制備高效的新型自體dc疫苗的試劑盒、方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種制備高效的新型自體DC疫苗的試劑盒、 方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 世界衛(wèi)生組織下屬的國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)表的《2014年世界癌癥報告》指出，全球 癌癥患者數(shù)量正以驚人的速度增加。2012年，全球新增癌癥病例估計約達(dá)1400萬例，預(yù)計20 年內(nèi)這個數(shù)字將上升到2200萬。同期癌癥死亡人數(shù)也將從每年820萬飆升至1300萬。惡性腫 瘤目前主要治療方法包括手術(shù)、放療、化療以及靶向治療等。然而即使是采取了多學(xué)科綜合 治療的模式，癌癥的死亡率仍然高居不下。新型的癌癥治療方式亟待發(fā)展。
[0003] 《SCIENCE》雜志將腫瘤的免疫治療評為2013年度十大科學(xué)發(fā)現(xiàn)之首。樹突狀細(xì)胞 作為體內(nèi)唯一已知可以激活靜息T細(xì)胞能力的抗原呈遞細(xì)胞(APC)，能通過MHCI分子-抗原 肽復(fù)合物和MHCII分子-抗原肽復(fù)合物的方式，激活相應(yīng)的T淋巴細(xì)胞，發(fā)揮特異性免疫應(yīng)答 抗腫瘤的作用。同時，DC也能通過釋放白介素2(IL-2)、IFN-y (干擾素 γ )、IFN-a(干擾素 a)、激活自然殺傷細(xì)胞(NK)，發(fā)揮非特異性免疫抗腫瘤機(jī)制。DC在抗腫瘤免疫中的重要作 用，使得其成為免疫治療中的熱點之一。
[0004] 然而，腫瘤患者體內(nèi)的DC，受到多種免疫抑制因素的影響，很難發(fā)揮其抗腫瘤作 用。免疫調(diào)控細(xì)胞(骨髓來源的抑制細(xì)胞(MDSC)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)等）、免疫負(fù)反饋調(diào)節(jié) 因子（白介素10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子iKTGF-β)等）、免疫檢測點(程序性死亡受體1及其配 體(PD-1/PD-L1)、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)等）均可通過多種途徑降低DC誘導(dǎo) 的抗腫瘤功能。
[0005] 即使是在體外培養(yǎng)腫瘤患者骨髓、外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)來源的DC，仍然受到 免疫抑制機(jī)制的影響。目前DC疫苗的制備方式，DC的前體細(xì)胞通過CD14單克隆抗體的免疫 磁珠分選或者單個核細(xì)胞貼壁獲得，再采用以GM-CSF為基礎(chǔ)(培養(yǎng)髓系DC，mDC)或FLT3-L (培養(yǎng)漿細(xì)胞樣DC，pDC)的培養(yǎng)方式，等抗原負(fù)載后，利用TOLL樣受體(TLR)激動劑刺激其成 熟。然而在腫瘤患者DC疫苗制備中，GM-CSF或FLT3-L均能促進(jìn)DC前體細(xì)胞分化為MDSC。部分 TLR激動劑也能促進(jìn)MDSC的生成，發(fā)揮免疫負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。MDSC可抑制DC的成熟，降低其 抗原呈遞、迀移、誘導(dǎo)T細(xì)胞釋放IFN-γ等功能。MDSC通過精氨酸酶-I (ARG-1 )、誘導(dǎo)性氮氧 化合物合成酶(iNOS)、活性氧簇(ROS)等抑制T細(xì)胞的增殖和活化，并能釋放IL-HKTGF-β等 促進(jìn)Treg細(xì)胞擴(kuò)增。如何消除MDSC對DC疫苗的影響，成為是否能夠制備高效DC疫苗的關(guān)鍵。
[0006] pDC在DC疫苗中的作用，也逐漸引起關(guān)注。未成熟pDC主要發(fā)揮誘導(dǎo)免疫耐受的作 用，成熟的PDC可通過釋放大量的IFN-a，促進(jìn)mDC成熟、誘導(dǎo)NK細(xì)胞活化，發(fā)揮抗原呈遞作用 刺激CTL和Thl細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤特異性免疫應(yīng)答;如何發(fā)揮pDC的免疫刺激作用，亟需進(jìn)一步 的研究。
[0007] 另外，程序性死亡受體(PD-I)及其配體(PD-Ll)在DC疫苗中的作用機(jī)制也逐漸得 到闡明。TLR的激活，一方面增強(qiáng)了DC的抗原呈遞誘導(dǎo)T細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答的能力，同時也 導(dǎo)致了PD-Ll在DC的表達(dá)升高。PDL-I與表達(dá)在CTL、Thl細(xì)胞表面的I3D-I相結(jié)合，導(dǎo)致這些細(xì) 胞發(fā)生凋亡，負(fù)反饋抑制T細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答。在DC疫苗的制備過程中，阻斷ro-1/PD-Ll 信號通路，對DC疫苗的抗腫瘤機(jī)制能否增強(qiáng)，也需要進(jìn)一步探索。
[0008] 因此，有必要提供一種能夠消除MDSC在DC疫苗制備中的負(fù)性調(diào)節(jié)作用、增強(qiáng)mDC或 PDC免疫刺激功能的高效的DC腫瘤疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠消除MDSC在DC疫苗制備中的負(fù)性調(diào)節(jié) 作用、增強(qiáng)mDC或pDC免疫刺激功能的能夠制備高效的新型自體DC疫苗的試劑盒、方法及應(yīng) 用。
[0010] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供技術(shù)方案如下：
[0011] -方面，提供一種用于制備高效的新型自體DC疫苗的試劑盒，所述試劑盒包含如 下成分:GM-CSF、IL-4、FLT3-L和ATRA的細(xì)胞因子組合。
[0012] 本發(fā)明的試劑盒可以使用正常人來源的或者患者自體外周血、臍帶血或骨髓等來 源的單個核細(xì)胞，進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，獲得PBMCs的貼壁細(xì)胞，通過本發(fā)明的細(xì)胞因子組合誘導(dǎo) 生成未成熟DC，再采用混合TLRs激動劑促進(jìn)DC成熟。本發(fā)明通過對現(xiàn)有GM-CSF+IL-4培養(yǎng)技 術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，聯(lián)合應(yīng)用FLT3-L促進(jìn)pDC生成，增加單個核細(xì)胞轉(zhuǎn)化DC，同時利用全反式維甲 酸(ATRA)抑制MDSC生成，消除MDSC在DC疫苗制備中的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，有效增強(qiáng)pDC免疫刺激 功能。
[0013] 進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括0K432和CPG ODN混合的TLRs激動劑。本發(fā)明還聯(lián)合 TLRs(0K432+CPG 0DN)，促進(jìn)DC(pDC、mDC)成熟，增加 DC迀移能力，增強(qiáng)其誘導(dǎo)CTL和THl等細(xì) 胞產(chǎn)生特異性免疫殺傷抗腫瘤的能力。
[0014] 優(yōu)選地，所述試劑盒包含如下成分：500-1000U/ml GMCSF、500-1000U/ml IL-4、 50-200ng/ml FLT3-L和 1-5μΜ ATRA的細(xì)胞因子組合。
[0015] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括0.1-5KE/ml 0Κ432和1-5μΜ CPG ODN混合的TLRs激動 劑；其中，所述CPG ODN為CPG 0DN21798、CPG 0DN2336、CPG 0DN2006或CPG 0DN2395的一種 或多種;所述CPG ODN優(yōu)選為CPG 0DN21798。
[0016]另一方面，提供一種利用上述試劑盒制備高效的新型自體DC疫苗的方法，包括如 下步驟：
[0017] 1)單個核細(xì)胞的制備:無菌條件下，從外周血、臍帶血或骨髓中獲取單個核細(xì)胞， 再用生理鹽水或Hanks液洗滌，1000 rpm離心10分鐘，吸棄上清，沉淀即為PBMCs;
[0018] 2)DC前體細(xì)胞的制備：PBMCs在培養(yǎng)瓶中，37°C，5%⑶2條件下孵育1-2h，吸棄上 清，半貼壁的PBMCs即為包含DC前體細(xì)胞的細(xì)胞亞群；
[0019] 3)未成熟DC的培養(yǎng)：將半貼壁的PBMCs用GM-CSF+IL-4+FLT3-L+ATRA+自體血漿培 養(yǎng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得未成熟DC。
[0020] 4)將獲得未成熟DC進(jìn)行抗原負(fù)載，利用0K432和CPG ODN混合的TLRs激動劑刺激 24h使DC成熟。
[0021] 其中，所述CPG ODN為CPG 0DN21798、CPG 0DN2336、CPG 0DN2006或CPG 0DN2395的 一種或多種;所述CPG ODN優(yōu)選為CPG 0DN21798。
[0022]本發(fā)明的試劑盒可以使用正常人來源的或者患者自體外周血、臍帶血或骨髓等來 源的單個核細(xì)胞，進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，獲得PBMCs的貼壁細(xì)胞，通過本發(fā)明的細(xì)胞因子組合誘導(dǎo) 生成未成熟DC，再采用混合TLRs激動劑促進(jìn)DC成熟。本發(fā)明通過對現(xiàn)有GM-CSF+IL-4培養(yǎng)技 術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，聯(lián)合應(yīng)用FLT3-L促進(jìn)pDC生成，增加單個核細(xì)胞轉(zhuǎn)化DC，同時利用全反式維甲 酸(ATRA)抑制MDSC生成，消除MDSC在DC疫苗制備中的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，有效增強(qiáng)pDC免疫刺激 功能;本發(fā)明還聯(lián)合TLRs(0K432+CPG 0DN)，促進(jìn)DC(pDC、mDC)成熟，增加 DC迀移能力，增強(qiáng) 其誘導(dǎo)CTL和THl等細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫殺傷抗腫瘤的能力。。
[0023] 優(yōu)選地，所述TLRs激動劑為包括0.1-5KE/ml 0K432和1-5μΜ CPG ODN混合的TLRs 激動劑;或者，所述TLRs激動劑為包括0.1-5KE/ml 0Κ432和1-5μΜ CPG ODN混合的TLRs激動 劑，且所述0Κ432和CPG ODN混合的TLRs激動劑中還包括POLY(IC)、TNF-a、IFN- γ、其它類型 CPG ODN等的一種或多種。以0Κ432和CPG ODN二者聯(lián)合應(yīng)用的基礎(chǔ)上，也可以添加其他刺激 物如POLY(IC)、TNF-a、IFN-γ其它類型CPG ODN等的聯(lián)合應(yīng)用。
[0024] 進(jìn)一步地，所述步驟3中的培養(yǎng)基為包含500-1000U/ml GMCSF+500-1000U/ml IL-