一種降鈣素、葉酸、維生素d聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及免疫層析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種降鈣素、葉酸、維生素D聯(lián)合檢測用試劑盒及其制備方法。該試劑盒包括塑料板、玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜、樣本墊和吸水墊，所述玻璃纖維素膜上包被有量子點標(biāo)記的降鈣素抗體、葉酸抗體和25羥基維生素D3抗體的混合物；硝酸纖維素膜上設(shè)置有檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線，檢測線1上包被有降鈣素二抗，檢測線2上包被有葉酸二抗，檢測線3上包被有25羥基維生素D3抗原，控制線上包被有羊抗鼠lgG。該試劑盒，利用雙抗體/抗原夾心原理以及競爭法檢測原理結(jié)合量子點的熒光特性實現(xiàn)了采用熒光免疫層析的方法對降鈣素、葉酸和維生素D進行快速、靈敏的聯(lián)合檢測。
【專利說明】
一種降鈣素、葉酸、維生素 D聯(lián)合檢測用免疫層析試劑盒及其 制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及免疫層析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種降鈣素、葉酸、維生素D聯(lián)合檢 測用免疫層析試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 降鈣素是甲狀腺的濾泡旁細胞（明亮細胞或C細胞)產(chǎn)生和分泌，它由32個肽組成。 主要生理功能是降低血鈣、血磷的水平。血漿中鈣離子濃度過高，胃泌素(gastrin)和五肽 胃泌素(Pentagastrin)的升高可促進降鈣素的分泌。降鈣素影響了鈣離子和磷酸鹽的代謝 過程，其功能多半是拮抗甲狀旁腺素的作用。健康男性血漿中降鈣素的平均濃度為〇~ 14ng/L，女性血漿中降鈣素的平均濃度為0~28ng/L。臨床研究發(fā)現(xiàn)患有惡性腫瘤，如燕麥 細胞癌、肺癌、胰腺癌、子宮癌、前列腺癌，某些異位內(nèi)分泌綜合征，嚴(yán)重骨病，腎臟疾病、嗜 鉻細胞瘤等疾病是會出現(xiàn)血漿中降鈣素升高，而且通過血漿中降鈣素的濃度對起源于濾泡 旁細胞的甲狀腺髓樣癌的診斷、判斷手術(shù)療效和觀察術(shù)后復(fù)發(fā)等有重要意義。另外，臨床上 甲狀腺手術(shù)切除、重度甲狀腺功能亢進的病患，會出現(xiàn)血漿中降鈣素濃度降低。
[0003] 葉酸(f〇1 ic acid)也叫維生素B9，是一種水溶性維生素。葉酸由蝶啶、對氨基苯甲 酸和L-谷氨酸組成，也叫蝶酰谷氨酸，它是B族維生素的一種。它在被發(fā)現(xiàn)后曾被命名為:維 生素M、維生素Bc、R因子等，1941年，因為從菠菜中發(fā)現(xiàn)了這種生物因子，所以被命名為葉 酸。葉酸富含于新鮮的水果、蔬菜、肉類食品中，食物中的葉酸若經(jīng)長時間烹煮，可損失50% ~90 %。葉酸主要在十二指腸及近端空腸部位吸收，人體內(nèi)葉酸儲存量為5~20mg，葉酸主 要經(jīng)尿和糞便排出體外，每日排出量為2~5ug。葉酸是水溶性的維生素，一般超出成人最低 需要量20倍之內(nèi)也不會引起中毒。但凡超出的葉酸的量均從尿中排出。天然葉酸廣泛存在 于動植物類食品中，尤以酵母、肝及綠葉蔬菜中含量比較多。
[0004] 臨床研究表明葉酸在體內(nèi)以四氫葉酸的形式起作用，具有如下生理功能：
[0005] 1)作為體內(nèi)生化反應(yīng)中一碳單位轉(zhuǎn)移酶系的輔酶，起著一碳單位傳遞體的作用；
[0006] 2)作為輔酶參與核酸合成中嘌呤和胸腺嘧啶的合成，進一步合成DNA和RNA;
[0007] 3)參與氨基酸代謝，參與二碳氨基酸和三碳氨基酸相互轉(zhuǎn)化，在甘氨酸與絲氨酸、 組氨酸和谷氨酸、同型半胱氨酸與蛋氨酸之間的相互轉(zhuǎn)化過程中充當(dāng)一碳單位的載體；
[0008] 4)參與血紅蛋白及甲基化合物如腎上腺素、膽堿、肌酸等的合成:人體缺少葉酸可 導(dǎo)致紅血球的異常，未成熟細胞的增加，貧血以及白血球減少；
[0009] 5)幫助蛋白的代謝，并與維生素B12共同促進紅細胞的生成和成熟，是制造紅血球 不可缺少的物質(zhì)；
[0010] 6)也作為干酪乳酸菌及其他微生物的促進增殖因子而起作用；
[0011] 7)是胎兒生長發(fā)育不可缺少的營養(yǎng)素。孕婦缺乏葉酸有可能導(dǎo)致胎兒出生時出現(xiàn) 低體重、唇腭裂、心臟缺陷等。如果在懷孕頭3個月內(nèi)缺乏葉酸，可引起胎兒神經(jīng)管發(fā)育缺 陷，而導(dǎo)致畸形。因此，準(zhǔn)備懷孕的女性，可在懷孕前就開始每天服用100微克到300微克葉 酸。
[0012] 維生素D(vitamin D)為固醇類衍生物，具抗佝僂病作用，又稱抗佝僂病維生素。目 前認為維生素D也是一種類固醇激素，維生素D家族成員中最重要的成員是VD2(麥角鈣化 醇)和VD3(膽鈣化醇）。維生素D均為不同的維生素D原經(jīng)紫外照射后的衍生物，植物不含維 生素D，但維生素D原在動、植物體內(nèi)都存在。維生素D是一種脂溶性維生素，有五種化合物， 對健康關(guān)系較密切的是維生素D2和維生素D3，它們有以下三點特性：它存在于部分天然食 物中；人體皮下儲存有從膽固醇生成的7-脫氫膽固醇，受紫外線的照射后，可轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素 D3;適當(dāng)?shù)娜展庠∽阋詽M足人體對維生素D的需要。
[0013] 維生素D缺乏會導(dǎo)致少兒佝僂病和成年人的軟骨病。佝僂病多發(fā)于嬰幼兒，主要表 現(xiàn)為神經(jīng)精神癥狀和骨骼的變化。神經(jīng)精神癥狀上表現(xiàn)為多汗、夜驚、易激惹。骨骼的變化 隨年齡、生長速率及維生素D缺乏的程度等因素有關(guān)。可出現(xiàn)盧骨軟化、肋骨串珠等。骨軟化 癥多發(fā)生于成人，多見于妊娠多產(chǎn)的婦女及體弱多病的老人。最常見的癥狀是骨痛、肌無力 和骨壓痛。維生素D主要用于組成和維持骨骼的強壯，它被用來防治兒童的佝僂病和成人的 軟骨癥，關(guān)節(jié)痛等等，患有骨質(zhì)疏松癥的人通過添加合適的維生素D和鎂可以有效的提高鈣 離子的吸收度。除此以外，維生素D還被用于降低結(jié)腸癌、乳腺癌和前列腺癌的機率，對免疫 系統(tǒng)也有增強作用。
[0014] 研究表明維生素D的前體(生成維生素D的原料)存在于皮膚中，當(dāng)陽光直射時會發(fā) 生反應(yīng)轉(zhuǎn)化為維生素D3，D3分子被運送到肝臟并且轉(zhuǎn)化為維生素D的另一種形式25位單脫 氧膽固醇，這種形式的效用更大。然后25位單脫氧膽固醇又被轉(zhuǎn)運到腎形礦脈并在那里被 轉(zhuǎn)化為1，25位二羥膽鈣化（留）醇，這種形式是維生素D最有效的狀態(tài)。然后維生素D將和甲 狀旁腺激素以及降血鈣素協(xié)同作用來平衡血液中鈣離子和磷的含量，特別是增強人體對鈣 離子的吸收能力。維生素D不應(yīng)該用于血鈣過高的病人，或者血液中鈣離子含量偏高的人。 另外對患有腎結(jié)石和動脈硬化的病人來說也必須小心使用，因為維生素D可能會引起他們 的甲狀旁腺疾病，削弱腎功能甚至引起心臟疾病。皮質(zhì)類固醇對維生素D的作用有抵消作 用，消膽胺和礦物油會抑制人體對維生素D的吸收，所以應(yīng)避免一起食用。苯妥英鈉和安眠 藥可能增加維生素D的效果而降低血壓。缺乏維生素D除了會引起少兒的佝僂病和成人的軟 骨病外，其它的典型癥狀還包括肌肉萎縮，痢疾腹瀉，失眠，緊張等等。居住在地球南北極的 人和一些常年室內(nèi)工作的人往往無法自身合成足夠的維生素D，還有一些疾病也影響維生 素D的吸收，比如克羅恩氏病(Crohn's disease)等等。
[0015] 因此，研究開發(fā)出一種檢測方法和手段實現(xiàn)對降鈣素、葉酸和維生素D的聯(lián)合檢 測，有助于整體評估孕婦的健康狀況，包括骨質(zhì)狀況、貧血以及鈣吸收功能等機能，快速準(zhǔn) 確的診斷有利于及時對孕婦進行整體的有效治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡 便、成本低的降鈣素、葉酸、維生素D聯(lián)合檢測用試劑盒，實現(xiàn)對降鈣素、葉酸和維生素D抗體 三種成分的同時聯(lián)合檢測。
[0017] 本發(fā)明的目的還在于提供一種降鈣素、葉酸、維生素D聯(lián)合檢測用試劑盒的制備方 法。
[0018] 為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0019] -種降鈣素、葉酸、維生素D聯(lián)合檢測用試劑盒，包括塑料板、設(shè)置在塑料板上的玻 璃纖維素膜、設(shè)置在玻璃纖維素膜上的硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上一端設(shè)有樣本 墊，對應(yīng)的另一端設(shè)有吸水墊，所述玻璃纖維素膜上包被有量子點標(biāo)記的降鈣素抗體、量子 點標(biāo)記的葉酸抗體和量子點標(biāo)記的25羥基維生素D3抗體的混合物;所述硝酸纖維素膜上設(shè) 置有檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線，所述檢測線1上包被有降鈣素二抗，所述檢測線2 上包被有葉酸二抗，所述檢測線3上包被有25羥基維生素D3抗原，所述控制線上包被有羊抗 鼠 lgG。
[0020] 所述玻璃纖維上包被的量子點標(biāo)記的降|丐素抗體、量子點標(biāo)記的葉酸抗體和量子 點標(biāo)記的維生素D抗體的混合物中量子點標(biāo)記的降|丐素抗體、量子點標(biāo)記的葉酸抗體和量 子點標(biāo)記的25羥基維生素D3抗體的質(zhì)量比為1:1:1。
[0021 ] 所述量子點為硒化錦或硫化錦量子點。
[0022] 所述硝酸纖維素膜上設(shè)置的檢測線1與檢測線2之間、檢測線2與檢測線3之間、檢 測線1與控制線之間的間隔均不小于5mm。
[0023] 上述降鈣素、葉酸、維生素D聯(lián)合檢測用試劑盒的制備方法，包括以下操作步驟：
[0024] 1)原材料的制備：
[0025] A:制備玻璃纖維素膜:將量子點標(biāo)記的降鈣素抗體、量子點標(biāo)記的葉酸抗體、量子 點標(biāo)記的25羥基維生素D3抗體混合包被在玻璃纖維素膜上，干燥，備用；
[0026] B:制備硝酸纖維素膜:取硝酸纖維素膜，間隔劃分出檢測線1、檢測線2、檢測線3和 控制線，然后將降鈣素二抗、葉酸二抗、25羥基維生素D3抗原、羊抗鼠lgG分別包被在硝酸纖 維素膜的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上，之后將包被后的硝酸纖維素膜放入封閉 液中封閉，干燥，備用；
[0027] 2)組裝:在塑料板上放置步驟1)制備的玻璃纖維素模，然后在步驟1)制備的玻璃 纖維素膜上放置步驟1)制備的硝酸纖維素膜，然后在硝酸纖維素的一端放置樣品墊，對應(yīng) 的另一端放置吸水墊，干燥，即完成。
[0028] 步驟A中還包括首先制備量子點標(biāo)記的降|丐素抗體、量子點標(biāo)記的葉酸抗體和量 子點標(biāo)記的維生素D抗體的混合物，具體方法包括以下操作步驟：
[0029] a:在膠乳顆粒懸濁液中加入改性環(huán)糊精，混勻24小時，純化，得改性環(huán)糊精-膠乳 復(fù)合物懸濁液；
[0030] b:在步驟a制備的改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入量子點，混勻24小時，純 化，得量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸池液；
[0031] c:在步驟b制備的量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入活化劑，活化15 分鐘，純化，之后加入降鈣素抗體，混勻2~4小時后，離心得沉淀物顆粒，將沉淀物顆粒用封 閉液重懸，室溫混勻1小時，之后再進行純化，即得量子點標(biāo)記的降鈣素抗體；
[0032] d:按照上述步驟a~c同樣的方法制備量子點標(biāo)記的葉酸抗體和量子點標(biāo)記的維 生素D抗體，然后將量子點標(biāo)記的降|丐素抗體、量子點標(biāo)記的葉酸抗體和量子點標(biāo)記的25輕 基維生素D3抗體混合，備用；
[0033] 所述改性環(huán)糊精為羧甲基化改性環(huán)糊精或氨基化改性環(huán)糊精。
[0034] 所述活化劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽。
[0035] 步驟c中所述量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物與活化劑的質(zhì)量比為1:10。
[0036] 步驟B中所用的封閉液為牛血清白蛋白溶液。
[0037] 步驟c中所用的封閉液為牛血清白蛋白溶液。
[0038] 步驟a中所述改性環(huán)糊精與膠乳顆粒的質(zhì)量比為20:1;步驟b中所述量子點與環(huán)糊 精-乳膠復(fù)合物的質(zhì)量比為10:1;步驟c中所述降鈣素抗體與量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合 物的質(zhì)量比為1:20。
[0039]步驟a中膠乳顆粒使用前進行純化處理，所述純化處理的具體方法為:取膠乳顆粒 加入第一緩沖液中，離心分離，棄去上清，再用第一緩沖液重懸沉淀物顆粒，然后再離心分 離，棄去上清，再用第一緩沖液重懸沉淀物顆粒，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0040] 上述純化后的膠乳顆粒在使用時取膠乳顆粒，采用第二緩沖液將膠乳顆粒稀釋成 濃度為l〇mg/ml。
[0041] 上述步驟b中還包括首先將步驟a中制備的改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液，采用 第二緩沖液稀釋成濃度為l〇mg/ml的懸濁液，然后再加入量子點。
[0042] 上述步驟c中還包括首先將步驟b中制備的量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁 液，采用第二緩沖液稀釋成濃度為l〇mg/ml的懸濁液，然后再加入活化劑活化。
[0043] 步驟C中所述封閉后進行純化的具體方法為：8000rpm條件下離心15min，棄去上 清，沉淀復(fù)溶于分散液中。
[0044] 步驟A中將量子點標(biāo)記的降|丐素抗體、量子點標(biāo)記的葉酸抗體、量子點標(biāo)記的25輕 基維生素D3抗體混合包被在玻璃纖維素膜上的具體方法為：將將量子點標(biāo)記的降鈣素抗 體、量子點標(biāo)記的葉酸抗體和量子點標(biāo)記的25羥基維生素D3抗體混合物均勻噴涂于玻璃纖 維素膜上。
[0045] 步驟a和步驟b中所述純化的具體方法為:8000rpm條件下離心，棄去上清，沉淀用 第一緩沖液進行重懸，之后在SOOOrpm條件下離心，棄去上清，沉淀復(fù)溶于第一緩沖液中。
[0046] 步驟c中活化后純化的具體方法為:8000rpm條件下離心棄去上清，沉淀用第一緩 沖液進行重懸。
[0047] 步驟B中將降鈣素二抗、葉酸二抗、維生素D抗原、羊抗鼠lgG分別包被在硝酸纖維 素膜的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上的具體方法為:分別取濃度均為lmg/ml的降 鈣素二抗、葉酸二抗、25羥基維生素D3抗原和羊抗鼠IgG，以lul/cm，10cm/秒的速度分別噴 涂到硝酸纖維的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上。
[0048] 步驟1)和步驟2)中所述的干燥為37°C干燥3~5小時。
[0049] 上述第一緩沖液為0.02M，pH7.4的1?緩沖液。上述第二緩沖液為0.02M，pH6.1的 MES緩沖液。
[0050]上述降鈣素、葉酸、維生素 D聯(lián)合檢測用試劑盒在使用時，將待測樣品加入試劑盒 的樣品墊上，玻璃纖維素膜上的量子化標(biāo)記的降鈣素抗體、量子點標(biāo)記的葉酸抗體、量子點 標(biāo)記的25羥基維生素D3抗體混合物首先特異性的捕捉到待測樣品中的降鈣素、葉酸和25羥 基維生素D3抗體，然后在達到檢測線3時，量子點標(biāo)記的維生素D抗體-25羥基維生素D3結(jié)合 物與檢測線3上的25羥基維生素D3抗原特異性結(jié)合;在檢測線2時，量子點標(biāo)記的葉酸抗體-葉酸結(jié)合物與檢測線2上的葉酸二抗特異性結(jié)合;在檢測線1時，量子點標(biāo)記的降鈣素抗體-降鈣素結(jié)合物與檢測線1上的降鈣素二抗特異性結(jié)合;之后通過檢測檢測線1、檢測線2和檢 測線3上結(jié)合的量子點的熒光效應(yīng)，定量和定性判斷待測樣品中降鈣素、葉酸和維生素D。
[0051] 本發(fā)明降鈣素、葉酸、維生素D聯(lián)合檢測用試劑盒，以量子化標(biāo)記的降鈣素抗體、量 子點標(biāo)記的葉酸抗體、量子點標(biāo)記的25羥基維生素D3抗體混合物包被在玻璃纖維素膜上， 作為檢測探針，利用雙抗體/抗原夾心原理結(jié)合量子點的熒光特性實現(xiàn)了采用熒光免疫層 析的方法對降鈣素、葉酸和維生素D進行快速、特異、簡便、靈敏的聯(lián)合檢測。本發(fā)明降鈣素、 葉酸、維生素D聯(lián)合檢測用試劑盒檢測線低，檢測靈敏度高。
[0052] 本發(fā)明降鈣素、葉酸、維生素D聯(lián)合檢測用試劑盒的制備方法，操作簡便，易于控 制，適于工業(yè)化推廣應(yīng)用。
[0053]進一步優(yōu)選的，本發(fā)明制備方法中，創(chuàng)新量子點標(biāo)記技術(shù)，采用羧甲基化或氨基化 改性的環(huán)糊精修飾量子點，然后將降鈣素抗體、葉酸抗體、25羥基維生素D3抗體分別結(jié)合在 改性環(huán)糊精的羧甲基基團或氨基基團上，實現(xiàn)制備獲得量子點標(biāo)記的降鈣素抗體、量子點 標(biāo)記的葉酸抗體、量子點標(biāo)記的25羥基維生素D3抗體。
【附圖說明】
[0054]圖1是采用實施例1制備的試劑盒檢測降鈣素的發(fā)光值與實際濃度的標(biāo)注曲線；
[0055] 圖2是采用實施例1制備的試劑盒檢測葉酸的發(fā)光值與實際濃度的標(biāo)注曲線；
[0056] 圖3是采用實施例1制備的試劑盒檢測維生素D的發(fā)光值與實際濃度的標(biāo)注曲線。
【具體實施方式】
[0057] 下面通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細說明。
[0058] 實施例1
[0059] 本實施例降鈣素、葉酸、維生素D聯(lián)合檢測用試劑盒，包括塑料板、設(shè)置在塑料板上 的玻璃纖維素膜、設(shè)置在玻璃纖維素膜上的硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上一端設(shè)有 樣本墊，對應(yīng)的另一端設(shè)有吸水墊，所述玻璃纖維素膜上包被有質(zhì)量比為1:1:1的量子點標(biāo) 記的降鈣素抗體、量子點標(biāo)記的葉酸抗體和量子點標(biāo)記的25羥基維生素D3抗體的混合物； 所述硝酸纖維素膜上設(shè)置有檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線，所述檢測線1上包被有降 鈣素二抗，所述檢測線2上包被有葉酸二抗，所述檢測線3上包被有25羥基維生素D3抗原，所 述控制線上包被有羊抗鼠lgG;所述量子點為硒化錦量子點。
[0060] 本實施例降鈣素、葉酸、維生素D聯(lián)合檢測用試劑盒的制備方法，具體操作步驟為：
[0061] 1)制備玻璃纖維素膜：
[0062] a:取lml未標(biāo)記膠乳顆粒加入10ml，0.02M，pH7.4PB緩沖液中；離心機lOOOOrpm離 心20min;去掉上清液，再用10ml，0.02M，pH7.4PB緩沖液重懸沉淀顆粒物；之后再離心機 lOOOOrpm離心20min，去掉上清并用5ml0.02M，pH7.4JB緩沖液重懸沉淀顆粒物，4°C保存待 用；
[0063] b:取步驟a制備的膠乳顆粒用0.02M，pH6.1的MES緩沖液將膠乳顆粒稀釋至10mg/ ml，取0.05ml稀釋后的膠乳顆粒懸濁液加入10mg羧甲基化改性環(huán)糊精，混勻24小時后，離心 機8000rpm離心，棄去上清，并用0.02M，pH7.4的1?緩沖液重懸沉淀顆粒物，之后再次離心機 8000rpm離心，棄去上清，沉淀顆粒物復(fù)溶于0.02M，pH7.4的PB緩沖液中，得羧甲基化改性環(huán) 糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液；
[0064] c:取步驟b制備的羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液，用0.02M，pH6.1的MES 緩沖液將其稀釋至l〇mg/ml，取20ml稀釋后的羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合懸濁液，加入 20mg硒化鎘量子點，混勻24小時，離心機8000rpm離心，棄去上清，并用0.02M，pH7.4的PB緩 沖液重懸沉淀顆粒物，之后再次離心機8000rpm離心，棄去上清，沉淀顆粒物復(fù)溶于0.02M， pH7.4的PB緩沖液中，得量子點-羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液；
[0065] d:取步驟c制備的量子點-羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液，用0.02M， pH6.1的MES緩沖液將其稀釋至10mg/ml，然后按照量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物與活化 劑的質(zhì)量比為1:10,加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，活化15分鐘后， 8000rpm離心，棄去上清，并用0.02M，pH7.4的1?緩沖液重懸沉淀物顆粒，之后按照降鈣素抗 體:量子點-羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物=1:20的比例加入降鈣素抗體，混勻3小時 后，8000rpm離心15分鐘，將沉淀物顆粒用封閉液重懸，室溫混勾1小時，之后8000rpm離心 15min，沉淀顆粒物復(fù)溶于分散液，即得量子點標(biāo)記的降|丐素抗體；
[0066] e:按照上述步驟a~c同樣的方法制備量子點標(biāo)記的葉酸抗體和量子點標(biāo)記的25 羥基維生素D3抗體，然后將量子點標(biāo)記的降鈣素抗體、量子點標(biāo)記的葉酸抗體和量子點標(biāo) 記的25羥基維生素D3抗體混合，噴涂于玻璃纖維素模上，37°C干燥4小時，即得量子點標(biāo)記 的降鈣素抗體、量子點標(biāo)記的葉酸抗體和量子點標(biāo)記的25羥基維生素D3抗體混合物標(biāo)記的 玻璃纖維素膜；
[0067] 2)制備硝酸纖維素膜:取硝酸纖維素膜，間隔6mm依次劃分檢測線3、檢測線2、檢測 線1和控制線，之后取濃度均為lmg/ml的降鈣素二抗、葉酸二抗、25羥基維生素D3抗原、羊抗 鼠IgG，以lul/ Cm，10cm/秒的速度分別噴涂到硝酸纖維膜的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控 制線上，之后將硝酸纖維素膜放入牛血清白蛋白溶液中封閉，37°C干燥3小時，即得所述的 硝酸纖維素膜；
[0068] 3)組裝:在塑料板上放置步驟1)制備的玻璃纖維素模，在步驟1)制備的玻璃纖維 素膜上放置步驟2)制備的硝酸纖維素膜，然后在硝酸纖維素的一端放置樣品墊，對應(yīng)的另 一端放置吸水墊，37 °C干燥5小時，即完成。
[0069] 實施例2
[0070] 本實施例降鈣素、葉酸、維生素D聯(lián)合檢測用試劑盒，與實施例不同的地方在于，采 用的量子點為硫化鎘量子點，采用的改性環(huán)糊精為氨基化干性環(huán)糊精，制備降鈣素抗體、量 子點標(biāo)記的葉酸抗體和量子點標(biāo)記的25羥基維生素D3抗體的過程中，在活化的量子點-改 性環(huán)糊精-膠乳懸濁液中加入抗體或抗原的混勻時間為2小時，其他同實施例1。
[0071] 實施例3
[0072] 本實施例降鈣素、葉酸、維生素D聯(lián)合檢測用試劑盒，與實施例不同的地方在于，制 備降鈣素抗體、量子點標(biāo)記的葉酸抗體和量子點標(biāo)記的25羥基維生素D3抗體的過程中，在 活化的量子點-改性環(huán)糊精-膠乳懸濁液中加入抗體或抗原的混勻時間為4小時，其他同實 施例1。
[0073] 試驗例：
[0074]將降鈣素稀釋為 7 · 8125ug/L、15 · 625ug/L、31 · 25ug/L、62 · 5ug/L、125ug/L、250ug/ L;葉酸稀釋為3.90625ug/L、7.8125ug/L、15.625ug/L、31.25ug/L、62.5ug/L、125ug/L、 250ug/L; 25羥基維生素D3稀釋為1 · 5625ug/L、3 · 125ug/L、6 · 25ug/L、12 · 5ug/L、25ug/L、 50ug/L、1 OOug/L、200ug/L作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并同時配制空白溶液。
[0075]分別取各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品lOOul分別加入到實施例1制備的試劑盒的樣品墊上，5min 后將顯色完成的試劑盒放入熒光免疫層析讀數(shù)儀(南京美寧康誠生物科技有限公司）重，讀 取相應(yīng)檢測線的發(fā)光值，并記錄各濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測的發(fā)光值與實際濃度之間的對應(yīng)關(guān) 系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1~圖3所示，降鈣素的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y = -0.00009x2+ 0 · 04228χ-0 · 01248，R2 = 0 · 99956;葉酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y = -0 · 00008x2+0 · 03915x+ 0.09601，R2 = 0.99928;維生素 D 的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y = -0.00007x2+0.02681x+ 0.06104，R2 = 0.99885;由該標(biāo)準(zhǔn)曲線可知本發(fā)明制備的試劑盒針對降鈣素的最低檢測限 為lng/L、葉酸的最低檢測限為2yg/L、維生素D的最低檢測限為2yg/L。
[0076] 另外，取空白溶液加入到實施例1制備的試劑盒中，未檢測到熒光效應(yīng)。
[0077] 取100例隨機的臨床樣本，采用本發(fā)明實施例1制備的試劑盒對降鈣素、葉酸和維 生素D的濃度進行聯(lián)合檢測。檢測方法為：lOOul待測樣品（50ul樣品+50ul樣品稀釋液)滴入 試劑盒樣本墊上，5min后將顯色完成的標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品的試紙條放入熒光免疫層析讀數(shù) 儀(南京美寧康誠生物科技有限公司）中，讀取T/C線的發(fā)光值，并記錄，將待測樣品T/C值帶 入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到降鈣素、葉酸和維生素D的濃度，結(jié)果如下表1所示：
[0078] 表 1





[0085] 由此可見，本方法可以直接定量檢測降鈣素、葉酸、維生素D，不需專業(yè)培訓(xùn)，操作 方便，快速，l〇min即可獲得結(jié)果，適合在基層醫(yī)院和體檢中心推廣和運用。
[0086] 最后應(yīng)說明的是：以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制;盡管 參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依然可 以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換； 而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的精神和 范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種降鈣素、葉酸、維生素 D聯(lián)合檢測用試劑盒，包括塑料板、設(shè)置在塑料板上的玻璃 纖維素膜、設(shè)置在玻璃纖維素膜上的硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上一端設(shè)有樣本墊， 對應(yīng)的另一端設(shè)有吸水墊，其特征在于，所述玻璃纖維素膜上包被有量子點標(biāo)記的降鈣素 抗體、量子點標(biāo)記的葉酸抗體和量子點標(biāo)記的25羥基維生素 D3抗體的混合物;所述硝酸纖 維素膜上設(shè)置有檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線，所述檢測線1上包被有降鈣素二抗， 所述檢測線2上包被有葉酸二抗，所述檢測線3上包被有25羥基維生素 D3抗原，所述控制線 上包被有羊抗鼠 lgG。2. 如權(quán)利要求1所述的降鈣素、葉酸、維生素 D聯(lián)合檢測用試劑盒，其特征在于，所述玻 璃纖維上包被的量子點標(biāo)記的降鈣素抗體、量子點標(biāo)記的葉酸抗體和量子點標(biāo)記的25羥基 維生素 D3抗體的混合物中量子點標(biāo)記的降|丐素抗體、量子點標(biāo)記的葉酸抗體和量子點標(biāo)記 的25羥基維生素 D3抗體的質(zhì)量比為1:1:1。3. 如權(quán)利要求1所述的降鈣素、葉酸、維生素 D聯(lián)合檢測用試劑盒，其特征在于，所述量 子點為硒化錦或硫化錦量子點。4. 如權(quán)利要求1~3任一項所述的降鈣素、葉酸、維生素 D聯(lián)合檢測用試劑盒，其特征在 于，所述硝酸纖維素膜上設(shè)置的檢測線1與檢測線2之間、檢測線2與檢測線3之間、檢測線1 與控制線之間的間隔均不小于5_。5. -種如權(quán)利要求1所述的降鈣素、葉酸、維生素 D聯(lián)合檢測用試劑盒的制備方法，其 特征在于，包括以下操作步驟： 1) 原材料的制備： A:制備玻璃纖維素膜:將量子點標(biāo)記的降鈣素抗體、量子點標(biāo)記的葉酸抗體、量子點標(biāo) 記的25羥基維生素 D3抗體混合包被在玻璃纖維素膜上，干燥，備用； B:制備硝酸纖維素膜:取硝酸纖維素膜，間隔劃分出檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制 線，然后將降鈣素二抗、葉酸二抗、25羥基維生素 D3抗原、羊抗鼠 lgG分別包被在硝酸纖維素 膜的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上，之后將包被后的硝酸纖維素膜放入封閉液中 封閉，干燥，備用； 2) 組裝:在塑料板上放置步驟1)制備的玻璃纖維素模，然后在步驟1)制備的玻璃纖維 素膜上放置步驟1)制備的硝酸纖維素膜，然后在硝酸纖維素的一端放置樣品墊，對應(yīng)的另 一端放置吸水墊，干燥，即完成。6. 如權(quán)利要求5所述的降鈣素、葉酸、維生素 D聯(lián)合檢測用試劑盒的制備方法，其特征在 于，步驟A中還包括首先制備量子點標(biāo)記的降|丐素抗體、量子點標(biāo)記的葉酸抗體和量子點標(biāo) 記的25羥基維生素 D3抗體的混合物，具體方法包括以下操作步驟： a:在膠乳顆粒懸濁液中加入改性環(huán)糊精，混勻24小時，純化，得改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合 物懸濁液； b:在步驟a制備的改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入量子點，混勻24小時，純化， 得量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸池液； c:在步驟b制備的量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入活化劑，活化15分鐘， 純化，之后加入降鈣素抗體，混勻2~4小時后，離心得沉淀物顆粒，將沉淀物顆粒用封閉液 重懸，室溫混勻1小時，之后再進行純化，即得量子點標(biāo)記的降鈣素抗體； d:按照上述步驟a~c同樣的方法制備量子點標(biāo)記的葉酸抗體和量子點標(biāo)記的維生素 D 抗體，然后將量子點標(biāo)記的降鈣素抗體、量子點標(biāo)記的葉酸抗體和量子點標(biāo)記的25羥基維 生素 D3抗體混合，備用。7. 如權(quán)利要求6所述的降鈣素、葉酸、維生素 D聯(lián)合檢測用試劑盒的制備方法，其特征在 于，所述改性環(huán)糊精為羧甲基化改性環(huán)糊精或氨基化改性環(huán)糊精。8. 如權(quán)利要求6所述的降鈣素、葉酸、維生素 D聯(lián)合檢測用試劑盒的制備方法，其特征在 于，步驟a中所述改性環(huán)糊精與膠乳顆粒的質(zhì)量比為20:1;步驟b中所述量子點與環(huán)糊精-乳 膠復(fù)合物的質(zhì)量比為10:1;步驟c中所述降鈣素抗體與量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物的 質(zhì)量比為1:20。9. 如權(quán)利要求6所述的降鈣素、葉酸、維生素 D聯(lián)合檢測用試劑盒的制備方法，其特征在 于，步驟A中將量子點標(biāo)記的降|丐素抗體、量子點標(biāo)記的葉酸抗體、量子點標(biāo)記的維生素 D抗 體混合包被在玻璃纖維素膜上的具體方法為:將量子點標(biāo)記的降鈣素抗體、量子點標(biāo)記的 葉酸抗體和量子點標(biāo)記的維生素 D抗體混合物均勻噴涂于玻璃纖維素膜上。10. 如權(quán)利要求6所述的降鈣素、葉酸、維生素 D聯(lián)合檢測用試劑盒的制備方法，其特征 在于，步驟B中將降鈣素二抗、葉酸二抗、25羥基維生素 D3抗原、羊抗鼠 lgG分別包被在硝酸 纖維素膜的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上的具體方法為:分別取濃度均為lmg/ml 的降鈣素二抗、葉酸二抗、25羥基維生素 D3抗原和羊抗鼠 IgG，以lul/cm，10cm/秒的速度分 另IJ噴涂到硝酸纖維的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上。
【文檔編號】G01N33/558GK106018791SQ201610326772
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】金鑫, 曾濱, 趙正道
【申請人】北京美康基因科學(xué)股份有限公司