轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在加強(qiáng)角膜力學(xué)性質(zhì)中的應(yīng)用及生物制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在加強(qiáng)角膜力學(xué)性質(zhì)中的應(yīng)用及其制備的生物制劑，屬 于生物制劑/角膜病領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 圓錐角膜(Keratoconus)是一種不伴有炎癥、以角膜基質(zhì)變薄、角膜進(jìn)行性前突、 角膜不規(guī)則散光、矯正視力下降為特征的眼病。也是角膜擴(kuò)張類疾病的典型代表。
[0003] 圓錐角膜多發(fā)生于年輕人，發(fā)病率約為1/2000,約21%的圓錐角膜患者最終需采 用角膜移植手術(shù)治療，約占所有角膜移植患者16%。傳統(tǒng)的圓錐角膜的主要治療有屈光矯 正和角膜移植兩大類，前者包括配戴框架眼鏡和角膜接觸鏡、角膜內(nèi)環(huán)植入術(shù)、準(zhǔn)分子激光 角膜表面切削術(shù)(PRK)等，這些方法對(duì)部分圓錐角膜患者可達(dá)到屈光矯正的目的，但不能阻 止病情的進(jìn)展。后者則受到器官來源的限制，患者需要使用抗排異藥物，應(yīng)用受到制約。
[0004] 圓錐角膜的病因至今仍不十分清楚，但角膜的機(jī)械強(qiáng)度降低被認(rèn)為是其重要病因 之一。組織學(xué)上發(fā)現(xiàn)圓錐處纖維板層減少，膠原纖維直徑并未改變。故認(rèn)為可能是纖維板層 間粘合不夠，板層相互滑脫，導(dǎo)致角膜變薄。繼而，由于角膜中央?yún)^(qū)或旁中央?yún)^(qū)進(jìn)行性的變 薄，導(dǎo)致角膜不規(guī)則散光度增加，近視度數(shù)也不斷加深，視力進(jìn)行性下降。從這個(gè)角度出發(fā)， 增加角膜的力學(xué)強(qiáng)度成為治療該疾病的新的治療手段和思路。
[0005] 膠原交聯(lián)治療(cross-1 inking treatment)是通過生物化學(xué)的方法使膠原纖維的 相互連接加強(qiáng)，增加組織強(qiáng)度的治療技術(shù)，按照交聯(lián)方法的不同可以分為物理交聯(lián)(光化學(xué) 交聯(lián)）、化學(xué)交聯(lián)、生化交聯(lián)(酶交聯(lián))三種。在目前國(guó)內(nèi)外的研究中，物理交聯(lián)(光化學(xué)交聯(lián)） 治療對(duì)圓錐角膜的治療研究已經(jīng)顯示了很好的療效。其中紫外光-核黃素角膜交聯(lián)法已經(jīng) 被美國(guó)FDA批準(zhǔn)，在臨床上應(yīng)用。
[0006] 該方法是采用核黃素作為光敏劑，以對(duì)眼球內(nèi)部結(jié)構(gòu)無(wú)害的紫外線A(UVA)照射， 利用光線的照射使光敏劑將氧分子激發(fā)到三線態(tài)，其在回到單線態(tài)時(shí)產(chǎn)生有很強(qiáng)的氧化活 性的氧自由基(R〇S，reactive oxygen species)(圖6)，使得膠原纖維的終端發(fā)生縮合反 應(yīng)，增加了膠原纖維之間的側(cè)向連接，從而使角膜的機(jī)械強(qiáng)度得到了增強(qiáng)，圓錐角膜得以停 止進(jìn)展甚至有部分患者近視度數(shù)得到了減輕?；瘜W(xué)交聯(lián)對(duì)角膜的作用目前停留在實(shí)驗(yàn)室階 段，有學(xué)者使用短鏈無(wú)環(huán)β硝基乙醇(BNA)、京尼平用于豬角膜的交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)離體動(dòng)物角膜的 彈性模量一定程度的增加。
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[0009]上述兩種交聯(lián)方法均存在一定的局限性。
[0010]雖然紫外光-核黃素交聯(lián)法技術(shù)應(yīng)用于臨床已近十年，并被譽(yù)為"圓錐角膜患者的 治愈希望"。但是尚存在諸多不足：1)由于角膜的核黃素吸收效應(yīng)，該方法只能使角膜前250 ~300um的基質(zhì)膠原得到交聯(lián)，因此，其臨床有效性受限，多項(xiàng)研究均顯示紫外光核黃素交 聯(lián)后角膜最陡屈光度下降僅2D左右。2)該方法治療時(shí)需去除角膜上皮，可增加患者術(shù)后疼 痛、視物模糊、角膜云霧狀混濁及感染的發(fā)生。3)該方法也存在安全性問題，近期臨床研究 報(bào)道對(duì)角膜厚度低于400um的圓錐角膜患者行紫外線核黃素交聯(lián)后角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度明顯 下降。4)對(duì)基質(zhì)細(xì)胞的損傷:基礎(chǔ)研究及角膜共聚焦顯微鏡臨床觀察均表明在深達(dá)300um 的角膜基質(zhì)中有大量角膜細(xì)胞凋亡，需要長(zhǎng)達(dá)半年時(shí)間恢復(fù)。5)紫外光核黃素膠原交聯(lián)對(duì) 于光過敏體質(zhì)的病人不適用。6)設(shè)備價(jià)格昂貴。7)對(duì)于術(shù)前最陡角膜屈光度超過58D、年齡 超過35歲、視力大于0.8的圓錐角膜患者，紫外光核黃素交聯(lián)手術(shù)后發(fā)生各種并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn) 明顯增加。上述問題限制了此項(xiàng)技術(shù)的推廣和應(yīng)用?；瘜W(xué)交聯(lián)法簡(jiǎn)單易行，交聯(lián)劑來源廣， 但是其化學(xué)交聯(lián)劑治療的副作用難以回避、其對(duì)眼部其他組織的生物毒性需要闡明。相比 之下，生化交聯(lián)(酶交聯(lián))成為一個(gè)比較理想的選擇。
[0011] 生化交聯(lián)是利用有活性的酶，催化特定的氨基酸底物，使得肽鏈的氨基酸之間產(chǎn) 生共價(jià)鍵，達(dá)到交聯(lián)的目的。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)就是一種優(yōu)秀的交聯(lián)酶。
[0012] 目前發(fā)現(xiàn)的TGase共包括8個(gè)亞型，其中多數(shù)類型在人體中廣泛存在，并參與重要 的生理功能。TGase的生物學(xué)功能是催化蛋白質(zhì)谷氨酸的酸殘基和賴氨酸的銨殘基之間發(fā) 生轉(zhuǎn)谷氨酰胺反應(yīng)，生成異肽鍵：ε-(γ_谷氨酰)_賴氨酸鍵（圖2)。該異肽鍵形成后異常穩(wěn) 定，可有效地增加組織對(duì)物理、化學(xué)的抵抗力，從而增加組織的力學(xué)強(qiáng)度。
[0013]該反應(yīng)具有專一性、高效性的特點(diǎn);酶催化反應(yīng)作為一種常見的生理現(xiàn)象，在局部 組織使用產(chǎn)生的組織損傷較小;使用酶催化反應(yīng)，其所需的設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)單，具有推廣 價(jià)值。
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[0016] 角膜基質(zhì)的主要組成部分，占角膜全厚的90%以上，是角膜力學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要 因素。其包括200-250層平行排列的纖維小板，主要成分為I型膠原纖維。I型膠原纖維是包 括兩條a I (I)肽鏈和一條a2 (I)肽鏈的螺旋結(jié)構(gòu)的大分子蛋白，其中a I (I)肽鏈的1464個(gè)氨 基酸中，包括賴氨酸57個(gè)(5.24% )，谷氨酸75個(gè)(6.94% )，α2(Ι)肽鏈的1366個(gè)氨基酸中，包 括賴氨酸50個(gè)(4.95% )，谷氨酸66個(gè)(6.58% )。故總體上看，角膜基質(zhì)具有5 %以上的賴氨 酸和谷氨酸，可以成為TGase催化反應(yīng)的底物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有治療圓錐角膜技術(shù)的不足，提供一種可以明顯加強(qiáng) 角膜力學(xué)性質(zhì)的生物制劑，尤其是一種含有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的生物制劑在加強(qiáng)角膜力學(xué)性質(zhì) 方面的應(yīng)用，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可以催化角膜基質(zhì)中的賴氨酸和谷氨酸的交聯(lián)反應(yīng)，使角膜可 以達(dá)到有效交聯(lián)，力學(xué)性質(zhì)得到明顯加強(qiáng)。
[0018] 本發(fā)明一方面提供一種用于加強(qiáng)角膜力學(xué)性質(zhì)的生物制劑，