gòu)建好的DNA疫苗進行Balb/c小鼠 的免疫。免疫的劑量每只小鼠50 μ g pBudCE4. 1-RBP4重組質(zhì)粒和20 μ g佐劑CpG ODN 1826 (上海生工合成)的混合物，免疫的方式用肌肉注射后用ECM830電轉(zhuǎn)儀電穿孔(美 國BTX公司產(chǎn)品)，電穿孔的目的是讓DNA疫苗更好的被注射部位的肌肉細胞甚至抗原呈遞 細胞吸收。免疫程序1，3，6周三次免疫，4-5，7周眼眶取血進行ELISA檢測。融合前3天 取0. Img純化好的天然RBP蛋白進行皮下多點注射，作為回憶刺激。4. 2雜交瘤細胞株的構(gòu)建及單克隆抗體的制備回憶刺激后三天融合。取免疫后小鼠的脾臟細胞和鼠骨髓瘤細胞SP2/0采用聚乙 二醇(PEG)常規(guī)融合法做融合。融合后加HAT選擇性培養(yǎng)基，篩選采用ELISA法，所用篩選用抗原為純化好的天然 的RBP4蛋白。經(jīng)過三次有限稀釋法克隆化篩選得到3株雜交瘤細胞株，效價見表1 :
~CloneIg subclass~~Ab titer (0D450士SD)*
S-17-4IgGl, κ1.090 + 0.002
SA-64-11 IgG2a, κ1. 159 + 0.041
S-113-7 IgG2a, κ1. 520 + 0.033表13株雜交瘤細胞株的抗體效價及亞型鑒定*此效價是指在培養(yǎng)雜交瘤細胞時上清中的抗體的效價實施例5單克隆抗體的鑒定和分析5.1抗體的配對實驗
(1)包被S-113-7單抗將腹水用的BSA (用Ix PBS配制)稀釋成2 μ g/ml濃 度，ΙΟΟμΙ/孔，共5孔，第5孔不加抗原作為陰性對照。4°C靜置過夜。用洗滌液(IX PBS, 按lml/L比例加入吐溫)洗滌3遍。 (2)封閉0. 3ml/孔5%的BSA(PBS配制)37°C靜置3h。用洗滌液洗滌3遍。(3)加入抗原將純化好的天然RBP蛋白用的BSA(用PBS配制)稀釋成Sng/ ml、4ng/ml、2ng/ml、lng/ml各100 μ 1，按序加入孔中，第5孔不加，37 °C靜置2h。用洗滌液 洗滌5遍。(4)加入檢測單抗(二抗)將標記了 HRP (辣根過氧化物酶)的SA-64-11抗體進 行10000倍的比例稀釋，100 μ 1/孔加入，37°C靜置2h。用洗滌液洗滌5遍。(5)加入底物顯色將TMB A、B液等體積混合(各250 μ 1，現(xiàn)配現(xiàn)用)，按100 μ 1/ 孔加入，37°C靜置15min。(6)終止顯色將2M H2SO4按50 μ 1/孔加入。(7)測量及結(jié)果用酶標儀在450nm波長下測量OD值從圖6中我們可以看到，這兩株單克隆抗體識別RBP4的不同位點，可以很好的配 對，檢測靈敏度高(l-8ng/ml呈線性變化)，可以用于制備RBP4檢測試劑盒。實施例6尿液中RBP4蛋白的免疫印跡檢測正常人尿液共3例Ni，N2, N3 ；腎小管疾病病人尿液共3例Pl，P2，P3。陽性對照 是純化好的天然視黃醇蛋白；陰性對照是BSA。免疫印跡實驗在本實驗中，所使用的抗體是抗RBP4鼠單克隆抗體實驗流程如下(I)SDS-PAGE 樣品陽性對照純化好的天然視黃醇蛋白；腎小管疾病病人尿液Pl，P2，P3(來源 于上海第六人民醫(yī)院腎臟科)；正常人尿液N1，N2，N3上樣量5μ1上層膠4%，下層膠12%，上層膠100V 30分鐘，下層膠150V 1小時。⑵轉(zhuǎn)膜電流200mA，90 分鐘。(3)封閉3 %脫脂奶粉封閉2小時。(4)雜交一抗克隆號S-113-7和SA-64-11兩株抗體均以1 2000稀釋在相應的封閉液 中，4°C雜交過夜。二抗羊抗兔HRP(上海中科英沐生物科技有限公司)，1 1000稀釋，雜交1小 時。(5)顯色實驗結(jié)果見圖7(克隆號S-113-7單克隆抗體實驗結(jié)果圖)和圖8(克隆號 SA-64-11單克隆抗體實驗結(jié)果圖)。結(jié)果表明，本發(fā)明人所制備的抗RBP4鼠單克隆抗體能 夠有效的識別腎小管疾病病人尿液中的RBP4，而對正常人尿液中的痕量RBP4沒有反應(免疫印跡法一般僅能檢測Ing以上的目的蛋白，而試驗時每個泳道本發(fā)明人僅加了 5μ 1尿 液，按照正常人尿液的RBP4水平，其中所含的RBP4不足Ing)。3.結(jié)論目前常規(guī)制備抗體使用的免疫抗原為原核蛋白表達系統(tǒng)制備的重組蛋白和人工 合成的多肽。原核蛋白表達系統(tǒng)具備外源基因的高通量表達、易于擴大再生產(chǎn)、低成本等的 優(yōu)點，但是，目前現(xiàn)有技術(shù)中根據(jù)原核表達系統(tǒng)制備的重組蛋白常常存在與天然蛋白不同 的一些特點，造成使用其制備的抗體難以檢測出天然蛋白，或者檢測效果不理想，無法達到 臨床的靈敏性要求。而抗原表位的預測的不確定性也使人工合成的多肽制備抗體存 在一定 的問題。另一方面，使用純化的天然蛋白免疫動物得到的抗體雖然應用價值高，但是提取 天然蛋白比較困難。天然蛋白本身可能具有毒性，對免疫的動物存在危害；天然蛋白含量較 低，提取一定純度的天然蛋白技術(shù)要求高；動物免疫需要一定量的蛋白，提取到指定量的天 然蛋白可能需要大量的組織樣品，部分病人組織樣品是少量的，不適宜從中提取天然蛋白 作為免疫抗原。RBP4天然蛋白具有一定的毒性，大量注射Balb/c小鼠可能會造成死亡，難于得到 脾細胞，對于制備雜交瘤細胞株帶來了一定的困難。鑒于DNA疫苗作為第3代疫苗，具有其 自身的多個特點。DNA疫苗在哺乳動物體內(nèi)表達，保持了蛋白抗原的空間構(gòu)想，強于原核表 達抗原，類似于天然抗原且DNA疫苗在動物體內(nèi)持久微量表達，不斷刺激免疫系統(tǒng)，故毒性 相對降低。因此我們采用DNA疫苗免疫的方法來制備抗視黃醇結(jié)合蛋白4雜交瘤細胞株。 我們構(gòu)建了 pBudCE4. 1-RBP4重組質(zhì)粒，將此構(gòu)建好的DNA疫苗免疫小鼠，制備抗RBP4鼠單 克隆抗體。腎小管疾病導致腎小管蛋白重吸收功能下降時，尿液中RBP4含量就會上升，在病 情進行的初期約l_3mg/24h，嚴重時高于3mg/24h以上。(以正常人每天排尿量1. 5升計算， 約為0.67-2ug/ml，為正常人的10倍以上)。鑒于此，我們使用GE Healthcare AKTA純化 系統(tǒng)，確立了從腎小管疾病病人尿液中提取天然RBP4蛋白工藝方法。且在有限稀釋法克隆 化篩選時使用純化好的天然提取的視黃醇結(jié)合蛋白4，有利于篩選到特異性針對天然視黃 醇結(jié)合蛋白4的雜交瘤細胞株。通過上述方法獲得了 3株雜交瘤細胞株，通過ELISA試驗驗證了其中2株雜交瘤 細胞株產(chǎn)生的抗RBP4鼠單克隆抗體能夠配對，且針對天然視黃醇結(jié)合蛋白4的不同位點。 將這兩株雜交瘤細胞株產(chǎn)生的抗體進一步免疫印跡實驗驗證其能靈敏的識別人體中天然 的視黃醇結(jié)合蛋白4，從而可以用于對相關疾病的診斷或檢測。實施例7RBP4蛋白的ELISA試劑盒1.已包被SA-64-11單克隆抗體的固相載體(本實施例中使用96孔酶標板)；2. HRP 酶標記的 S-113-7 抗體；3.天然RBP4蛋白作為陽性對照品；4.含10%小牛血清的PBS為稀釋液；5. IX PBST(1X PBS，按lml/L比例加入吐溫)為洗滌液；6. 2M H2SO4為酶反應終止液；7. TMB為底物(分A、B液)；附產(chǎn)品使用說明書一份。
實施例8RBP4的ELISA試劑盒1.已包被SA-64-11的固相載體(本實施例中使用48孔酶標板)；
2. HRP標記的RBP4蛋白多克隆抗體；3.重組RBP4蛋白為陽性對照品；4.含10%小牛血清的PBS為稀釋液；5. IX PBST洗滌液(同實施例7)；6. 2M H2SO4為酶反應終止液7. TMB為底物(分A、B液)；附產(chǎn)品使用說明書一份。以上試劑盒陰性對照均采取不加RBP4蛋白的方式。本領域技術(shù)人員也可以根據(jù) 需要在試劑盒中增加其他輔助試劑，或采用堿性磷酸酯酶標記上述抗體，并選用相應的顯 色劑等。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>上海中科英沐生物科技有限公司<120>視黃醇結(jié)合蛋白單抗、其雜交瘤細胞及其制備方法和用途<130)090725<160>2<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>1cggggtacca tgatgaagtg ggtgtgggcg ct32<210>2<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>2ccgctcgagt cgctacaaaa ggtttctttc tgatc3權(quán)利要求
一種雜交瘤細胞系，其特征在于，所述雜交瘤細胞系的保藏號為CCTCC NO C200946。
2.一種抗RBP4單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體是由保藏號為CCTCC NO :-C200946的雜交瘤細胞系產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求2所述單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(a)擴增產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤細胞株；(b)從擴增產(chǎn)物中回收抗RBP4單克隆抗體。
4.權(quán)利要求2所述單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(a)擴增保藏號為CCTCCNO :-C200946的雜交瘤細胞株；(b)腹腔注射動物；(c)回收腹水并從腹水中分離抗RBP4單克隆抗體。
5.一種組合物，其特征在于，所述組合物包括權(quán)利要求2所述的單克隆抗體和藥學上 可接受的載體和/或賦形劑。
6.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權(quán)利要求2所述的單克隆抗體。
7.權(quán)利要求6所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求2所述的單克隆抗體 和保藏號為CCTCC NO :-C200951的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的單克隆抗體。
8.權(quán)利要求6所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求2所述的單克隆抗體 和抗RBP4多克隆抗體。
9.權(quán)利要求7所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還含有標記或顯色劑。
10.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備檢測RBP4蛋白的定性或定量的試劑盒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的RBP4單克隆抗體。本發(fā)明還公開了產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤細胞系。本發(fā)明還公開了制備所述單克隆抗體的方法和該單克隆抗體的應用。本發(fā)明的單克隆抗體能夠高特異性地結(jié)合RBP4抗原，具有很高的親和力。
文檔編號C12N5/16GK101967465SQ200910055428
公開日2011年2月9日 申請日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者凌志洋, 史群芳, 吳洪強, 唐琳娜, 孫兵, 朱靜嬿, 李炳南 申請人:上海中科英沐生物科技有限公司