神經系統(tǒng)遺傳性疾病基因聯(lián)合篩查方法、試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種神經系統(tǒng)遺傳性疾病基因聯(lián)合篩查方法、試劑盒及其制備方法。本發(fā)明的基因篩查方法首先是構建受檢者的全基因組DNA文庫，然后利用制備的神經系統(tǒng)遺傳疾病基因篩查試劑盒捕獲靶基因序列，再通過高通量測序平臺(Illumina HiSeq 3000)的雙端150bp測序模式對樣本進行檢測，生物信息學分析數(shù)據(jù)結果，找出與神經系統(tǒng)遺傳疾病相關基因的突變信息位點，以達到基因診斷的目的。本發(fā)明提供的方法能快速、準確且能夠覆蓋目前已知的所有神經系統(tǒng)遺傳疾病基因的外顯子區(qū)域。
【專利說明】
神經系統(tǒng)遺傳性疾病基因聯(lián)合篩查方法、試劑盒及其制備 方法
技術領域
[0001 ]本發(fā)明設及基因篩查技術領域，更具體地，設及一種篩查各類神經系統(tǒng)遺傳性疾 病的試劑盒及其制備和使用方法。
【背景技術】
[0002] 神經系統(tǒng)遺傳疾病是由于生殖細胞或受精卵遺傳物質的異常，使發(fā)育的個體出現(xiàn) W神經系統(tǒng)功能缺損為主要臨床表現(xiàn)的疾病。神經系統(tǒng)遺傳性疾病的病種最多，在人類 5000余種單基因病中，累及神經系統(tǒng)的約占60%。遺傳方式包含單基因遺傳、多基因遺傳、 線粒體病W及染色體病，中國的神經系統(tǒng)單基因遺傳病患病率約為109.3/100，000。神經系 統(tǒng)遺傳病可在任何年齡發(fā)病，但絕大多數(shù)在小兒或青少年期出現(xiàn)臨床癥狀與體征，具有家 族性和終生性特點，不少疾病的病因和發(fā)病機制尚未闡明，致殘、致崎及致愚率很高，治療 困難，危害極大。很多神經系統(tǒng)遺傳病具有顯著的臨床和遺傳異質性，一種疾病可W由不同 的致病基因引起，而一個基因的突變又可累及不同的系統(tǒng)。因此，常有不能判斷引起疾病的 具體的基因突變，或疾病本身癥狀不典型，導致鑒別診斷的困難。W往對神經系統(tǒng)遺傳疾病 的診斷主要依靠病史、癥狀體征、家系調查或常規(guī)輔助檢查等方法，但運些常規(guī)診斷方法難 W對遺傳疾病做出早診斷或癥狀前診斷，從而導致錯過預防或早期治療的最佳時期，對身 體造成不可逆的損傷。
[0003] 基因檢測是神經系統(tǒng)遺傳病早期診斷的有效手段。然而，目前仍然沒有一種能同 時篩查多種神經系統(tǒng)遺傳性疾病的試劑盒。歸結原因有二:其一，致病基因多，序列長，目前 被定位或克隆的神經遺傳性疾病相關致病基因約235個;其二，傳統(tǒng)測序方法效率低，成本 高。傳統(tǒng)的Sanger測序每小時只能檢測6千個堿基序列，對于很多具有遺傳和臨床異質性的 疾病，該方法無法高效富集基因組片段進行大規(guī)模測序。理論上一次性篩查多種疾病可能 需要數(shù)月之久，且耗費極高，不適合于臨床推廣。
[0004] 近幾年，隨著第二代測序平臺（Next-Generation Sequencing,NGS)的誕生和發(fā) 展，可在10個小時內檢測4-6億個堿基序列。不僅極大地減少了測序時間，同時也極大地降 低了成本?？朔?Sanger測序在應用范圍和應用成本上的不足，基于NGS的祀向基因測序 (target gene sequencing,TGS)、全基因外顯子組測序(whole exome sequencing,肥S)和 全基因組測序(whole genome sequencing,WGS)，在神經系統(tǒng)單基因遺傳病的基因診斷中 已有應用。
[0005] 因此，設計一種設及最多種類神經系統(tǒng)遺傳性疾病、包含最全面的致病基因的檢 測試劑盒，并且能結合第二代測序技術，高效低成本地篩查遺傳性神經系統(tǒng)疾病，實現(xiàn)對患 者、致病基因攜帶者及高危產兒等對象的早期篩查，可在基因表達水平上確診和預測疾病， 對早期治療、干預措施提供指導意見。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種能高效、準確地聯(lián)合篩查多種神經系統(tǒng)遺傳性疾病的 試劑盒及其制備方法。另一方面還提供一種廣譜的神經系統(tǒng)遺傳性疾病的基因聯(lián)合篩查方 法。
[0007] 本發(fā)明一方面，提供一種神經系統(tǒng)遺傳性疾病基因聯(lián)合篩查試劑盒，所述試劑盒 包含與929種各類神經系統(tǒng)遺傳性疾病相關的854個致病基因或疾病易感基因中全部外顯 子序列的特異性寡核巧酸捕獲探針。
[000引進一步地，所述探針長度為50~10化P。
[0009] 進一步地，所述探針W生物素標記。
[0010] 具體地，所述與神經系統(tǒng)遺傳性疾病相關的致病基因或疾病易感基因如表1所示：
[0011] 表1:神經系統(tǒng)遺傳性疾病基因篩查列表
[0012]






[0019] 本發(fā)明另一方面，提供一種制備上述神經系統(tǒng)遺傳性疾病基因聯(lián)合篩查試劑盒的 方法，包含如下步驟：
[0020] (1)根據(jù)人類基因組HG19序列，調取表1中全部與神經系統(tǒng)遺傳性疾病發(fā)生相關基 因的外顯子序列；
[0021] (2)針對全部外顯子序列非重復區(qū)域設計50~10化P長度的捕獲探針，每個探針沿 著基因位置挪動3~lObp，目標區(qū)域每個堿基被探針覆蓋3~20次。
[0022] (3)合成步驟(2)所設計的捕獲探針，并W生物素標記。
[0023] 本發(fā)明的再一方面，提供一種神經系統(tǒng)遺傳性疾病基因聯(lián)合篩查方法，包括W下 步驟：
[0024] (1)獲取、檢測受檢者的全基因組DNA(曲NA)樣本；
[00巧](2)構建受檢者全基因組文庫；
[0026] (3)采用上述試劑盒中的捕獲探針與受檢者DNA文庫混合，目標區(qū)域基因片段與探 針雜交，探針通過標記的生物素與帶有親和素的磁珠結合；
[0027] (4)將未結合的非目標區(qū)域的DNA片段洗脫；
[0028] (5)利用新一代高通量測序儀對目標區(qū)域基因組進行測序、分析，獲取疾病相關基 因的所有突變信息。
[00巧]進一步地，所述高通量測序儀為111皿ina化Seq 3000型。
[0030] 進一步地，步驟(5)中所述分析過程包括W下步驟：
[0031] (1)從高通量測序儀(111皿ina化Seq 3000)獲取原始數(shù)據(jù)；
[0032] (2)利用化im Galore軟件對測序數(shù)據(jù)從3'端動態(tài)去除接頭序列片段和低質量片 段；
[0033] (3)用化stQC軟件對預處理數(shù)據(jù)進行質量控制分析；
[0034] (4)通過BWA軟件把有效測序數(shù)據(jù)比對到人類參考基因組中；
[0035] (5)統(tǒng)計祀標區(qū)域信息，包括祀標區(qū)域平均覆蓋度、插入片段平均分布圖、目標區(qū) 域測序深度等；
[0036] (6)采用GATK3.1.1進行變異檢測，SNP和Indel變異識別、校正、過濾；
[0037] (7)用ANN0VAR對變異位點進行注釋，最后篩選出疾病相關的SNP或Indel變異。
[0038] 縮寫與定義：
[0039] SNP 單核巧酸多態(tài)性
[0040] Indel插入缺失標記 [0041 ] 曲NA全基因組DNA
[0042] 神經系統(tǒng)遺傳性疾病
[0043] 神經系統(tǒng)遺傳疾病是由于生殖細胞或受精卵遺傳物質的異常，使發(fā)育的個體出現(xiàn) W神經系統(tǒng)功能缺損為主要臨床表現(xiàn)的疾病。神經系統(tǒng)遺傳性疾病的病種最多，在人類 5000余種單基因病中，累及神經系統(tǒng)的約占60%。表1I中為常見神經系統(tǒng)疾病的名稱及分 類情況：
[0044] 表1I.常見神經系統(tǒng)疾病的名稱及分類
[0045]





[0051] 目標序列捕獲探針
[0052] 目標序列捕獲是指通過某種方法有選擇性的分離或者富集基因組的特定片段。目 標序列捕獲的一種重要的方法是根據(jù)核酸分子堿基互補雜交原理發(fā)展的。即根據(jù)目標基因 組序列，設計與之完全互補的探針，將運些探針固定在某些支持物上（用于分離），然后打斷 基因組DM,加上接頭（用于測序)后與探針雜交，洗脫未雜交上的DNA，回收目標DM片段，可 W直接建庫進行DNA測序。
[0053] 根據(jù)雜交時狀態(tài)不同，目標序列捕獲可W分為固相雜交法和液相雜交法。固相雜 交法所用的探針通常都是固定在固體支持物上，如玻璃片2,3、塑料球等，其中最典型的是 基因忍片。固相捕獲系統(tǒng)構建如下，首先選定目標DNA區(qū)域，在修飾了的玻璃片基上原位合 成一系列與目標區(qū)域互補的探針。通常，基因忍片是雜交后，洗脫未雜交上的DNA片段，然后 掃描成像獲取每個探針的雜交信號，而固相雜交捕獲則只有最后一步不同，即與探針雜交 的DNA被洗脫下來，用于后序的測序工作。
[0054] 液相雜交與固相雜交最大的差異在于雜交反應的環(huán)境不同。液相雜交是通過在溶 液中，目標DNA片段和已帶有生物素標記探針直接雜交，然后通過生物素-親和素的反應使 目標DNA片段錯定在帶有親和素的微珠上。洗去非目標DNA，洗脫后，富集的DNA用于測序。液 相雜交與固相雜交相比有兩大優(yōu)勢:第一、雜交效率更高;第二、易于操作，時間短，便于自 動化操作。
[0055] -般來說一個8堿基的探針就有了足夠的雜交特異性，而探針越長，雜交的特異性 就越差。目前商業(yè)試劑盒的探針長度都在60nt到200nt之間，運其中的一個重要考慮是，雜 交的特異性限定(或雜交的錯配容忍度）。我們需要研究的是目標DNA片段中發(fā)生的突變、插 入/缺失等，如果探針特異性太高，在DNA捕獲時就會產生有利于參考序列（與探針完全互補 的序列）的選擇，運在后期數(shù)據(jù)統(tǒng)計上就會產生明顯的偏差，而探針太長又會有太多的非特 異雜交，非目標序列會急劇增加。
【附圖說明】
[0056] 圖1、神經系統(tǒng)遺傳性疾病基因篩查方法示意圖。
[0057] 圖2、高通量測序示意圖。
[005引圖3、1例脾骨肌萎縮癥患者家系圖譜和Sanger測序結果。
【具體實施方式】
[0059] -、使用試劑盒篩查216例神經遺傳性疾病患者的致病基因
[0060] 患者病征:女，17歲，自六歲開始出現(xiàn)行走不穩(wěn)，十五歲因左側足內翻行手術矯正。
[0061] 臨床表現(xiàn)：四肢遠端肌力減弱，雙手肌肉萎縮，四肢腫反射減弱。肌電圖檢查提示 多發(fā)性周圍神經損害，運動感覺神經軸索損害為主。
[0062] 診斷:脾骨肌萎縮癥(化arcot-Marie-ToothiCMT)亦稱為遺傳性運動感覺神經病 (HMSN)。
[0063] 發(fā)病率:1/2500。
[0064] 疾病特點：具有明顯的遺傳異質性，臨床主要特征是四肢遠端進行性的肌無力和 萎縮伴感覺障礙。多數(shù)呈常染色體顯性遺傳，也可呈常染色體隱性或X-連鎖遺傳。
[0065] 檢測病種:運動神經元病、遺傳性共濟失調、肌肉疾病、遺傳代謝病等。
[0066] 致病基因：PMP22、MPZ、LITAF、EGR2、W^、KIF1B、MFN2、RAB7A、LMNA、MED25、TRPV4、 GARS、肥化、HSPB1、GDAP1、MPZ、HSPB8、面M2、AARS、DYNC1Η1、LRSAM1、畑TKD1、EGR2、PMP2 2、 PRX、MTMR2、S邸2、SBF1、S冊 TC2、NDRG1、EGR2、PRX、服1、FGD4、FIG4、SURF1、DNM2、YARS、INF2、 GNB4、GDAP1、KARS、PLEK服5、GJB1、BSCL2、PRPS1、PDK3、HOXD1ο、CTDP1、SEPT9、SOXlο、CCT5 等。
[0067] 檢測手段：用制備的神經系統(tǒng)遺傳疾病基因篩查試劑盒捕獲目的基因序列，再利 用高通量測序平臺（Illumina HiSeq 3000)的雙端15化Ρ測序模式對樣本進行檢測，通過生 物信息學分析數(shù)據(jù)結果，找出與神經系統(tǒng)遺傳疾病相關基因的突變信息位點，W達到基因 診斷的目的。
[0068] 檢測過程如圖1所示。具體包括W下幾個環(huán)節(jié)：
[0069] ( - )神經系統(tǒng)遺傳性疾病外顯子區(qū)域捕獲探針試劑盒制備
[0070] 根據(jù)人類基因組HG19序列，調取表1中全部與神經系統(tǒng)遺傳性疾病發(fā)生相關基因 的外顯子序列，基于羅氏液相雜交技術（SeqCap EZ)，采用Roche NimbleGen優(yōu)化的迭代 (Repeat mask)算法，對每個外顯子區(qū)域中非重復區(qū)域設計50-105bp的探針序列，每個探針 沿著基因位置挪動設計，探針之間的挪動大小3-lObp，且目標區(qū)域每個堿基被探針至少覆 蓋3次，最多不超過20次。采用常規(guī)技術將探針W生物素標記。
[0071] (二)患者全基因組文庫構建
[0072] 從患者體內抽取3~5血血液，從中抽提3-扣g基因組DNA(曲NA)，片段化處理曲NA， 加接頭、純化、擴增W構建全基因組DNA文庫。具體過程如下：
[0073] 1、DNA樣本制備（使用QIGEN公司QIAamp DNA Blood Maxi Kit提?。?br>[0074] (1)取20化1 QIGEN蛋白酶加入到2mL全血中，混勻。
[00巧](2)加2.4mL AL溶液，充分混勻，振蕩lmin，7(TC解育lOmin。
[0076] (3)加入2mL無水乙醇，充分振蕩混勻后，轉移至裝在新離屯、管上的QIAampMidi column 中，3000巧m 離屯、3min。
[0077] (4)去離屯、后的廢液，重復離屯、一次。
[007引（5)在QIAampMidi column中加2mL AW1 溶液，5000巧m離屯、15min。
[0079] (6)棄廢液，向QIAampMidi column中加2mL AW2溶液，5000巧m離屯、15min。
[0080] (7)將QIAampMidi column轉移至新的離屯、管上，在QIAampMidi column上加入300 μL AE，室溫放15min，而后5000巧m離屯、2min。
[0081 ] (8)重復步驟7,最后得到60化1曲ΝΑ溶液。
[0082] 2、曲ΝΑ質檢：
[0083] 取化L曲ΝΑ加入到化no化op儀器(美國Thermo公司）中檢測DNA溶液濃度，根據(jù)濃 度取50ng用1%瓊脂糖電泳檢測。
[0084] 3、DNA文庫構建
[00化](l)DNA片段化：取化g DNA，用RB溶液稀釋至120yL，用超聲破碎儀（Bior叫ter公 司）打斷，7.5min/次，超聲8次。
[0086] (2)DNA末端補平：取60化片段化的DNA，加40化末端補平緩沖液（illumina En化邱air buffer)，混勻，離屯、；PCR儀中30°C反應30min，再加入 160μΙ AmpureBeads(美國 Beckman公司），充分混勻，室溫放置15min;放磁力架，室溫放置5min，去上清;加200化80% 乙醇，室溫30s，去上清，重復1次;室溫干燥15min;加20化RB溶液，從磁力架上取下，充分混 勻，室溫放置5min，取上清17.5化到一個新管中。
[0087] (3)加 A:加 12.5化 A-tailing buffer(瑞±Roche公司巧Ijl7.扣L DNA中，充分混 勻，PCR儀中37°C反應30min。
[008引 （4)加接頭：依次加2.扣L RB，2.化L ligation Mix 2.5化接頭，混勻30°(：反應 lOmin;方口5μΙ Stop ligation buffer，混勻;再方口42.5μΙ AmpureBeads(美國Beckman公 司），充分混勻，室溫放置15min;放磁力架上，室溫反應5min，去上清，勿動beads;加入20化L 80%乙醇，室溫30s，去上清，重復1次;室溫干燥15min;加22化RB，從磁力架上取下，充分混 勻，室溫放置5min;放置磁力架上，取上清20化到一個新管中。
[0089] (5化〔3富集：取20化0魁，5化？?(：，2化1?0?1111義；98°(：反應3〇3，10個循環(huán)（981： 10s，6(TC30s，72°C30s)，72°C5min，1(TC保存；再加入50化 AmpureBeads(美國Beckman公 司），充分混勻，室溫放置15min ;放磁力架，室溫放置5min，去上清，勿動beads ;加200μΙ 80%乙醇，室溫30s，去上清，重復1次，室溫干燥15min;加32化RB，從磁力架上取下，充分混 勻，室溫放置5min;放置磁力架上，取上清30化到一個新管中。
[0090] (6)定量:如bit(美國invitrogen公司）定量DNA文庫。
[0091] (Ξ)采用試劑盒捕獲目的基因序列并進行高通量測序、分析
[0092] 用步驟(一）制備的神經系統(tǒng)遺傳性疾病基因篩查試劑盒捕獲祀基因序列并進行 高通量測序、分析過程如圖2所示，具體步驟如下：
[OOW] 1、祀序列捕獲
[0094] (1)第一次雜交:每個文庫取50化g，6個不同接頭的文庫等量混合，真空濃縮至40μ L;方口50μΙ Capture Target buffer 1;方口ΙΟμΙ Exome Enrichment Use Capture Target 011旨〇3(瑞壬1?〇證日公司），充分混勻，離屯、；？〔1?，95"€1〇111；[]1，18個循環(huán)（93"€1111；[]1，每個循環(huán) 降低 2°C)，58°C18h。
[00巧](2)第一次wash:加250化充分混勻的鏈霉親和素磁珠 （streptavidin Ma即etic Beads),充分混勻，室溫靜置30min;磁力架放置2min，去上清；加200化Wash solution 1 (瑞：tRoche公司），充分混勻；磁力架放置2min，去上清；加200化Wash solution 2(瑞：t Roche公司），充分混勻;磁力架放置2min，去上清。
[0096] (3 )DNA洗脫：加混合好的化0H，30化到管中，混勻，室溫放置5min;磁力架放置 2111；[]1，取上清28.5化至一新離屯、管中；加扣L Elute 1:a;rget buffer 2(瑞:tRoche公司），混 勻。
[0097] (4)第二次雜交：取30化 DNA，加 ΙΟμΙ d地2〇,至40化；加50μΙ Capture Target bufferl(瑞±Roche公司）；方口ΙΟμΙ Exome Enrichment Use Capture Target Oli邑os(瑞± 1?〇^16公司）；充分混勻，離屯、;？〇?，95°(：10111111，18個循環(huán)(93°(：1111111，每個循環(huán)降低2°(：)，58 °C18h〇
[0098] (5)第二次wash:加250化充分混勻的鏈霉親和素磁珠 （streptavidin Ma即etic Beads),充分混勻，室溫靜置30min;磁力架放置2min，去上清；加200化Wash solution 1 (瑞：tRoche公司），充分混勻；磁力架放置2min，去上清；加200化Wash solution 2(瑞：t Roche公司），充分混勻;磁力架放置2min，去上清。
[0099] (6 )DNA洗脫：加混合好的化0H，30化到管中，混勻，室溫放置5min;磁力架放置 2min，取上清28.5化至一新離屯、管中；加扣L Elute 1:arget buffer2(瑞:tRoche公司），混 勻。
[0100] (7)PCR:20yL 0臟，5化 PPC，2扣L PCRmix;98°C30s，10個循環(huán)（98°C10s，6(TC30s， 72°C30s)，72°C5min，10°C保存；加50μΙ AmpureBeads(美國Beckman公司），充分混勻，室溫 放置15min;放磁力架，室溫放置5min，去上清，勿動beads;加20化L80 %乙醇，室溫30s，去上 清，重復1次;室溫干燥15min;加32化RB，從磁力架上取下，充分混勻，室溫放置5min;放置 磁力架上，取上清SOiiL到一個新管中，得到祀序列文庫。
[0101] 2、簇生成
[0102] (1)用如bit儀器(美國invitrogen公司）定量文庫；
[0103] (2)將文庫稀釋至lOnM;
[0104] (3)取化L lOnM文庫，加 ΙμΙ 2N NaOH，加 1 如L TrisCl，混勻，室溫放置5min;
[0105] (4)取化L步驟3溶液，力的9化L冷的雜交buffer;
[0106] (5)取14化L步驟4溶液，放在8連管中，置于cBot的template欄中；
[0107] 3、通過111皿ina Hiseq3000測序，得到測序數(shù)據(jù)。測序參數(shù)如下： 目標基因數(shù)目 854個 目標區(qū)域長度（bp) 4.8 Mb
[010引 目標區(qū)域覆蓋率 98.6% 目標區(qū)域測序平均深度（X ) 100X 目標區(qū)域平均深度>20X位點所占比例 95.9%
[0109] 4、生物信息分析流程：
[0110] (1)利用化im Galore軟件對測序數(shù)據(jù)從3'端動態(tài)去除接頭序列片段和低質量片 段。
[0111] (2)用化stQC軟件對預處理數(shù)據(jù)進行質量控制分析。
[0112] (3)通過BWA軟件把有效測序數(shù)據(jù)比對到人類參考基因組中（最多的錯誤匹配數(shù)目 為3個，seed長度為32，seed中錯誤匹配的個數(shù)不得超過2個）。
[0113] (4)統(tǒng)計祀標區(qū)域信息:祀標區(qū)域平均覆蓋度、插入片段的大小、Reads落于目的區(qū) 域、目的區(qū)域附近、非目的區(qū)域的分布比例、目的區(qū)域內不同覆蓋深度的堿基分布比例等。
[0114] (5)采用GATK3.1.1進行變異檢測，SNP和Indel變異識別、校正、過濾。采用picard- tools軟件去除由于在建庫過程中PCR產生的重復序列;采用Smith-Waterman序列比對算法 (Smith-Waterman alignment algorithm)針對已知indels(來自化SNP138數(shù)據(jù)庫，化G indels)附近區(qū)域進行局部重新比對，去除在比對中的錯誤;針對來自測序儀產生的堿基質 量分數(shù)Quality Score進行校正；通過GATK的UnifiedGenotyper程序對W上一系列操作后 的比對BAM文件進行SNP和Indel的變異檢測;針對上一步call出來的變異位點進行過濾，去 掉不可信的位點。
[011引（6)用ANN0VAR對變異位點進行注釋，利用千人基因組、化SNP信息、ESPXLINVAR、 CADD、C0SMIC、NCI60等數(shù)據(jù)庫對變異注釋。確定變異發(fā)生的基因、位置、堿基改變、雜合或純 合變異、變異發(fā)生的頻率等信息。判別SNP變異為同義或非同義變異、預測氨基酸的改變對 蛋白質功能的影響，注釋Indel變異為譯碼框缺失或是插入突變等信息。
[0116] (7)對候選SNP和Indel位點篩選，對變異質量分數(shù)、基因組區(qū)域特征等信息過濾變 異位點，SNP變異位于編碼區(qū)且影響氨基酸變化的錯義突變或終止子突變?yōu)楹Y選條件， Indel變異是否為譯碼框突變?yōu)楹Y選條件。其他輔助篩選條件包括測序深度、千人基因組中 突變頻率、物種間的保守性、是否為有害突變(SIFT Score)等，最后篩選出疾病相關的SNP 或Indel變異。
[0117] (8)檢測結果及分析
[0118] 本次基因測序檢測發(fā)現(xiàn)受檢者攜帶MFN2基因的一個雜合新的變異位點c.379G〉A。 MFN2基因中的多個位點突變是脾骨肌萎縮癥常見的致病原因，并多為顯性遺傳。c.379G〉A 突變導致MFN2基因編碼氨基酸序列上第127位甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸。Engelfried (Engelfried Κ et al.,Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2A:novel mutations in the mitofusin 2gene(MFN2).BMC medical genetics.,2006;7:53)和Qumg(Qumg KW et al.,Early onset severe and late-onset mild Charcot-Marie-Tooth disease with mitofusin 2(MFN2)mutations.Brain:a journal of neurology.2006Aug；129(Pt 8): 2103-18)等研究發(fā)現(xiàn)脾骨肌萎縮癥患者攜帶雜合型c. 379G〉A變異位點。此外，該位點經 Polyphen2軟件預測可能會產生蛋白毒性，并且在千人數(shù)據(jù)庫中檢出頻率極低。因此， c.379G〉A雜合型變異可能導致受檢者患病。
[0119] 表1II.1例脾骨肌萎縮癥患者發(fā)生MFN2基因 c.379G〉A突變位點信息
[0120]
[0121] 為了進一步驗證基因篩查結果，對患者遺傳病家系進行連鎖分析。對患者及其父 母和兄弟的C. 3 79G〉A位點進行Sanger測序驗證實驗，發(fā)現(xiàn)患者C. 379G〉A位點的基因型與其 母親和兄弟的基因型相同，均為雜合型變異，患者父親該位點為正常型，而患者和其母親及 兄弟Ξ者均有脾骨肌萎縮癥相關臨床癥狀，其父親無相關臨床癥狀，表明c.379G〉A位點極 可能為患者疾病的致病原因，并為顯性遺傳。家系圖譜和Sanger測序結果如圖3所示。
[0122] 上述具體實施方法，僅是對本發(fā)明的最優(yōu)實施方式進行描述，而非對本發(fā)明的范 圍進行限定，在不超出本發(fā)明基本設計思路的前提下，一切對本發(fā)明技術方案做出的調整、 變形及改變，均應歸入本發(fā)明權利要求書確定的保護范圍。
【主權項】
1. 一種神經系統(tǒng)遺傳性疾病基因篩查試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含與表1中所 示神經系統(tǒng)遺傳性疾病相關的854個致病基因或疾病易感基因中全部外顯子序列的特異性 寡核苷酸捕獲探針。2. 如權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述探針長度為50~105bp。3. 如權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述探針以生物素標記。4. 制備如權利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于，包含如下步驟： (1) 根據(jù)人類基因組HG19序列，調取表1中全部與神經系統(tǒng)遺傳性疾病發(fā)生相關基因的 外顯子序列； (2) 針對全部外顯子序列非重復區(qū)域設計50~105bp長度的捕獲探針，每個探針沿著基 因位置挪動3~10bp，目標區(qū)域每個堿基被探針覆蓋3~20次。 (3) 合成步驟(2)所設計的捕獲探針，并以生物素標記。5. -種神經系統(tǒng)遺傳性疾病基因聯(lián)合篩查方法，包括以下步驟： (1) 獲取、檢測受檢者的全基因組DNA樣本； (2) 構建受檢者全基因組文庫； (3) 采用如權利要求1-3任一項所述試劑盒中的捕獲探針與受檢者DNA文庫混合，目標 區(qū)域基因片段與探針雜交，探針通過標記的生物素與帶有親和素的磁珠結合； (4) 將未結合的非目標區(qū)域的DNA片段洗脫； (5) 利用新一代高通量測序儀對目標區(qū)域基因組進行測序、分析，獲取疾病相關基因的 所有突變信息。6. 如權利要求5所述篩查方法，其特征在于，所述高通量測序儀為11 lumina HiSeq 3000 型。7. 如權利要求5所述篩查方法，其特征在于，步驟(5)中所述分析過程包含以下步驟： (1) 從高通量測序儀(IIlumina HiSeq 3000)獲取原始數(shù)據(jù)； (2) 利用Trim Galore軟件對測序數(shù)據(jù)從3'端動態(tài)去除接頭序列片段和低質量片段； (3) 用FastQC軟件對預處理數(shù)據(jù)進行質量控制分析； (4) 通過BWA軟件把有效測序數(shù)據(jù)比對到人類參考基因組中； (5) 統(tǒng)計靶標區(qū)域信息，包括靶標區(qū)域平均覆蓋度、插入片段平均分布圖、目標區(qū)域測 序深度等； (6) 采用GATK3.1.1進行變異檢測，SNP和Indel變異識別、校正、過濾； (7) 用ANN0VAR對變異位點進行注釋，最后篩選出疾病相關的SNP或Indel變異。
【文檔編號】C12Q1/68GK106011224SQ201510982601
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2015年12月24日
【發(fā)明人】熊玉宇, 鄒曉文, 楊福蘭, 葉思彬
【申請人】晶能生物技術（上海）有限公司